Preparación de Superficies de respuesta térmica nanoestructurados para la Ingeniería de Tejidos

El objetivo general de este método Langmuir-Schaefer con copolímeros en bloque es fabricar láminas celulares en diversas condiciones de la superficie sensible a la temperatura, controlando la intensidad de la adhesión y los anclajes celulares. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de los biomateriales, como los materiales biocompatibles, la superficie para cultivo celular y la bioseparación. La principal ventaja de esta técnica es que se puede controlar la interacción entre la superficie sensible a la temperatura y las células, y se pueden optimizar las condiciones de modificación para la recuperación de las láminas celulares.

Aunque este método puede proporcionar información sobre la interacción entre la célula y la superficie, también puede aplicarse a otros sistemas, como la bioseparación y las biopelículas. Para comenzar, disuelva el estireno, ECT y ACVA en 40 mililitros de 1,4-Dioxano. Congele la solución en nitrógeno líquido bajo vacío durante 15 a 20 minutos para eliminar las especies reactivas.

Después de descongelar gradualmente la solución a temperatura ambiente, repita este ciclo de congelación, bombeo, descongelación y desgasificación tres veces. Obtenga el agente macro-RAFT de poliestireno mediante polimerización a 70 grados Celsius durante 15 horas en un baño de aceite. Precipite el agente macro-RAFT de poliestireno con 800 mililitros de éter y seque al vacío.

A continuación, disuelva el monómero IPAAm, el agente macro-RAFT de poliestireno y el ACVA en cuatro mililitros de 1,4-Dioxano. Elimine el oxígeno de la solución utilizando ciclos de desgasificación por congelación, bombeo y descongelación como antes. Realice una polimerización a 70 grados Celsius durante 15 horas en un baño de aceite después de la desgasificación.

Finalmente, obtenga la molécula de St-IPAAm sintetizada de la misma manera que el agente macro-RAFT de poliestireno. Lave los sustratos de vidrio con un exceso de acetona y etanol, y sométalos a sonicación durante cinco minutos para eliminar contaminantes superficiales. Seque los sustratos en una estufa a 65 grados Celsius durante 30 minutos.

Luego, utilice plasma de oxígeno para activar las superficies de los sustratos a temperatura ambiente. Sumerja los sustratos en tolueno que contenga 1% de hexatrimetoxisilano durante la noche a temperatura ambiente para silanizar el sustrato. A continuación, lave los sustratos silanizados en tolueno y sumérjalos en acetona durante 30 minutos para eliminar los agentes no reaccionados.

Incube los sustratos durante dos horas a 110 grados Celsius para inmovilizar completamente la superficie. Finalmente, corte los sustratos silanizados con un cortador de vidrio a dimensiones de 25 milímetros por 24 milímetros para que encajen en las placas de cultivo celular. Coloque el instrumento para películas de Langmuir en un gabinete para evitar la acumulación de polvo.

Lave la cubeta de Langmuir junto con las barreras con agua destilada y etanol para eliminar los contaminantes. Seque la cubeta y las barreras pasando una toalla sin pelusa. A continuación, llene la cubeta con aproximadamente 110 mililitros de agua destilada y coloque las barreras en ambos lados de la cubeta.

A continuación, caliente una placa de platino Wilhelmy para monitorear la tensión superficial con un quemador de gas hasta que la placa se vuelva roja. Luego lave la placa con agua destilada para eliminar los contaminantes. Suspenda la placa Wilhelmy en un alambre unido al instrumento de medición de presión superficial.

Calibre el instrumento de medición de presión superficial según el protocolo del fabricante. Comprima la interfase aire-agua en la cubeta mediante las barreras en ambos lados de la cubeta hasta que la interfase alcance aproximadamente 50 centímetros cuadrados sin ninguna gota de polímero. Aspire cualquier contaminante pequeño hasta que la presión superficial sea casi cero milinewtons por metro.

Reposicione las barreras en ambos lados y agregue agua destilada para compensar la disminución de agua destilada. A continuación, disuelva cinco miligramos de la molécula de St-IPAAm sintetizada en cinco mililitros de una solución de desarrollo de cloroformo. Luego, agregue suavemente 27 microlitros de St-IPAAm disuelto en cloroformo sobre la cubeta utilizando una microjeringa o micropipeta.

Después de esperar cinco minutos para permitir la evaporación completa del cloroformo, mueva ambos barreras horizontalmente para comprimir la molécula de St-IPAAm en la superficie. Mantenga la velocidad de compresión de las barreras en 0,5 milímetros por segundo hasta alcanzar el área objetivo de 50 centímetros cuadrados. Mida las isotermas de presión superficial Pi-A con la placa de Wilhelmy de platino conectada al instrumento de medición de presión superficial durante la compresión, según el protocolo del fabricante.

