Name: Una caída Cromosoma Aire seco Rápido Método de preparación adecuados para FISH en Plantas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: Aprende a preparar cromosomas mitóticos de plantas mediante un método rápido de secado al aire para hibridación in situ fluorescente (FISH). Esta técnica mejora la eficiencia en estudios citogenéticos y de genómica.

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Agradecemos a la DFG por su apoyo financiero (HO 1779/21-1), así como a Katrin Kumke y al Dr. Veit Schubert (IPK, Gatersleben) por su asesoramiento técnico.

1. Cromosoma Preparación <ol><li> La germinación de semillas y fijación de puntas de las raíces <ol><li> 10-20 germinar semillas de cebada en dos capas de papel de filtro húmedo en una placa de Petri bajo condiciones de oscuridad durante 2 días a 22-24 ° C. Cortar las raíces vigorosas con la longitud de 1-2 cm de la semilla mediante el uso de una cuchilla de afeitar. </li><li> Preparar agua helada mediante la colocación de una botella de vidrio de 500 ml que contiene agua fría del grifo en agua con hielo picado. Airear el agua helada y se sumerja puntas de las raíces durante 20 horas para aumentar la frecuencia de las células en metafase. </li><li> Transferencia de raíces a partir de agua a 50 ml de etanol: ácido acético (3: 1) fijador para fijarlos a TA durante 2 días. Raíces Almacenar en etanol recién preparada: ácido acético (3: 1) fijador a 4 ° C hasta su uso hasta un año. </li></ol></li><li> Tratamiento de lavado y la enzima <ol><li> Lávese las 10-20 raíces con agua corriente helada 30 ml durante 5 minutos dos veces usando un vaso de precipitados de vidrio de 50 ml. Utilice microscopio binocular. Transferencia raíces uno por uno en30 ml 0,01 M tampón citrato (0,01 M de ácido cítrico + 0,01 M de citrato de sodio, pH 4,8) utilizando pinzas y lavar agitando el vaso de vidrio durante 5 minutos dos veces. Coloque raíces sobre papel de filtro para eliminar el líquido por completo y de corte de tejido no meristemática no deseado usando una cuchilla de afeitar. </li><li> Incubar hasta 20 puntas de las raíces en la mezcla de enzima 1 ml a 37 ° C durante aproximadamente 50 min para suavizar el tejido de la planta (Tabla 1) en un vidrio de reloj. Mezcla de enzimas contiene 0,7% R10 celulasa, 0,7% de celulasa, pectoliasa 1% y 1% citohelicasa diluido en tampón de citrato 0,01 M. Almacenar la mezcla de enzimas a -20 ° C y reutilizada hasta cinco veces. </li><li> Retire la enzima con la pipeta y lavar las puntas de las raíces en el hielo con 5 ml de 0,01 M tampón citrato dos veces para reemplazar la enzima residual. </li></ol></li><li> Maceración Root <ol><li> Puntas de las raíces de lavado con 1 ml de etanol al 96% dos veces cuidadosamente en el mismo vidrio de reloj. Reemplazar con etanol recién preparada fijador (75% ácido acético: etanol 25%). Utilice 10-15fijador l por punta de la raíz. </li><li> Puntas de las raíces de transferencia junto con el fijador en un tubo de 2 ml y se desintegran meristemos radiculares con una aguja o unas pinzas de disección. Toca el tubo 20 veces para resuspender las células para obtener una suspensión celular. Guarde la suspensión de células a -20 ° C hasta dos meses. </li></ol></li><li> Dropping de la suspensión celular <ol><li> Coloca 2-3 capas de tejido de papel empapada en agua en una placa caliente a 50 ° C. Sumerja diapositivas microscópicas en el agua del grifo helado en la nevera durante 30 minutos. Y el lugar se desliza en la parte superior del tejido de papel húmeda. </li><li> Pipeta 7-10 l de suspensión celular y colóquelo a una distancia de 20 cm sobre el portaobjetos enfriado colocado en el plato caliente. Pipeta 10 l de mezcla de ácido acético-etanol en el mismo lugar que la suspensión de células en la diapositiva y mantener la diapositiva en el plato caliente durante otros 2 min. Colocar el portaobjetos en el plato caliente sin el tejido húmedo y deje que se seque durante 1 min. </li></ol></li><li> Control de calidad y storage de diapositivas <ol><li> Compruebe diapositivas utilizando un microscopio de contraste de fase para controlar la calidad de la difusión cromosoma. Utilice diapositivas o bien el mismo día o tienda por inmersión en etanol al 96% en un tarro Coplin a -20 ° C. </li></ol></li><li> Pretratamiento de diapositivas antes de FISH; todos los pasos se llevaron a cabo a RT <ol><li> Colocar los portaobjetos en un tarro de Coplin que contiene 50 ml de 2x SSC (20x SSC contiene 3 M NaCl y 300 mM de citrato trisódico) durante 5 min. Con unas pinzas, toboganes de transferencia a un tarro de Coplin que contiene 50 ml de ácido acético 45% para 3 a 10 min. </li><li> Transferencia desliza a un frasco de Coplin que contiene 50 ml de 2x SSC durante 10 minutos. Diapositivas de transferencia a un frasco Coplin que contiene 50 ml de formaldehído al 4% (en 2x SSC) y sumergirse diapositivas durante 10 minutos para fijar los cromosomas. </li><li> Retire formaldehído enjuagando las diapositivas 3 veces durante 4 minutos cada uno, en una jarra Coplin que contiene 50 ml 2x SSC. Deshidratar las diapositivas en una jarra Coplin durante 2 minutos en serie de 70%, 90% y etanol al 100%, respectivamente, y se desliza en seco en una línea verticalposición. </li></ol></li></ol> 2. fluorescente hibridación in situ (FISH) <ol><li> Para cada diapositiva, preparar una solución de hibridación de 20 l en total utilizando 10 l de formamida desionizada, 5 l de tampón de hibridación 4x (200 l de tampón contiene 80 l de 20x SSC, 8 l 1 M Tris-HCl pH 8,0, 1,6 l 0,5 M EDTA, 11,2 l 10 g / l de esperma de salmón y 99,2 l de DNasa libre de agua), 3 l de la sonda y 2 l de agua libre de DNasa. </li><li> Añadir 20 l de solución de hibridación por diapositiva y la tapa con un cubreobjetos de 24 x 32 mm y arrestar a la hoja de la cubierta con cemento de goma. Desnaturalizar diapositivas con sondas simultáneamente a 80 ° C durante 2 minutos en un plato caliente. </li><li> Transferencia desliza a una cámara húmeda e incubar diapositivas a 37 ° CO / N luz evitando. Retire cubreobjetos enjuagando las diapositivas en un frasco Coplin con 2x SSC. Colocar los portaobjetos en un tarro de Coplin que contiene 55 a 60 ° C 2x SSC y se incuban durante 20 min. </li><li> Colocar los portaobjetos a 2x SSC en un frasco Coplin durante 2 minutos a temperatura ambiente. Deshidratar portaobjetos en un tarro Coplin durante 2 minutos en serie de 70%, 90% y 100% de etanol, respectivamente. </li><li> Seque las diapositivas y de contraste con 1 mg / ml 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindoline (DAPI) en antifade medio de montaje, evitar la luz intensa. </li></ol> 3. Análisis microscópico y almacenamiento <ol><li> Analizar las diapositivas utilizando un microscopio de epifluorescencia. La selección de filtro depende de la fluorocromo utilizado para el marcaje de la sonda. Si es necesario, almacenar diapositivas a 4 ° C en condiciones de oscuridad hasta un año. </li></ol>

