Name: Preparación de Superficies de respuesta térmica nanoestructurados para la Ingeniería de Tejidos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 22 s
Description: Aprende a fabricar superficies nanoestructuradas termorresponsivas mediante el método Langmuir-Schaefer con copolímeros en bloque. Este protocolo permite controlar la adhesión y desprendimiento celular para ingeniería de tejidos.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este estudio fue financiado por el Proyecto de Creación de Centros de Innovación para el Programa de Investigación Interdisciplinaria Avanzada para el Desarrollo de Sistemas de Innovación "Centro de Ingeniería de Tejidos de Lámina Celular (CSTEC)" del Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología (MEXT), Japón.

1. Síntesis de poli bloque de poliestireno (N -isopropylacrylamide) por dos pasos reversible de transferencia de cadena por adición-fragmentación (RAFT) polimerización por radicales <ol><li> Disolver estireno (153,6 mmol), 4-ciano-4- (ethylsulfanylthiocarbonyl) ácido sulfanylpentanoic (ECT; 0,2 mmol), y 4,4&#39;-azobis (ácido 4-cianovalérico) (ACVA; 0,04 mmol) en 40 ml de 1, 4-dioxano. Congelar la solución en nitrógeno líquido al vacío durante 15-20 minutos para eliminar las especies reactivas y poco a poco se descongele a temperatura ambiente. Asegúrese de que la solución esté completamente descongelado y repetir este ciclo de desgasificación por congelación-descongelación de la bomba tres veces. </li><li> Obtener el poliestireno (PST) (Mw: 13.500) como agente de RAFT macro mediante polimerización a 70 ° C durante 15 horas en un baño de aceite. </li><li> Agente de macro BALSA precipitado PSt con 800 ml de éter y se seca al vacío. </li><li> Disolver monómero IPAAm (4,32 mmol), agente de RAFT macro PST (0,022 mmol), y ACVA (0,004 mmol) en 4 ml de 1,4-dioxano. </li><li> retirarel oxígeno en la solución por los ciclos de desgasificación por congelación bombeo-descongelación como se ha mencionado en el paso 1.1. </li><li> Realizar una polimerización a 70 ° C durante 15 horas en un baño de aceite después de la desgasificación. Obtener sintetizado molécula St-IPAAm (Mw: 32.800) en la misma manera que el agente de RAFT macro PST. </li></ol> 2. Preparación de sustratos de vidrio Silanized hidrófoba modificados <ol><li> sustratos de vidrio de lavado (24 mm x 50 mm) con un exceso de acetona y etanol y se somete a ultrasonidos durante 5 min para eliminar contaminantes de la superficie. </li><li> Secar los sustratos en un horno a 65 ° C durante 30 min. A continuación, utilice plasma de oxígeno (400 W, 3 min) para activar las superficies de los sustratos a temperatura ambiente. </li><li> Sumergir los sustratos en tolueno que contiene 1% hexiltrimetoxisilano durante la noche a RT a silanizar el sustrato. </li><li> Lavar los sustratos silanizados en tolueno y se sumerja en acetona durante 30 minutos para eliminar los agentes que no han reaccionado. </li><li> sustratos de recocido durante 2 horas a 110 ° C para inmovilizar a fondo los sTu cara. </li><li> Cortar los sustratos silanized por un cortador de vidrio de 25 mm x 24 mm para adaptarse a las placas de cultivo celular (tamaño del plato: φ35 mm). </li></ol> 3. Preparación de Langmuir Films y Cine-transferido Superficie <ol><li> Coloque el instrumento película de Langmuir en un armario para evitar la acumulación de polvo. </li><li> Lavar la artesa de Langmuir (tamaño: 580 mm x 145 mm) y las barreras con agua destilada y etanol para eliminar los contaminantes. </li><li> Secar la cubeta y las barreras frotando con una toalla sin pelusa. A continuación, llenar la cubeta con aproximadamente 110 ml de agua destilada, y establecer las barreras a ambos lados de la artesa. Tenga en cuenta que el agua destilada se debe añadir sin derramar en los siguientes pasos 3,5-3,13. </li><li> Calentar una placa de Wilhelmy de platino (perímetro: 39.24 mm) para el control de la tensión superficial con un quemador de gas hasta que la placa se vuelve rojo y luego lavar con agua destilada para eliminar los contaminantes. Suspender la placa de Wilhelmy en un cable conectado ael instrumento superficie de presión-medición. </li><li> Poner a cero el instrumento superficie de presión de medición de acuerdo con el protocolo del fabricante. Comprimir la interfase aire-agua en la cubeta por las barreras en ambos lados de la cubeta hasta que la interfaz alcanza aproximadamente 50 cm 2 sin ningún tipo de gotas de polímero. </li><li> Aspirar los contaminantes pequeños hasta que la presión en la superficie es casi 0 mN / m. </li><li> Volver a colocar las barreras en ambos lados, y añadir agua destilada para compensar la disminución de agua destilada desde el paso 3.6. </li><li> Disolver 5 mg de la molécula de St-IPAAm sintetizado en 5 ml de una solución de desarrollo de cloroformo. Nota: diclorometano o tolueno también se puede utilizar como disolvente. </li><li> deje caer suavemente 27 l de St-IPAAm disueltos en cloroformo en la cubeta usando una microjeringa o micropipeta. </li><li> Después de esperar 5 min para permitir la evaporación completa de cloroformo, mover ambas barreras horizontalmente para comprimir el molecu St-IPAAmLe en la interfase. Mantener la tasa de compresión de las barreras a 0.5 mm / seg hasta que el área objetivo de 50 cm 2 se alcanza. Nota: Una tasa de compresión rápida provoca defectos en la película de Langmuir. </li><li> Medir la presión superficial (π) -A m isotermas con la placa de Wilhelmy de platino unida a la superficie de presión del instrumento de medición de durante la compresión de acuerdo con el protocolo del fabricante. </li><li> Después de alcanzar el tamaño del área objetivo, mantener la superficie durante 5 min para permitir que las moléculas de St-IPAAM se relajen; las moléculas no alcanzan el equilibrio inmediatamente después de la compresión. </li><li> La transferencia de la película de Langmuir a un sustrato de vidrio modificado hidrófobamente usando un aparato de transferencia durante 5 min para adsorber fuertemente la película. Fijar el sustrato de vidrio hidrófobo en paralelo en el dispositivo. Conectar el dispositivo a una etapa de alineación y se mueven perpendicularmente. </li><li> Levante el sustrato horizontalmente con el aparato de transferencia y seco durante 1 día en un desiccator. </li></ol> 4. Optimización de cultivo de células y la adhesión celular y Desprendimiento en la Superficie de Langmuir película transferida <ol><li> Para preparar las suspensiones de células, células endoteliales cultura bovina de la arteria carótida (BAECs) para tercera confluencia a 37 ° C en 5% de CO2 y 95% de aire en el cultivo de tejidos de poliestireno (TCPS) con de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) que contiene 10% fetal de suero bovino (FBS) y 100 U / ml de penicilina. </li><li> Después de alcanzar la confluencia, el tratamiento de BAECs con 3 ml de 0,25% de tripsina-EDTA durante 3 min a 37 ° C en 5% de CO2 y 95% de aire. </li><li> Desactive la tripsina-EDTA mediante la adición de 10 ml de DMEM que contenía el 10% de FBS, y recoger la suspensión de células a un tubo cónico de 50 ml. </li><li> Centrifugar a 120 xg durante 5 min, y aspirar el sobrenadante. Vuelva a suspender las células con 10 ml de DMEM. </li><li> Coloque las superficies St-Ipaam bajo luz ultravioleta sobre un banco limpio para esterilizar durante 5 min. </li><li> Sembrar el ce recuperadoLLS en el St-IPAAm superficies a una concentración de 1,0 x 10 4 células / cm 2 contados por un hemocitómetro desechable y observar las células en las superficies por un microscopio equipado con una incubadora a 37 ° C con 5% de CO2 y 95% aire. Nota: Esterilizar las superficies St-Ipaam por la luz ultravioleta equipado con una mesa de trabajo limpia. </li><li> Registra imágenes con lapso de tiempo de BAECs adherentes de aproximadamente 24,5 horas a 37 ° C mediante un microscopio de contraste de fases con un aumento de 10X. Después de BAEC adhesión, ficha desprendimiento de las BAECs de la superficie St-IPAAm a 20 ° C durante aproximadamente 3,5 hr. </li></ol> 5. Hoja de la célula de fabricación en las superficies transferidas con película de Langmuir <ol><li> BAECs de cultivo utilizados en la misma forma descrita en la Sección 4. </li><li> Sembrar un total de 1,0 x 10 5 células / cm 2 en superficies St-IPAAM y se incuba durante 3 días a 37 ° C en 5% de CO 2. Confluentes BAECs separa espontáneamente a 20 ° C.</li>
</ol>