Después de alcanzar el tamaño del área objetivo, mantenga la superficie durante cinco minutos para permitir que las moléculas de St-IPAAm se relajen. Las moléculas no alcanzan el equilibrio inmediatamente después de la compresión. Luego, transfiera la película de Langmuir a un sustrato de vidrio modificado hidrofóbicamente utilizando un aparato de transferencia durante cinco minutos para absorber firmemente la película.

Fije el sustrato de vidrio hidrofóbico en paralelo sobre el dispositivo. Conecte el dispositivo a una etapa de alineación y muévalo perpendicularmente. Eleve el sustrato horizontalmente con el aparato de transferencia y séquelo durante un día en un desecador.

Para preparar suspensiones celulares, cultive células endoteliales de la arteria carótida bovina, o BAECs, hasta alcanzar una confluencia de 1/3 a 37 grados Celsius en 5%CO2 y 95%aire, sobre poliestireno para cultivo celular con DMEM, que contenga FBS y penicilina. Una vez alcanzada la confluencia, trate las BAECs con tres mililitros de tripsina-EDTA al 0,25% durante tres minutos a 37 grados Celsius en 5%CO2 y 95%aire. Desactive la tripsina-EDTA añadiendo 10 mililitros de DMEM que contenga 10%FBS.

Y recoger la suspensión celular en un tubo cónico de 50 mililitros. Después de centrifugar a 120 ×g durante cinco minutos, aspirar el sobrenadante y resuspender las células en 10 mililitros de DMEM. Sembrar las células recuperadas sobre las superficies de St-IPAAm a una concentración de 10.000 células por centímetro cuadrado, contadas mediante un hemocitómetro desechable.

Observe las células sobre las superficies mediante un microscopio equipado con un incubador a 37 grados Celsius con 5% CO₂ y 95% aire. A continuación, esterilice las superficies de St-IPAAm mediante luz ultravioleta en una cabina de flujo laminar. Registre imágenes de lapso de tiempo de las BAEC adheridas durante aproximadamente 24,5 horas a 37 grados Celsius mediante un microscopio de contraste de fases con aumento de 10x.

Después de la adhesión de BAEC, registre la desprendimiento de las BAECs de la superficie de St-IPAAm a 20 grados Celsius durante aproximadamente 3,5 horas. Tras optimizar la adhesión y el desprendimiento celular en la superficie transferida mediante película de Langmuir, fabrique las láminas celulares cultivando primero las BAECs como antes. Siembre un total de 100.000 células por centímetro cuadrado en superficies de St-IPAAm.

Y incubar durante tres días a 37 grados Celsius en 5% CO₂. Las BAEC confluentes se desprendieron espontáneamente a 20 grados Celsius. A continuación se muestra la preparación de una superficie transferida de película de Langmuir sensible a la temperatura.

Se dejó caer suavemente la solución de St-IPAAm en cloroformo sobre una interfase aire-agua. Se utilizaron dos barreras para comprimir las moléculas de St-IPAAm en la interfase hasta alcanzar un área objetivo de 50 centímetros cuadrados. La presión superficial se midió durante la compresión para detectar cualquier defecto en la película de Langmuir.

Después de la compresión, un sustrato de cubreobjetos modificado hidrofóbicamente se colocó horizontalmente sobre la interfaz mediante una etapa de alineación. El sustrato se levantó horizontalmente y se secó durante un día. Tras este paso, las superficies de St-IPAAm estaban listas para su uso en experimentos de cultivo celular.

Se muestran aquí resultados representativos de imágenes topográficas de microscopía de fuerza atómica de superficies de St-IPAAm. Se observaron nanoestructuras en ambas superficies de St-IPAAm. El tamaño y la forma de las nanoestructuras dependían fuertemente de AM y de la composición de St-IPAAm.

Aquí se muestra una imagen macroscópica de una lámina celular recuperada sobre una superficie transferida de película de Langmuir con St-IPAAm 480 y una AM de 40 nanómetros cuadrados por molécula. Las células alcanzaron confluencia tras tres días de cultivo sobre superficies de St-IPAAm 170 y St-IPAAm 480 a 37 grados Celsius. Y la lámina celular se recuperó rápidamente tras reducir la temperatura de 37 a 20 grados Celsius.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo fabricar y diseñar la composición molecular del polímero, fabricar y transferir películas de Langmuir, controlar la adhesión y desprendimiento celular, y recuperar láminas celulares. Tras su desarrollo, esta técnica allana el camino para que los investigadores en el campo de los biomateriales y la ingeniería de tejidos exploren las interacciones entre células y superficies, así como estrategias de cultivo celular para su uso en medicina regenerativa. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia mediante trasplante celular, ya que posee el potencial de fabricar láminas celulares de diversos tipos celulares provenientes de pacientes.