<ol><li>Geber, G., Schweizer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochemical+heterochromatin+differentiation+in+Sinapis+alba+%28Cruciferae%29+using+a+simple+air-drying+technique+for+producing+chromosome+spreads%5BTitle%5D)+AND+%22Pl+Syst+Evol%22%5BJournal%5D)">Cytochemical heterochromatin differentiation in Sinapis alba (Cruciferae) using a simple air-drying technique for producing chromosome spreads.</a> Pl Syst Evol. 158 (2-4), 97-106 (1988).</li>
<li>Andras, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+drop-spreading+technique+to+produce+cytoplasm-free+mitotic+preparations+from+plants+with+small+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Res%22%5BJournal%5D)">A drop-spreading technique to produce cytoplasm-free mitotic preparations from plants with small chromosomes.</a> Chromosome Res. 7 (8), 641-647 (1999).</li>
<li>Rothfels, K. H., Siminovitch, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+air-drying+technique+for+flattening+chromosomes+in+mammalian+cells+grown+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Stain+Technology%22%5BJournal%5D)">An air-drying technique for flattening chromosomes in mammalian cells grown in vitro.</a> Stain Technology. 33 (2), 73-77 (1958).</li>
<li>Martin, R., Busch, W., Herrmann, R. G., Wanner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+preparation+of+plant+chromosomes+for+high-resolution+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Res%22%5BJournal%5D)">Efficient preparation of plant chromosomes for high-resolution scanning electron microscopy.</a> Chromosome Res. 2 (5), 411-415 (1994).</li>
<li>Kato, A., Albert, P. S., Vega, J. M., Birchler, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+fluorescence+in+situ+hybridization+signal+detection+in+maize+using+directly+labeled+probes+produced+by+high+concentration+DNA+polymerase+nick+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Biotech.+Histochem%22%5BJournal%5D)">Sensitive fluorescence in situ hybridization signal detection in maize using directly labeled probes produced by high concentration DNA polymerase nick translation.</a> Biotech. Histochem. 81 (2-3), 71-78 (2006).</li>
<li>Kirov, I., Divashuk, M., Van Laere, K., Soloviev, A., Khrustaleva, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+easy+%27SteamDrop%27+method+for+high+quality+plant+chromosome+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cytogenet%22%5BJournal%5D)">An easy 'SteamDrop' method for high quality plant chromosome preparation.</a> Mol. Cytogenet. 7, 21(2014).</li>
<li>Spurbeck, J. L., Zinsmeister, A. R., Meyer, K. J., Jalal, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+chromosome+spreading%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Med+Genet%22%5BJournal%5D)">Dynamics of chromosome spreading.</a> Am J Med Genet. 61 (4), 387-393 (1996).</li>
<li>Ma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synteny+between+Brachypodium+distachyon+and+Hordeum+vulgare+as+revealed+by+FISH%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Res%22%5BJournal%5D)">Synteny between Brachypodium distachyon and Hordeum vulgare as revealed by FISH.</a> Chromosome Res. 18 (7), 841-850 (2010).</li>
<li>Kato, A., Lamb, J. C., Birchler, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+painting+using+repetitive+DNA+sequences+as+probes+for+somatic+chromosome+identification+in+maize%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Chromosome painting using repetitive DNA sequences as probes for somatic chromosome identification in maize.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 101 (37), 13554-13559 (2004).</li>
<li>Pan, W. H., Houben, A., Schlegel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+effective+cell+synchronization+in+plant-roots+by+hydroxyurea+and+amiprophos-methyl+or+colchicine%5BTitle%5D)+AND+%22Genome%22%5BJournal%5D)">Highly effective cell synchronization in plant-roots by hydroxyurea and amiprophos-methyl or colchicine.</a> Genome. 36 (2), 387-390 (1993).</li>
<li>Kim, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+karyotyping+of+sorghum+by+in+situ+hybridization+of+landed+BACs%5BTitle%5D)+AND+%22Genome%22%5BJournal%5D)">Integrated karyotyping of sorghum by in situ hybridization of landed BACs.</a> Genome. 45 (2), 402-412 (2002).</li>
<li>Lapitan, N. L. V., Brown, S. E., Kennard, W., Stephens, J. L., Knudson, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FISH+physical+mapping+with+barley+BAC+clones%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">FISH physical mapping with barley BAC clones.</a> Plant J. 11 (1), 149-156 (1997).</li>
<li>Aliyeva-Schnorr, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytogenetic+mapping+with+centromeric+BAC+contigs+shows+that+this+recombination-poor+region+comprises+more+than+half+of+barley+chromosome+3H%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Cytogenetic mapping with centromeric BAC contigs shows that this recombination-poor region comprises more than half of barley chromosome 3H.</a> Plant J. 84, 385-394 (2015).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El experimento preparación cromosoma se ha llevado a cabo utilizando las raíces jóvenes de cereales pertenecientes a la familia de las gramíneas (Poaceae). Todas las especies analizadas tienen 14 cromosomas en metafase relativamente largo mitótico (11 a 15 micras) en el conjunto del genoma diploide y pertenecen a especies de gran genoma (05.01 a 07.09 GBP). Longitud de raíces germinadas no era más de 2 cm para obtener un máximo de tejido meristemático. La sincronización de las células en div...