<ol><li>Bae, Y. H., Kwon, I. C., Pai, C. M., Kim, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+release+of+macromolecules+from+electrical+and+chemical+stimuli-responsive+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Makromol.+Chem.%2C+Macromol.+Symp%22%5BJournal%5D)">Controlled release of macromolecules from electrical and chemical stimuli-responsive hydrogels.</a> Makromol. Chem., Macromol. Symp. 70-71 (1), 173-181 (1993).</li>
<li>Fu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+control+of+free+energy+and+topography+of+nanostructured+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Reversible control of free energy and topography of nanostructured surfaces.</a> J. Am. Chem. Soc. 126 (29), 8904-8905 (2004).</li>
<li>Nykanen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+behavior+and+temperature-responsive+molecular+filters+based+on+self-assembly+of+polystyrene-block-poly%28N-isopropylacrylamide%29-block-polystyrene%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Phase behavior and temperature-responsive molecular filters based on self-assembly of polystyrene-block-poly(N-isopropylacrylamide)-block-polystyrene.</a> Macromolecules. 40 (16), 5827-5834 (2007).</li>
<li>Sun, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+switching+between+superhydrophilicity+and+superhydrophobicity%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed.+Engl%22%5BJournal%5D)">Reversible switching between superhydrophilicity and superhydrophobicity.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 43 (3), 357-360 (2004).</li>
<li>Shuler, R. L., Zisman, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Study+of+the+behavior+of+Polyoxyethylene+at+the+air-water+interface+by+wave+damping+and+other+methods%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem%22%5BJournal%5D)">A Study of the behavior of Polyoxyethylene at the air-water interface by wave damping and other methods.</a> J. Phys. Chem. 74 (7), 1523-1534 (1970).</li>
<li>Kawaguchi, M., Sauer, B. B., Yu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymeric+monolayer+dynamics+at+the+air%2Fwater+interface+by+surface+light+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Polymeric monolayer dynamics at the air/water interface by surface light scattering.</a> Macromolecules. 22 (4), 1735-1743 (1989).</li>
<li>Saito, W., Kawaguchi, M., Kato, T., Imae, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spreading+solvent+and+temperature+effects+on+interfacial+properties+of+Poly+%28N-isopropylacrylamide%29+films+at+the+air-water+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Spreading solvent and temperature effects on interfacial properties of Poly (N-isopropylacrylamide) films at the air-water interface.</a> Langmuir. 7463 (11), 5947-5950 (1996).</li>
<li>Jheng, K. T., Hsu, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+weight+effect+of+PMMA+on+its+miscibility+with+PS-b-PEO+at+the+air%2Fwater+interface%5BTitle%5D)+AND+%22J.+App.+Polym.+Sci%22%5BJournal%5D)">Molecular weight effect of PMMA on its miscibility with PS-b-PEO at the air/water interface.</a> J. App. Polym. Sci. 125 (3), 1986-1992 (2012).</li>
<li>Biesalski, M. A., Knaebel, A., Tu, R., Tirrell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+adhesion+on+a+polymerized+peptide-amphiphile+monolayer%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Cell adhesion on a polymerized peptide-amphiphile monolayer.</a> Biomaterials. 27 (8), 1259-1269 (2006).</li>
<li>Da Silva, A. M. P. S. G., Lopes, S. I. C., Brogueira, P., Prazeres, T. J. V., Beija, M., Martinho, J. M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermo-responsiveness+of+poly%28N%2CN-diethylacrylamide%29+polymers+at+the+air-water+interface%3A+The+effect+of+a+hydrophobic+block%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+colloid+interface+sci%22%5BJournal%5D)">Thermo-responsiveness of poly(N,N-diethylacrylamide) polymers at the air-water interface: The effect of a hydrophobic block.</a> Journal of colloid interface sci. 327 (1), 129-137 (2008).</li>
<li>Wang, S. Q., Zhu, Y. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facile+method+to+prepare+smooth+and+homogeneous+polymer+brush+surfaces+of+varied+brush+thickness+and+grafting+density%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Facile method to prepare smooth and homogeneous polymer brush surfaces of varied brush thickness and grafting density.</a> Langmuir. 25 (23), 13448-13455 (2009).</li>
<li>Estillore, N. C., Park, J. Y., Advincula, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Langmuir%E2%88%92Schaefer+%28LS%29+macroinitiator+film+control+on+the+grafting+of+a+thermosensitive+polymer+brush+via+surface+initiated-ATRP%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Langmuir−Schaefer (LS) macroinitiator film control on the grafting of a thermosensitive polymer brush via surface initiated-ATRP.</a> Macromolecules. 43 (16), 6588-6598 (2010).</li>
<li>Seo, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanowire+and+mesh+conformations+of+diblock+copolymer+blends+at+the+air%2Fwater+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Nanowire and mesh conformations of diblock copolymer blends at the air/water interface.</a> Nano Lett. 4 (3), 483-486 (2004).</li>
<li>Lu, Q., Bazuin, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solvent-assisted+formation+of+nanostrand+networks+from+supramolecular+diblock+copolymer%2Fsurfactant+complexes+at+the+air%2Fwater+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+lett%22%5BJournal%5D)">Solvent-assisted formation of nanostrand networks from supramolecular diblock copolymer/surfactant complexes at the air/water interface.</a> Nano lett. 5 (7), 1309-1314 (2005).</li>
<li>Nagano, S., Matsushita, Y., Ohnuma, Y., Shinma, S., Seki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+a+highly+ordered+dot+array+of+surface+micelles+of+a+block+copolymer+via+liquid+crystal-hybridized+self-assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Formation of a highly ordered dot array of surface micelles of a block copolymer via liquid crystal-hybridized self-assembly.</a> Langmuir. 22 (12), 5233-5236 (2006).</li>
