Síntesis microondas impulsada de nanopartículas de óxido de hierro para la detección rápida de la aterosclerosis

El objetivo general de este protocolo es el uso de la tecnología de microondas para la síntesis rápida y funcionalización de nanopartículas de óxido de hierro con una fracción de bifosfonato para la detección rápida por resonancia magnética de la aterosclerosis en modelos de ratones. El uso de la tecnología de microondas en la síntesis y funcionalización de nanopartículas de óxido de hierro es aún limitado. Sin embargo, demostramos cómo se pueden desarrollar nanopartículas de alta calidad y protocolos extremadamente rápidos.

La principal ventaja de esta técnica es que, en tiempos extremadamente cortos, se pueden producir nanopartículas funcionalizadas de alta calidad y utilizarlas para el cateterismo de la placa de aterosclerosis dirigida a las microcalcificaciones. Para comenzar este procedimiento, agregue 0,5 gramos de 3-acetilacetano de hierro, 1,4 mililitros de ácido oleico, 0,6 mililitros de oleilamina y 1,19 gramos de 1,2-hexadodecanodiol a un matraz adaptado para microondas. Agregue 10 mililitros de éter fenílico con cuidado por la pared del matraz con una pipeta graduada.

A continuación, coloque el matraz en un reactor de microondas e inicie el protocolo de microondas cargando un estudio dinámico en el microondas. Una vez que se haya completado la reacción y el matraz se haya enfriado a temperatura ambiente, transfiera la mezcla de reacción a un matraz Erlenmeyer con una pipeta de vidrio y agregue 10 mililitros de etanol al 98 por ciento. Coloque el matraz encima de un imán de neodimio, niobio y boro y retire el sobrenadante con una pipeta de vidrio después de 5 minutos.

A continuación, añada 10 mililitros de etanol al matraz. Sonicar la muestra a 40 kilohercios durante dos minutos a temperatura ambiente. Cuando termine, coloque la muestra en el imán y retire el sobrenadante.

Dispersar las nanopartículas recubiertas de ácido oleico en 30 mililitros de cloroformo y sonicar a 40 kilohercios durante cinco minutos a temperatura ambiente. Tras la sonicación, transfiera 0,5 mililitros de las nanopartículas en una cubeta de vidrio y añada 0,5 mililitros de cloroformo. Compruebe el tamaño hidrodinámico de un zetasizer según las instrucciones del fabricante.

En este punto, disuelva 44.3 miligramos de permanganato de potasio y 150.4 miligramos de cloruro de benzoiltrimetil amonio en una mezcla de tres a dos de agua y cloroformo. Agregue la solución resultante a un Aliquat de 5 mililitros de las nanopartículas recubiertas de ácido oleico en un matraz adaptado para microondas. Inicie el protocolo de microondas para nanopartículas de ácido azelaico ajustando la temperatura a 105 grados Celsius, el tiempo a nueve minutos, la presión a 250 psi y la potencia a 300 vatios.

A continuación, añada 10 mililitros de tampón de fosfato de pH 2,9 al matraz. Después de repetir el protocolo de microondas y eliminar el sobrenadante, agregue 10 mililitros de agua al matraz y transfiera la mezcla a un matraz Erlenmeyer. El paso más crítico es la purificación de las nanopartículas de ácido azelaico.

A continuación, agregue 5 mililitros de bisulfato de sodio al 10 por ciento al matraz Erlenmeyer y sonique a 40 kilohercios durante dos minutos a 25 grados centígrados. Después de recolectar las partículas y eliminar el sobrenadante, lave las nanopartículas tres veces más con hidróxido de sodio al 1 por ciento. Redisperse las partículas en 5 mililitros de tampón de fosfato de pH 7,2.

Para comprobar el tamaño hidrodinámico y el potencial zeta, transfiera 0,7 mililitros de las nanopartículas de ácido azelaico a una célula capilar plegada desechable y colóquela en el zetasizador para su análisis. Añadir 12 miligramos de EDC y 15 miligramos de sulfo-NHS en un tubo de centrífuga con un Aliquat de 2 mililitros de las nanopartículas de ácido azelaico. Agite la mezcla a temperatura ambiente durante 35 minutos.

Después de colocar un imán debajo del tubo de centrífuga para desestabilizar las nanopartículas, aspire el sobrenadante y lave las partículas con 1,5 mililitros de tampón hepes de 1 milimolar. Luego, agregue 5 miligramos de neridronato y agite la mezcla durante dos horas. Separe las nanopartículas con un imán y lávelas con tampón hepes de 1 milimolar.

Finalmente, disperse las nanopartículas de neridronato en 2 mililitros de tampón hepes de 1 milimolar. Para comprobar el tamaño hidrodinámico y el potencial zeta, añada 0,7 mililitros de las nanopartículas de neridronato a una célula capilar plegada desechable y colóquela en el zetsizer para su análisis. Todas las nanopartículas presentaron un tamaño hidrodinámico pequeño en una distribución de tamaño muy estrecha.

Las partículas presentan una excelente cristalinidad como se muestra en las imágenes TEM. Además, se obtuvieron los mismos resultados para el tamaño y la distribución hidrodinámica después de cuatro repeticiones de la síntesis, lo que demuestra uno de los aspectos más importantes del enfoque de microondas, su reproducibilidad. Las propiedades de unión de iones de calcio debidas a los bifosfonatos presentes en las nanopartículas de neridronato se verificaron mediante relaxometría y demostraron que el tiempo de relajación de T2 aumenta linealmente con la cantidad de iones de calcio y el tiempo de incubación debido a la formación de grupos de nanopartículas, mientras que las nanopartículas sin iones de calcio permanecen estables.

Se realizaron experimentos de resonancia magnética in vivo en ratones knockout apoe de 48 semanas de edad y, una hora después de la inyección, la señal de la placa era hipointensa en comparación con las imágenes basales. Además, la proporción de placa a músculo fue significativamente diferente entre las imágenes basales y una hora después de la inyección. La señal en el hígado también se monitorizó después de la inyección de las nanopartículas de neridronato, que se eliminaron completamente de la circulación después de 20 minutos, lo que confirma la acumulación selectiva de estas nanopartículas hacia la placa aterosclerótica.

Se realizaron imágenes e histología ex vivo y las imágenes de aortas, con y sin nanopartículas, mostraron diferencias en la intensidad de la señal de acuerdo con los experimentos in vivo. Una vez dominada, la tecnología de microondas permite la caracterización de la síntesis y la detección de placas en un tiempo total de 3 horas si se realiza correctamente. Otra ventaja de este método es que, con una pequeña modificación, se pueden realizar otras técnicas de imagen, como la termografía, para responder a preguntas adicionales como la cuantificación de la aterosclerosis.

Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la imagen cardiovascular exploraran el diagnóstico precoz de la aterosclerosis con una configuración experimental que puede adaptarse fácilmente a las necesidades clínicas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo producir nanopartículas hidrofílicas de óxido de hierro con microondas y su aplicación en imágenes cardiovasculares. No olvide que trabajar con hornos microondas puede ser peligroso dependiendo del horno utilizado, y siempre se deben tomar precauciones como el control de la presión de la cisterna mientras se realiza este procedimiento.