Hibridación in situ fluorescente (FISH) es una herramienta eficaz para el mapeo físico de las secuencias de copia única y altas a nivel cromosómico. Requisito previo es la preparación de extensiones de cromosomas de alta calidad. No hay cromosoma protocolo general de preparación que sería igualmente adecuado para células animales y vegetales. Preparación de cromosomas de la planta es particularmente difícil debido a la pared celular rígida y varios consistencia citoplasma dentro de diferentes especies. Uno de los métodos favorables para la preparación de cromosomas de la planta es una técnica de caída de llamada también conocida como técnica de la gota de dispersión y secado al aire técnica de 1,2. Este método fue introducido por primera vez en 1958 por Rothfels y Siminovitch para in vitro células de mamíferos cultivadas 3. Más tarde Martin et al., 4 y Kato et al. 5 adaptó este método para las plantas. Más recientemente, un método llamado &#39;SteamDrop y# 39; fue desarrollado que utiliza vapor de agua para la preparación de cromosomas que no se solapan 6. Aunque, se observó la influencia positiva de la alta humedad anterior 7, &#39;SteamDrop&#39; ofrece un flujo de trabajo controlado de preparaciones de cromosomas de alta calidad 6. El tratamiento de vapor provoca el estiramiento de los cromosomas probablemente conectados a algunas modificaciones de las proteínas cromosómicas. La calidad de los diferenciales de metafase resultante es muy alta, aunque de retención de número suficiente de metafase completa se extiende para posteriores experimentos de FISH exige conocimientos técnicos. Aquí se presenta un protocolo para la preparación de los cromosomas mitóticos cereales adecuados para la detección de sondas FISH individuales y alta copia 5,8. Este método es una variante mejorada del método de goteo se seque al aire descrito por Kato 9 realizado bajo una humedad relativa de 50% -55% (Figura 1). Este protocolo comprende un número reducidode etapas de lavado que hace su aplicación fácil, eficiente y reproducible. El uso de este protocolo se obtuvieron extensiones de cromosomas de alta calidad y los resultados de FISH para Hordeum vulgare, H. bulbosum, H. marinum, H. murinum, H. pubiflorum y Secale cereale.

<table><tbody><tr><td>Placa caliente</td><td>MEDAX GmbH</td><td>12603</td><td></td></tr><tr><td>Celulase R10</td><td>Duchefa</td><td>C8001</td><td></td></tr><tr><td>Celulasa&nbsp;</td><td>CalBioChem</td><td>219466</td><td></td></tr><tr><td>Pectoliasa</td><td>Sigma</td><td>P3026</td><td></td></tr><tr><td>Citohelicasa</td><td>Sigma</td><td>C8274</td><td></td></tr><tr><td>Texas Red-12-dUTP</td><td>Invitrogen</td><td>C3176</td><td>fluorocromo directo&nbsp;</td></tr><tr><td>Fluor488-5-dUTP</td><td>Invitrogen</td><td>C11397</td><td>fluorocromo directo&nbsp;</td></tr><tr><td>Microscopio de fluorescencia</td><td>Olympus BX61</td><td>BX61</td><td></td></tr><tr><td>Cámara CCD</td><td>Orca ER, Hamamatsu</td><td>C10600</td><td></td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)&nbsp;</td><td>Vector Laboratories</td><td>Colorante fluorecsent</td> <td>H-1200</td></tr></tbody></table>

una caída cromosoma aire seco rápido método de preparación adecuados para fish en plantas