<li>Perepichka, I. I., Borozenko, K., Badia, A., Bazuin, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pressure-induced+order+transition+in+nanodot-forming+diblock%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Pressure-induced order transition in nanodot-forming diblock.</a> J. Am. Chem. Soc. 133 (493), 19702-19705 (2011).</li>
<li>Wang, X. L., Ma, X. Y., Zang, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aggregation+behavior+of+polystyrene-b-poly%28acrylicacid%29+at+the+air-water+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Aggregation behavior of polystyrene-b-poly(acrylicacid) at the air-water interface.</a> Soft Matter. 9 (2), 443-453 (2013).</li>
<li>Yamato, M., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+sheet+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Mater.+Today%22%5BJournal%5D)">Cell sheet engineering.</a> Mater. Today. 7 (5), 42-47 (2004).</li>
<li>Rollason, G., Daviest, J. E., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preliminary+report+on+cell+culture+on+a+thermally+reversible+copolymer%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Preliminary report on cell culture on a thermally reversible copolymer.</a> Biomaterials. 14 (2), 153-155 (1993).</li>
<li>Park, Y. S., Ito, Y., Imanishi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeation+control+through+porous+membranes+immobilized+with+thermosensitive+polymer%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Permeation control through porous membranes immobilized with thermosensitive polymer.</a> Langmuir. 14 (4), 910-914 (1998).</li>
<li>Kwon, O. H., Kikuchi, A., Yamato, M., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+cell+sheet+recovery+by+co-grafting+of+PEG+with+PIPAAm+onto+porous+cell+culture+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Accelerated cell sheet recovery by co-grafting of PEG with PIPAAm onto porous cell culture membranes.</a> Biomaterials. 24 (7), 1223-1232 (2003).</li>
<li>Kikuchi, A., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanostructured+designs+of+biomedical+materials%3A+applications+of+cell+sheet+engineering+to+functional+regenerative+tissues+and+organs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control.+Release%22%5BJournal%5D)">Nanostructured designs of biomedical materials: applications of cell sheet engineering to functional regenerative tissues and organs.</a> J. Control. Release. 101 (1-3), 69-84 (2005).</li>
<li>Fukumori, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+ultra-thin+temperature-responsive+polymer+layer+and+its+polymer+thickness+dependency+on+cell+attachment%2Fdetachment+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Macromol.+biosci%22%5BJournal%5D)">Characterization of ultra-thin temperature-responsive polymer layer and its polymer thickness dependency on cell attachment/detachment properties.</a> Macromol. biosci. 10 (10), 1117-1129 (2010).</li>
<li>Takahashi, H., Nakayama, M., Yamato, M., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+chain+length+and+graft+density+of+thermoresponsive+polymer+brushes+for+optimizing+cell+sheet+harvest%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Controlled chain length and graft density of thermoresponsive polymer brushes for optimizing cell sheet harvest.</a> Biomacromolecules. 11 (8), 1991-1999 (2010).</li>
<li>Nakayama, M., Yamada, N., Kumashiro, Y., Kanazawa, H., Yamato, M., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermoresponsive+poly%28N-isopropylacrylamide%29-based+block+copolymer+coating+for+optimizing+cell+sheet+fabrication%5BTitle%5D)+AND+%22Macromol.+Biosci%22%5BJournal%5D)">Thermoresponsive poly(N-isopropylacrylamide)-based block copolymer coating for optimizing cell sheet fabrication.</a> Macromol. Biosci. 12 (6), 751-760 (2012).</li>
<li>Sakuma, M., et al. Control of cell adhesion and detachment on Langmuir-Schaefer surface composed of dodecyl-terminated thermo-responsive polymers. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSakuma%2C+M+%22J.+Biomater.+Sci.%2C+Polym.+Ed%22">J. Biomater. Sci., Polym. Ed</a>. 25 (5), 431-443 (2014).</li>
<li>Sakuma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermoresponsive+nanostructured+surfaces+generated+by+the+Langmuir-Schaefer+method+are+suitable+for+cell+sheet+fabrication%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Thermoresponsive nanostructured surfaces generated by the Langmuir-Schaefer method are suitable for cell sheet fabrication.</a> Biomacromolecules. 15 (11), 4160-4167 (2014).</li>
<li>Moad, G., Chong, Y. K., Postma, A., Rizzardo, E., Thang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+RAFT+polymerization%3A+the+synthesis+of+polymers+with+defined+end-groups%5BTitle%5D)+AND+%22Polymer%22%5BJournal%5D)">Advances in RAFT polymerization: the synthesis of polymers with defined end-groups.</a> Polymer. 46 (19), 8458-8468 (2005).</li>
<li>Nishida, K., et al. Corneal Reconstruction with Tissue-Engineered Cell Sheets Composed of Autologous Oral Mucosal Epithelium. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNishida%2C+K+%22N.+Engl.+J.+Med%22">N. Engl. J. Med</a>. 351 (12), 1187-1196 (2004).</li>
<li>Ohki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+of+esophageal+stricture+after+endoscopic+submucosal+dissection+using+tissue-engineered+cell+sheets%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Prevention of esophageal stricture after endoscopic submucosal dissection using tissue-engineered cell sheets.</a> Gastroenterology. 143 (3), 582-588 (2012).</li>
<li>Sawa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineered+myoblast+sheets+improved+cardiac+function+sufficiently+to+discontinue+LVAS+in+a+patient+with+DCM%3A+report+of+a+case%5BTitle%5D)+AND+%22Surg.+Today%22%5BJournal%5D)">Tissue engineered myoblast sheets improved cardiac function sufficiently to discontinue LVAS in a patient with DCM: report of a case.</a> Surg. Today. 42 (2), 181-184 (2012).</li>
</ol>

