Una caída Cromosoma Aire seco Rápido Método de preparación adecuados para FISH en Plantas

El objetivo general de este método es preparar cromosomas vegetales adecuados para la técnica de hibridación de fluorescencia en C dos utilizando sondas de ADN de copia única y alta. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la citogenética y la investigación del genoma, como la detección de reordenamientos cromosómicos, el ordenamiento de los marcadores genéticos en los cromosomas y el análisis comparativo entre diferentes especies. La principal ventaja de este procedimiento es que la preparación de las tiras cromosómicas se vuelve rápida, fácil y eficiente.

La suspensión celular puede almacenarse a menos 20 grados hasta dos meses y utilizarse para la preparación de los cromosomas cuando sea necesario. La primera vez que tuvimos esta idea de este método fue cuando observamos que la calidad y el número de cromosomas adecuados aumentaban drásticamente. Germinar de 10 a 20 semillas de cebada en dos capas de papel de filtro húmedo en una placa de Petri en condiciones de oscuridad durante dos días a 22 a 24 grados centígrados después de dos días. Corte las raíces vigorosas con longitudes de uno a dos centímetros de la semilla con una hoja de afeitar.

A continuación, prepare agua helada colocando una botella de vidrio de 500 mililitros que contenga agua fría del grifo en agua helada picada. Airear el agua helada y sumergir las puntas de las raíces durante 20 horas para aumentar la frecuencia de las células en metafase. Transfiera las raíces del agua a 50 mililitros de fijador de ácido acético etanol para fijarlas a temperatura ambiente durante dos días después de la fijación.

Lave de 10 a 20 raíces con 30 mililitros de agua helada del grifo en un altavoz de vidrio de 50 mililitros durante cinco minutos dos veces. Transfiera las raíces una por una a 30 mililitros de tampón de citrato con pinzas. Lave las raíces agitando el altavoz de vidrio durante cinco minutos dos veces.

Luego coloque las raíces en papel de filtro para eliminar el líquido por completo bajo un microscopio. Corta el tejido no meristemático no deseado con una cuchilla de afeitar. El paso más crítico de este procedimiento es determinar el tiempo de digestión adecuado que puede variar entre las diferentes especies.

Aquí se incuban hasta 20 puntas de raíz en un mililitro de mezcla de enzimas a 37 grados centígrados durante unos 50 minutos. Para ablandar el tejido vegetal en un vidrio de reloj bajo un microscopio, retire la enzima pipeteando y lave las puntas de las raíces con hielo con cinco mililitros de tampón de citrato 0,01 molar para reemplazar la enzima residual. Continúe lavando las puntas de las raíces con un mililitro de etanol al 96% dos veces cuidadosamente en el mismo vidrio del reloj.

Luego reemplace el etanol con 10 a 15 microlitros de fijador recién preparado por punta de raíz. Transfiera las puntas de las raíces junto con el fijador a un tubo de dos mililitros y desintegre los tallos del borde de la raíz con una aguja de disección o pinzas. Golpee el tubo 20 veces para volver a suspender las células y obtener una suspensión celular.

A continuación, coloque dos o tres capas de papel de seda empapado en agua en una placa caliente a 50 grados centígrados. Sumerja los portaobjetos microscópicos en hielo, agua fría del grifo en el refrigerador durante 30 minutos. Luego coloque los portaobjetos sobre el papel de seda húmedo, pipetee de siete a 10 microlitros de suspensión celular y déjelo caer desde una distancia de 20 centímetros sobre el portaobjetos enfriado colocado en la placa caliente.

Siga esto con 10 microlitros de la mezcla de etanol de ácido acético en el mismo lugar que la suspensión de la celda en el portaobjetos, y mantenga el portaobjetos en la placa caliente. Después de dos minutos, coloque el portaobjetos en la placa calefactora sin el pañuelo húmedo y déjelo secar durante un minuto más. Revise los portaobjetos con un microscopio de contraste facial para controlar la calidad de la dispersión cromosómica.