A Fast Air-dry Dropping Chromosome Preparation Method Suitable for FISH in Plants

Preparación de extensiones de cromosomas es un requisito previo para el buen desarrollo de la hibridación in situ fluorescente (FISH). Preparación de alta calidad extensiones de cromosomas planta es un reto debido a la pared celular rígida. Uno de los métodos aprobados para la preparación de cromosomas de la planta es una preparación gota llamada, también conocido como gota de dispersión o la técnica de secado al aire. A continuación, presentamos un protocolo para la preparación rápida del cromosoma mitótico extiende adecuado para la detección FISH de sondas de ADN individuales y altos de copia. Este método es una variante mejorada del método de la gota de secado al aire se realiza bajo una humedad relativa de 50% -55%. Este protocolo se compone de un número reducido de etapas de lavado que hace su aplicación fácil, eficiente y reproducible. Obvios beneficios de este enfoque son bien extendidas, metafase los cromosomas intactos y numerosos que sirven como requisito previo perfecto para el análisis FISH éxito. El uso de este protocolo se obtuvo chrom de alta calidadOsome márgenes y resultados de FISH reproducibles para Hordeum vulgare, H. bulbosum, H. marinum, H. murinum, H. pubiflorum y Secale cereale.

Diapositivas microscópica con los diferenciales en metafase de la mitosis se prepararon por el método de preparación rápida secar al aire el cromosoma de goteo descrita anteriormente (Suppl. Figura 1). FISH análisis se llevó a cabo utilizando tanto, secuencias repetitivas y de una sola copia. Las imágenes se obtuvieron por un microscopio de epifluorescencia con un conjunto de filtros que permite la excitación de los fluoróforos correspondientes y capturados por una cámara CCD monocromo de alta sensibili...

Se describe un protocolo para la preparación de distribuciones de cromosomas de plantas mitóticas de alta calidad mediante un método rápido de secado al aire adecuado para la detección FISH de sondas de ADN de copia única y alta.

Una caída Cromosoma Aire seco Rápido Método de preparación adecuados para FISH en Plantas

Preparation of chromosome spreads is a prerequisite for the successful performance of fluorescence in situ hybridization (FISH). Preparation of high ...