Todos los autores contribuyeron por igual a la redacción del manuscrito y aprobaron la versión final. Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Una superficie sensible a la temperatura fue fabricado por el método de Langmuir-Schaefer, y las propiedades de la superficie para la recuperación de la adhesión celular / desprendimiento y lámina de células se optimizaron. Cuando se utiliza este método para la fabricación de superficies, varios pasos son críticos. La composición molecular de las moléculas de St-IPAAM tiene un gran efecto sobre la estructura de la superficie y la estabilidad de la superficie, y por extensión, sobre la adhesión celular y desprendimiento....

superficies nanoestructuradas recientemente han atraído considerable atención debido a sus diversas aplicaciones potenciales, incluyendo patrones, cultivo celular, limpieza y cambio de superficie. Por ejemplo, las superficies superhydrophobic inspirados en la nanoestructura de la hoja de loto y otras superficies sensibles son capaces de reaccionar a los estímulos externos 1-4. La película de Langmuir es uno de los recubrimientos de polímeros más ampliamente estudiados. Una película de Langmuir está formada por moléculas anfifílicas caer en una interfaz aire-agua 5-8. La película puede ser entonces transferida a una superficie sólida por adsorción física o química, y la conformación molecular sobre una superficie sólida se puede controlar utilizando métodos de transferencia vertical y horizontal 9-12. La densidad de la película de Langmuir se puede regular con precisión mediante la compresión de la interfaz aire-agua. Recientemente, este método también ha demostrado ser eficaz para la fabricación nanométrica structur mar-islaes mediante la utilización de copolímeros de bloques anfifílicos. Las nanoestructuras se supone que consisten en un núcleo de segmentos hidrófobos y una cubierta de segmentos hidrófilos 13-17. Además, el número de nanoestructuras sobre una superficie se regula controlando el área por molécula (A m) del copolímero de bloque en la interfase. Nos hemos centrado en un original, el enfoque de la ingeniería de tejidos sin andamios únicos, ingeniería lámina celular, utilizando una superficie de cultivo sensible a la temperatura. La tecnología desarrollada se ha aplicado a terapias regenerativas para diversos órganos 18. Una superficie de cultivo sensible a la temperatura fue fabricado por injerto de poli (N -isopropylacrylamide) (PIPAAm), una molécula sensible a la temperatura, sobre una superficie de 19 a 27. PIPAAm y sus copolímeros presentan una temperatura de solución crítica inferior (LCST) en medio acuoso a temperaturas cerca de 32 ° C. La superficie de cultivo también exhibió una alternati sensible a la temperatura<html> en entre hidrofobicidad e hidrofilicidad. A 37 ° C, la superficie injertada con PIPAAm se convirtió hidrófobo, y las células fácilmente conectado y proliferaron en la superficie, así como en poliestireno de cultivo tisular convencional. Cuando la temperatura se bajó a 20 ° C, la superficie se hizo hidrófila, y células separadas espontáneamente de la superficie. Por lo tanto, las células confluentes cultivadas en la superficie podrían ser cosechadas como una hoja intacta cambiando la temperatura. Estas propiedades de adhesión celular y la separación también se muestran por una superficie fabricada por recubrimiento de película de Langmuir para la demostración de laboratorio 26, 27. Se fabricó una película de Langmuir de copolímeros de bloque compuestos de poliestireno (P (St)) y PIPAAm (St-IPAAm). La película de Langmuir con una A específica m podría ser transferido horizontalmente a un sustrato de vidrio hidrofóbicamente modificado. Además, se evaluó la adhesión celular encendido y el desprendimiento de la superficie preparada en respuesta a la temperatura. _content &quot;&gt; A continuación, describimos los protocolos para la fabricación de una película de Langmuir nanoestructurado compuesto por copolímeros de bloques anfifílicos termo-sensible en un sustrato de vidrio. Nuestro método puede proporcionar una técnica de fabricación eficaz para nanopelículas orgánicos en diversos campos de la ciencia de superficies y puede facilitar más el control efectivo de la adhesión celular en y el desprendimiento espontáneo de una superficie.