Utilice los portaobjetos el mismo día o guárdelos sumergiéndolos en etanol al 96% en un frasco de coplin a menos 20 grados centígrados para pretratar los portaobjetos antes de pescar. Coloque los portaobjetos en un frasco de copin que contenga 50 mililitros de dos XSSC durante cinco minutos con pinzas. Transfiera los portaobjetos a un frasco de coplan que contenga 50 mililitros de ácido acético al 45% durante tres a 10 minutos.

A continuación, transfiera los portaobjetos a un frasco de coplan que contenga 50 mililitros de dos XSSC durante 10 minutos. A continuación, transfiera los portaobjetos a un frasco de coplin que contenga 50 mililitros de formaldehído al 4% y sumerja los portaobjetos durante 10 minutos para fijar los cromosomas. Retire el formaldehído enjuagando los portaobjetos tres veces durante cuatro minutos cada uno en un frasco de coplin que contenga 50 mililitros de dos XSSC.

A continuación, deshidratar los portaobjetos durante dos minutos en una serie de etanol al 70%90% y al 100%, y secar los portaobjetos en posición vertical. Para cada portaobjetos, prepare una solución de hibridación de 20 microlitros utilizando 10 microlitros de amida en forma desionizada, cinco microlitros de cuatro tampones de hibridación X, tres microlitros de la sonda y dos microlitros de agua libre de D. Agregue 20 microlitros de solución de hibridación por portaobjetos y cubra con un cubreobjetos de 24 por 32 milímetros.

Después de sellar el cubreobjetos con portaobjetos de desnaturalización de cemento de caucho con sondas simultáneamente a 80 grados centígrados durante dos minutos en una placa caliente, transfiera los portaobjetos a una cámara húmeda e incube a 37 grados centígrados durante la noche. Para evitar la luz, retire los cubreobjetos enjuagando los portaobjetos en un frasco de acoplamiento con dos XSSC. A continuación, coloque los portaobjetos en un frasco de coplan que contenga de 55 a 60 grados centígrados, dos XSSC e incube durante 20 minutos.

A continuación, coloque los portaobjetos en dos XSSC en un frasco coplan durante dos minutos a temperatura ambiente. Seguro. Deshidratar los portaobjetos en un frasco de coplan durante dos minutos en una serie de etanol al 70%90% y al 100%. Aire. Seque los portaobjetos y la contramancha con un medio de montaje dappy in Antifa, evitando la luz intensa.

Analice los portaobjetos utilizando un microscopio de epifluorescencia. La selección del filtro depende del fluorocromo utilizado para el etiquetado de la sonda, si es necesario. Guarde los portaobjetos a cuatro grados centígrados en condiciones de oscuridad hasta por un año.

Aquí se muestran las propagaciones de metafase mitótica preparadas por el método de preparación de cromosomas de gota rápida en seco al aire. El análisis de los peces se llevó a cabo utilizando secuencias repetitivas y de copia única. Las imágenes se obtuvieron mediante un microscopio de epifluorescencia con un conjunto de filtros que permiten la excitación de los correspondientes fluorocuatro y se capturaron con una cámara monocromática CCD de alta sensibilidad.

El experimento con peces en los cromosomas mitóticos de la metafase de Hoard y vulgari utilizando una sonda de copia única y cinco S-R-D-N-A reveló señales distintas y de alta calidad. La hibridación del microsatélite CT CTT 10 en los cromosomas de hordy y BULBUS dio como resultado un patrón específico y distinto. El experimento con peces en cromosomas mitóticos de metafase de sala seriada utilizando la sonda PSC 119 dos dio como resultado señales específicas y de alta calidad.

Los beneficios obvios de este enfoque son los cromosomas bien distribuidos, sin daños y con numerosas metafases que sirven como un requisito previo perfecto para el análisis exitoso de los peces. Una vez dominado, este procedimiento se puede realizar en menos de dos horas si se realiza correctamente. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo preparar el espacio cromosómico mitótico de metacara de alta calidad para peces IDE y anteriores, una altura puede ser extremadamente peligrosa, siempre use gráficos y capucha de película al realizar estos procedimientos.