El objetivo general de este método es preparar cromosomas vegetales adecuados para la técnica de hibridación fluorescente in situ mediante sondas de ADN de copia única y alta copia. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en citogenética e investigación genómica, como la detección de reordenamientos cromosómicos, el ordenamiento de marcadores genéticos en cromosomas y el análisis comparativo entre diferentes especies. La principal ventaja de este procedimiento es que la preparación de extensiones cromosómicas se vuelve rápida, sencilla y eficiente.La suspensión celular puede almacenarse a menos 20 grados hasta por dos meses y utilizarse para la preparación de cromosomas cuando sea necesario. Tuvimos por primera vez esta idea de este método cuando observamos que la calidad y el número de cromosomas adecuados aumentaron drásticamente en días humanos. Germinar 10 a 20 semillas de cebada sobre dos capas de papel de filtro húmedo en una placa de Petri en condiciones oscuras durante dos días a 22-24 grados Celsius. Después de dos días, cortar las raíces vigorosas con longitudes de uno a dos centímetros de la semilla utilizando una hoja de afeitar.A continuación, prepare agua fría con hielo colocando una botella de vidrio de 500 mililitros que contenga agua del grifo fría en agua con hielo triturado. Sature con aire el agua fría con hielo e introduzca las puntas de las raíces durante 20 horas para aumentar la frecuencia de células en metafase. Transfiera las raíces del agua a 50 mililitros de fijador de etanol-ácido acético para fijarlas a temperatura ambiente durante dos días tras la fijación.Lave de 10 a 20 raíces con 30 mililitros de agua del grifo fría con hielo en un vaso de vidrio de 50 mililitros durante cinco minutos, dos veces. Transfiera las raíces una por una a 30 mililitros de tampón citrato utilizando pinzas. Lave las raíces agitando el vaso de vidrio durante cinco minutos, dos veces.Luego, coloque las raíces sobre papel de filtro para eliminar completamente el líquido bajo un microscopio. Corte el tejido no meristemático no deseado utilizando una cuchilla de afeitar. El paso más crítico de este procedimiento consiste en determinar el tiempo adecuado de digestión, el cual puede variar entre diferentes especies.Aquí se incuban hasta 20 puntas radiculares en un mililitro de mezcla enzimática a 37 grados Celsius durante aproximadamente 50 minutos. Para ablandar el tejido vegetal en un vaso de reloj bajo un microscopio, elimine la enzima mediante pipeteo y lave las puntas radiculares con cinco mililitros de tampón citrato 0,01 molar sobre hielo para reemplazar el residuo enzimático. Continúe lavando las puntas radiculares cuidadosamente dos veces con un mililitro de etanol al 96% en el mismo vaso de reloj.Luego, reemplace el etanol con 10 a 15 microlitros de fijador recién preparado por ápice radicular. Transfiera los ápices radiculares junto con el fijador a un tubo de dos mililitros y desintegre los meristemos de la raíz con una aguja de disección o pinzas. Agite el tubo 20 veces para resuspender las células y obtener una suspensión celular.A continuación, coloque dos o tres capas de papel de filtro empapado en agua sobre una placa calefactora a 50 grados Celsius. Sumerja las laminillas microscópicas en hielo, agua fría del grifo o en el refrigerador durante 30 minutos. Luego coloque las laminillas encima del papel de filtro húmedo, agregue por medio de pipeta de siete a 10 microlitros de la suspensión celular y deje caer la gota desde una distancia de 20 centímetros sobre la laminilla enfriada colocada sobre la placa calefactora.A continuación, agregue 10 microlitros de la mezcla de ácido acético y etanol en el mismo lugar que la suspensión celular sobre el portaobjetos y mantenga el portaobjetos sobre la placa calefactora. Después de dos minutos, coloque el portaobjetos sobre la placa calefactora sin el papel húmedo y deje secar durante un minuto adicional. Revise los portaobjetos utilizando un microscopio de contraste de fases para controlar la calidad