<table><tbody><tr><td>N-isopropilacrilamida</td><td>Kohjin</td><td></td><td>Sin número de catálogo</td></tr><tr><td>Azobis(ácido 4-cianovalérico)</td><td>Wako Pure Chemicals</td><td>016-19332</td><td></td></tr><tr><td>Estireno</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4972</td><td></td></tr><tr><td>1,3,5-trioxano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T81108</td><td></td></tr><tr><td>1,4-dioxano</td><td>Wako Pure Chemicals</td><td>045-24491</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>D6429</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Nakarai</td><td>11482-15</td><td></td></tr><tr><td>Estreptomicina</td><td>GIBCO BRL</td><td>15140-163</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina</td><td>GIBCO BRL</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Sigma</td><td>T4174</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Japón Biosuero</td><td>JBS-11501</td><td></td></tr><tr><td>BAECs</td><td>Banco de Recursos de Investigación en Ciencias de la Salud JCRB0099</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos</td><td>Matsunami Industria del vidrio</td><td>C024501</td><td></td></tr><tr><td>AFM NanoScope V</td><td>Veeco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1H NMR INOVA 400</td><td>Varian, Palo Alto</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ATR/FT-IR NICOLET 6700</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GPC HLC-8320GPC</td><td>Tosoh</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TSKgel Super AW2500, AW3000, AW4000</td><td>Tosoh</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Langmuir-Blodgett Comederos de deposición&nbsp;</td><td>KSV Instruments</td><td>KN 2002</td><td>KSV NIWA Midium a través</td></tr><tr><td>de Nikon ECLIPSE TE2000-U</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

preparación de superficies de respuesta térmica nanoestructurados para la ingeniería de tejidos

Preparation of Thermoresponsive Nanostructured Surfaces for Tissue Engineering

Las superficies inmovilizadas de poli(N-isopropilacrilamida) (PIPAAm) para controlar la adhesión y el desprendimiento celular se fabricaron mediante el método de Langmuir-Schaefer. Los copolímeros de bloque anfifílicos compuestos por poliestireno y PIPAAm (St-IPAAms) se sintetizaron mediante polimerización radical reversible por transferencia de cadena de adición-fragmentación (RAFT). Una solución de cloroformo de moléculas de St-IPAAm se dejó caer suavemente en un aparato de canal de Langmuir, y ambas barreras del aparato se movieron horizontalmente para comprimir la película y regular su densidad. A continuación, la película St-IPAAm Langmuir se transfirió horizontalmente a un sustrato de vidrio modificado hidrofóbicamente mediante un dispositivo de fijación de superficie. Las imágenes de microscopía de fuerza atómica revelaron claramente estructuras de islas marinas a nanoescala en la superficie. La fuerza, la velocidad y la calidad de la adhesión y el desprendimiento celular en la superficie preparada se modularon mediante cambios de temperatura en el rango de temperatura de la solución crítica más baja de las moléculas de PIPAAm. Además, se recuperó con éxito una estructura celular bidimensional (lámina de celda) en las superficies optimizadas. Estas superficies únicas de PIPAAm pueden ser útiles para controlar la fuerza de adhesión y desprendimiento de las células.

Los copolímeros de bloques compuestos de poliestireno y poli (N -isopropylacrylamide) (St-IPAAms) con pesos moleculares específicos se sintetizaron por polimerización por radicales balsa. ECT se preparó como un agente de transferencia de cadena como se describe en Moad et al. 28. Dos moléculas St-IPAAm de diferentes longitudes de cadena PIPAAm se sintetizaron, y los polímeros de bloques obtenidos se caracterizan por 1 H resonancia magnética nuclear...

Se fabricaron superficies de islas marinas a nanoescala compuestas por copolímeros de bloque termosensibles mediante el método de Langmuir-Schaefer para controlar la adhesión y el desprendimiento espontáneo de células. Se visualizó tanto la preparación de la superficie como la adhesión y desprendimiento de células en la superficie.

Preparación de Superficies de respuesta térmica nanoestructurados para la Ingeniería de Tejidos

Thermoresponsive poly(N-isopropylacrylamide) (PIPAAm)-immobilized surfaces for controlling cell adhesion and detachment were fabricated by the ...

El objetivo general de este método Langmuir-Schaefer con copolímeros en bloque es fabricar láminas celulares en diversas condiciones de la superficie sensible a la temperatura, controlando la intensidad de la adhesión y los anclajes celulares. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de los biomateriales, como los materiales biocompatibles, la superficie para cultivo celular y la bioseparación. La principal ventaja de esta técnica es que se puede controlar la interacción entre la superficie sensible a la temperatura y las células, y se pueden optimizar las condiciones de modificación para la recuperación de las láminas celulares.Aunque este método puede proporcionar información sobre la interacción entre la célula y la superficie, también puede aplicarse a otros sistemas, como la bioseparación y las biopelículas. Para comenzar, disuelva el estireno, ECT y ACVA en 40 mililitros de 1,4-Dioxano. Congele la solución en nitrógeno líquido bajo vacío durante 15 a 20 minutos para eliminar las especies reactivas.Después de descongelar gradualmente la solución a temperatura ambiente, repita este ciclo de congelación, bombeo, descongelación y desgasificación tres veces. Obtenga el agente macro-RAFT de poliestireno mediante polimerización a 70 grados Celsius durante 15 horas en un baño de aceite. Precipite el agente macro-RAFT de poliestireno con 800 mililitros de éter y seque al vacío.A continuación, disuelva el monómero IPAAm, el agente macro-RAFT de poliestireno y el ACVA en cuatro mililitros de 1,4-Dioxano. Elimine el oxígeno de la solución utilizando ciclos de desgasificación por congelación, bombeo y descongelación como antes. Realice una polimerización a 70 grados Celsius durante 15 horas en un baño de aceite después de la desgasificación.Finalmente, obtenga la molécula de St-IPAAm sintetizada de la misma manera que el agente macro-RAFT de poliestireno. Lave los sustratos de vidrio con un exceso de acetona y etanol, y sométalos a sonicación durante cinco minutos para eliminar contaminantes superficiales. Seque los sustratos en una estufa a 65 grados Celsius durante 30 minutos.Luego, utilice plasma de oxígeno para activar las superficies de los sustratos a temperatura ambiente. Sumerja los sustratos en tolueno que contenga 1% de hexatrimetoxisilano durante la noche a temperatura ambiente para silanizar el sustrato. A continuación, lave los sustratos silanizados en tolueno y sumérjalos en acetona durante 30 minutos para eliminar los agentes no reaccionados.Incube los sustratos durante dos horas a 110 grados Celsius para inmovilizar completamente la superficie. Finalmente, corte los sustratos silanizados con un cortador de vidrio a dimensiones de 25 milímetros por 24 milímetros para que encajen en las placas de cultivo celular. Coloque el instrumento para películas de Langmuir en un gabinete para evitar la acumulación de polvo.Lave la cubeta de Langmuir junto con las barreras con agua destilada y etanol para eliminar los contaminantes. Seque la cubeta y las barreras pasando una toalla sin pelusa. A continuación, llene la cubeta con aproximadamente 110 mililitros de agua destilada y coloque las barreras en ambos lados de la cubeta.A continuación, caliente una placa de platino Wilhelmy para monitorear la tensión superficial con un quemador de gas hasta que la placa se vuelva roja. Luego lave la placa con agua destilada para eliminar los contaminantes. Suspenda la placa Wilhelmy en un alambre unido al instrumento de medición de presión superficial.Calibre el instrumento de medición de presión superficial según el protocolo del fabricante. Comprima la interfase aire-agua en la cubeta mediante las barreras en ambos lados de la cubeta hasta que la interfase alcance aproximadamente 50 centímetros cuadrados sin ninguna gota de polímero. Aspire cualquier contaminante pequeño hasta que la presión superficial sea casi cero milinewtons por metro.Reposicione las barreras en ambos lados y agregue agua destilada para compensar la disminución de agua destilada. A continuación, disuelva cinco miligramos de la molécula de St-IPAAm sintetizada en cinco mililitros de una solución de desarrollo de cloroformo. Luego, agregue suavemente 27 microlitros de St-IPAAm disuelto en cloroformo sobre la cubeta utilizando una microjeringa o micropipeta.Después de esperar cinco minutos para permitir la evaporación completa del cloroformo, mueva ambos barreras horizontalmente para comprimir la molécula de St-IPAAm en la superficie. Mantenga la velocidad de compresión de las barreras