de la dispersión de cromosomas.Utilice los portaobjetos el mismo día o almacénelos sumergiéndolos en Etanol al 96 % en un frasco Coplin a menos 20 grados Celsius para pretratarlos antes de la hibridación FISH. Coloque los portaobjetos en un frasco Coplin que contenga 50 mililitros de SSC 2X durante cinco minutos usando pinzas. Transfiera los portaobjetos a un frasco Coplin que contenga 50 mililitros de ácido acético al 45 % durante tres a diez minutos.A continuación, transfiera los portaobjetos a un frasco Coplin que contenga 50 mililitros de 2XSSC durante 10 minutos. Luego, transfiera los portaobjetos a un frasco Coplin que contenga 50 mililitros de formaldehído al 4%, e introduzca los portaobjetos durante 10 minutos para fijar los cromosomas. Elimine el formaldehído lavando los portaobjetos tres veces durante cuatro minutos cada vez en un frasco Coplin que contenga 50 mililitros de 2XSSC.Luego deshidrate los portaobjetos durante dos minutos en una serie de etanol al 70 %, 90 % y 100 %, y seque los portaobjetos en posición vertical. Para cada portaobjeto, prepare una solución de hibridación de 20 microlitros utilizando 10 microlitros de formamida desionizada, cinco microlitros de tampón de hibridación 4 X, tres microlitros de la sonda y dos microlitros de agua libre de DNasa. Añada 20 microlitros de solución de hibridación por portaobjeto y cúbralo con una cubeta de 24 por 32 milímetros.Después de sellar el cubreobjetos con cemento de goma, desnaturalice simultáneamente las preparaciones y las sondas a 80 grados Celsius durante dos minutos en una placa calefactora; luego transfiera las preparaciones a una cámara húmeda e incúbelas a 37 grados Celsius durante la noche. Evitando la luz, retire los cubreobjetos lavando las preparaciones en un frasco de acoplamiento con dos XSSC. A continuación, coloque las preparaciones en un frasco coplan que contenga dos XSSC a 55-60 grados Celsius e incúbelas durante 20 minutos.A continuación, coloque los portaobjetos en dos XSSC en un frasco Coplin durante dos minutos a temperatura ambiente. Deshidrate los portaobjetos en un frasco Coplin durante dos minutos en una serie de etanol al 70 %, 90 % y 100 %. Seque al aire los portaobjetos y contratinja con DAPI en medio de montaje Antifa, evitando la luz intensa.Analice las laminillas utilizando un microscopio de fluorescencia episcópica. La selección del filtro depende del fluorocromo utilizado para la marcación de la sonda, si es necesario. Almacene las laminillas a cuatro grados Celsius en condiciones oscuras hasta un año.Se muestran extensiones cromosómicas en metafase mitótica preparadas mediante el método rápido de gotas al aire seco. El análisis de FISH se realizó utilizando tanto secuencias repetitivas como secuencias únicas. Las imágenes se obtuvieron mediante un microscopio de fluorescencia epiluminiscente con un conjunto de filtros que permiten la excitación de los fluorocromos correspondientes, y fueron capturadas por una cámara CCD monocromática de alta sensibilidad.El experimento de FISH en cromosomas mitóticos en metafase de hoard y vulgari utilizando una sonda de copia única y cinco S-R-D-N-A reveló señales distintas y de alta calidad. La hibridación del microsatélite CT CTT 10 en los cromosomas de hordy y BULBUS produjo un patrón específico y diferenciado. El experimento de FISH en cromosomas mitóticos en metafase de sala serial utilizando la sonda PSC 119 dos produjo señales específicas y de alta calidad.Las ventajas evidentes de este enfoque son cromosomas metafásicos bien dispersos, intactos y numerosos, que sirven como un requisito perfecto para un análisis FISH exitoso. Una vez dominado, este procedimiento puede realizarse en menos de dos horas si se lleva a cabo correctamente. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar un preparado de cromosomas mitóticos en metafase de alta calidad para FISH, IDE y otros usos. Dado que el ácido puede ser extremadamente peligroso, siempre debe usar guantes y trabajar bajo campana extractora al realizar estos procedimientos.