en 0,5 milímetros por segundo hasta alcanzar el área objetivo de 50 centímetros cuadrados. Mida las isotermas de presión superficial Pi-A con la placa de Wilhelmy de platino conectada al instrumento de medición de presión superficial durante la compresión, según el protocolo del fabricante.Después de alcanzar el tamaño del área objetivo, mantenga la superficie durante cinco minutos para permitir que las moléculas de St-IPAAm se relajen. Las moléculas no alcanzan el equilibrio inmediatamente después de la compresión. Luego, transfiera la película de Langmuir a un sustrato de vidrio modificado hidrofóbicamente utilizando un aparato de transferencia durante cinco minutos para absorber firmemente la película.Fije el sustrato de vidrio hidrofóbico en paralelo sobre el dispositivo. Conecte el dispositivo a una etapa de alineación y muévalo perpendicularmente. Eleve el sustrato horizontalmente con el aparato de transferencia y séquelo durante un día en un desecador.Para preparar suspensiones celulares, cultive células endoteliales de la arteria carótida bovina, o BAECs, hasta alcanzar una confluencia de 1/3 a 37 grados Celsius en 5%CO2 y 95%aire, sobre poliestireno para cultivo celular con DMEM, que contenga FBS y penicilina. Una vez alcanzada la confluencia, trate las BAECs con tres mililitros de tripsina-EDTA al 0,25% durante tres minutos a 37 grados Celsius en 5%CO2 y 95%aire. Desactive la tripsina-EDTA añadiendo 10 mililitros de DMEM que contenga 10%FBS.Y recoger la suspensión celular en un tubo cónico de 50 mililitros. Después de centrifugar a 120 ×g durante cinco minutos, aspirar el sobrenadante y resuspender las células en 10 mililitros de DMEM. Sembrar las células recuperadas sobre las superficies de St-IPAAm a una concentración de 10.000 células por centímetro cuadrado, contadas mediante un hemocitómetro desechable.Observe las células sobre las superficies mediante un microscopio equipado con un incubador a 37 grados Celsius con 5% CO₂ y 95% aire. A continuación, esterilice las superficies de St-IPAAm mediante luz ultravioleta en una cabina de flujo laminar. Registre imágenes de lapso de tiempo de las BAEC adheridas durante aproximadamente 24,5 horas a 37 grados Celsius mediante un microscopio de contraste de fases con aumento de 10x.Después de la adhesión de BAEC, registre la desprendimiento de las BAECs de la superficie de St-IPAAm a 20 grados Celsius durante aproximadamente 3,5 horas. Tras optimizar la adhesión y el desprendimiento celular en la superficie transferida mediante película de Langmuir, fabrique las láminas celulares cultivando primero las BAECs como antes. Siembre un total de 100.000 células por centímetro cuadrado en superficies de St-IPAAm.Y incubar durante tres días a 37 grados Celsius en 5% CO₂. Las BAEC confluentes se desprendieron espontáneamente a 20 grados Celsius. A continuación se muestra la preparación de una superficie transferida de película de Langmuir sensible a la temperatura.Se dejó caer suavemente la solución de St-IPAAm en cloroformo sobre una interfase aire-agua. Se utilizaron dos barreras para comprimir las moléculas de St-IPAAm en la interfase hasta alcanzar un área objetivo de 50 centímetros cuadrados. La presión superficial se midió durante la compresión para detectar cualquier defecto en la película de Langmuir.Después de la compresión, un sustrato de cubreobjetos modificado hidrofóbicamente se colocó horizontalmente sobre la interfaz mediante una etapa de alineación. El sustrato se levantó horizontalmente y se secó durante un día. Tras este paso, las superficies de St-IPAAm estaban listas para su uso en experimentos de cultivo celular.Se muestran aquí resultados representativos de imágenes topográficas de microscopía de fuerza atómica de superficies de St-IPAAm. Se observaron nanoestructuras en ambas superficies de St-IPAAm. El tamaño y la forma de las nanoestructuras dependían fuertemente de AM y de la composición de St-IPAAm.Aquí se muestra una imagen macroscópica de una lámina celular recuperada sobre una superficie transferida de película de Langmuir con St-IPAAm 480 y una AM de 40 nanómetros cuadrados por molécula. Las células alcanzaron confluencia tras tres días de cultivo sobre superficies de St-IPAAm 170 y St-IPAAm 480 a 37 grados Celsius. Y la lámina celular se recuperó rápidamente tras reducir la temperatura de 37 a 20 grados Celsius.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo fabricar y diseñar la composición molecular del polímero, fabricar y transferir películas de Langmuir, controlar la adhesión y desprendimiento celular, y recuperar láminas celulares. Tras su desarrollo, esta técnica allana el camino para que los investigadores en el campo de los biomateriales y la ingeniería de tejidos exploren las interacciones entre células y superficies, así como estrategias de cultivo celular para su uso en medicina regenerativa. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia mediante trasplante celular, ya que posee el potencial de fabricar láminas celulares de diversos tipos celulares provenientes de pacientes.

preparation-thermoresponsive-nanostructured-surfaces-for-tissue

Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

En este protocolo, demostramos la fabricación de sustratos biomiméticos de cultivo de células cardíacas hechos de dos materiales poliméricos distintos utilizando litografía de fuerza capilar.  Los métodos descritos proporcionan una técnica escalable y rentable para diseñar la estructura y función de los tejidos cardíacos macroscópicos para aplicaciones in vitro e in vivo.

Capilar Fuerza Litografía Cardiaca de Ingeniería de Tejidos

Para la creación de estructuras altamente organizadas de tejido complejo, se deben ensamblar múltiples tipos de materiales y células en un compuesto integrado.  Este diseño combinatorio incorpora láminas de células estratificadas específicas de órganos con dos materiales distintos derivados de la biología que contienen una fuerte base de matriz fibrosa y células endoteliales para mejorar la formación de nuevos vasos.

Ingeniería de tejidos: Construcción de un multicelular 3D Andamios para la entrega de láminas de células en capas

Un método para obtener nanofibras y nanoestructuras complejas de proteínas de la matriz extracelular individuales o múltiples se describe. Este método utiliza las interacciones proteína-superficie para la creación de materiales a base de proteínas exentas con la composición sintonizable y la arquitectura para el uso en una variedad de aplicaciones de ingeniería de tejidos y de biotecnología.

Las nanofibras ECM proteínas y Uso Asamblea Superficie iniciadas Nanoestructuras Engineered

Se presenta una técnica para la fabricación de membranas microbolsas dentro electrohiladas en el que estudiar el comportamiento celular. Específicamente, se describe una combinación de microstereolithography y electrospinning para la producción de PLGA (poli (lactida-co-glicólido)) dispositivos de biomateriales corneales equipados con microfeatures.

Combinación de Microstereolithography y electrospinning para Fabricación de membranas Equipado con nichos para la regeneración de la córnea

Los sustratos de cultivo celular funcionalizados con patrones a microescala de ligandos biológicos tienen una inmensa utilidad en el campo de la ingeniería de tejidos. Aquí, demostramos la fabricación versátil y automatizada de sustratos de cultivo de tejidos con múltiples cepillos de poli(etilenglicol) micromodelados que presentan químicas ortogonales que permiten la inmovilización espacialmente precisa y específica del sitio de ligandos biológicos.

La fabricación de sustratos de cultivo complejas utilizando robótica microcontacto impresión (R-μCP) y secuencial sustitución nucleófila

Un andamio de la ingeniería de tejidos inyectable compuesto de poli (N-isopropilacrilamida) sulfato de condroitina-injertado (PNIPAAm-g-CS) que contienen micropartículas de alginato se preparó. La fuerza adhesiva, propiedades de hinchamiento y en la biocompatibilidad in vitro se analizaron en este estudio. Las técnicas de caracterización desarrolladas aquí pueden ser aplicables a otros sistemas de termogelificación.

Síntesis de termogelificante poli (N-isopropilacrilamida) compuestos de sulfato de condroitina-injertado con alginato micropartículas de Ingeniería de Tejidos

Se describen los protocolos para la fabricación de hidrogeles degradables interpenetrantes basados en hidrazona Cross-linking de oligómeros poliméricos en la escala de a granel microescala, nanoescala y el último para la preparación de nanopartículas de gel y nanofibras.

Fabricación de hidrogeles degradables de interpenetrantes en múltiples escalas de la longitud mediante extrusión reactiva, microfluídica, uno mismo-Asamblea y Electrospinning

Este protocolo describe una metodología de bioimpresión que utiliza un sistema de depósito robótico automatizado que incorpora señales de guía topográficas grabadas con la deposición de precisión de una célula que contiene biotinta de hidrogel. Las células impresas se entregan directamente a las características grabadas y son capaces de detectar y orientarse con ellas.

Técnica robótica automatizada de dispensación de Orientación de la superficie de las células y Bioprinting

Un método para obtener nanopatrones desigual basado en el dendrímero que permiten el control de escala nanométrica de local arginina-glicina-aspártico (RGD) superficie densidad del ácido es descrito y aplicado para el estudio de la diferenciación celular de adherencia y condrogénica.

Basado en el dendrímero nanopatrones desigual para adherencia de superficie de Control local: un método para dirigir la diferenciación condrogénica

Presentado es un método sencillo para fabricar nano-micro estructuras multiescala, para superficies funcionales, agregando nanofibras fabricado utilizando un filtro de óxido de aluminio anódico.

Multiescala estructuras agregadas por nanofibras impreso para superficies funcionales

El objetivo de este protocolo es mostrar el montaje de una nanomatrix biomimética (NM) con nanotubos base Janus (JBNT) y fibronectina (FN). Cuando se co-cultivan con células madre mesenquimales humanas (hMSCs), los NMs exhiben una excelente bioactividad en el fomento de la adhesión a los hMSCs.

Fabricación de una nano-matriz biomimética con nanotubos base Janus y fibronectina para adherencia a células madre

Aprende a fabricar superficies nanoestructuradas termorresponsivas mediante el método Langmuir-Schaefer con copolímeros en bloque. Este protocolo permite controlar la adhesión y desprendimiento celular para ingeniería de tejidos.

Preparación de Superficies de respuesta térmica nanoestructurados para la Ingeniería de Tejidos

Explorar más videos