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Investigación

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Biología

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Fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; La hibridación en los cromosomas mitóticos de mosquitos

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Las propagaciones de superficies nucleares son una herramienta indispensable para estudiar los eventos cromosómicos durante la meiosis. Aquí demostramos un método para preparar y visualizar cromosomas meióticos durante la profase I a partir de espermacitos de peces brabra.

Preparación de las propagaciones del cromosoma meiótico a partir de espermacitos de peces cebra

Este artículo describe un protocolo para el monitoreo espaciotemporal rápido y eficiente de la metilación de citosina normal y aberrante dentro de embriones intactos de pez cebra.

Monitorización espaciotemporal rápida y eficiente de la metilación normal y aberrante de la citosina en embriones intactos de pez cebra

Las tecnologías CRISPR-Cas han revolucionado el campo de la edición del genoma. Sin embargo, encontrar y aislar la edición de la línea germinal deseada sigue siendo un cuello de botella importante. Por lo tanto, este protocolo describe un método robusto para examinar rápidamente el esperma de pez cebra inyectado con CRISPR F0 para ediciones de la línea germinal utilizando técnicas estándar de PCR, digestión de restricción y electroforesis en gel.

Detección de espermatozoides para el aislamiento rápido de ediciones de la línea germinal en el pez cebra

Este protocolo describe un procedimiento modificado para aislar rápidamente ovocitos limpios en etapa I en pez cebra desprovistos de células de granulosa, proporcionando así un método conveniente para la investigación específica de ovocitos.

Aislamiento rápido de ovocitos en estadio I en pez cebra desprovistos de células granulosas

Aprende a preparar cromosomas mitóticos de plantas mediante un método rápido de secado al aire para hibridación in situ fluorescente (FISH). Esta técnica mejora la eficiencia en estudios citogenéticos y de genómica.

Una caída Cromosoma Aire seco Rápido Método de preparación adecuados para FISH en Plantas

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