Celular-como Stem

El objetivo general de este protocolo es utilizar explantes del techo del blastocele o de la región cap animal de x laevis para probar los mecanismos moleculares y los procesos celulares subyacentes al desarrollo neural in vitro e in vivo. Estos métodos pueden ayudar a responder preguntas clave en los campos de la biología del desarrollo y de las células madre sobre la adquisición del destino celular, la migración celular y las propiedades autónomas y no autónomas de las células neurales. Las técnicas presentadas proporcionan herramientas sencillas, económicas, versátiles y eficientes para explorar los mecanismos fundamentales de los comportamientos clave de las células neurales.

Estos ensayos permiten evaluar los determinantes del destino neural para la reprogramación de células madre pluripotentes inducidas y la generación madura de células derivadas del tejido neural, facilitando así el cribado. En general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades, ya que las técnicas requieren destreza manual. Tuve la idea original para estos métodos cuando estaba pensando en analizar el comportamiento de segregación celular.

Para montar planamente un tubo neural anterior de Xenopus laevis, utilice una pipeta de transferencia plástica para transferir un embrión fijado, deshidratado y rehidratado a una placa de Petri de 60 milímetros llena hasta el borde con PBT. A continuación, inserte un par de pinzas finas entre los ojos y el tubo neural a la altura del pedículo óptico y separe los ojos. Luego, introduzca cuidadosamente las pinzas debajo del ectodermo que recubre el tubo neural por detrás de la cabeza y desprenda cuidadosamente el ectodermo.

Después de realizar la transferencia de etiquetado por hibridación NC2 adecuada, transfiera el embrión a una nueva placa de Petri de 60 mililitros llena con PBT y use pinzas finas para aislar groseramente el tubo neural anterior del embrión. Luego, retire cuidadosamente la notocorda que está débilmente adherida por debajo del tubo neural. Si es necesario, también retire las vesículas óticas y las partes restantes del mesodermo.

Una vez que se hayan seccionado todos los apéndices del tubo neural, separe el tubo neural anterior del embrión. Luego, transfiera el tubo neural aislado a un tubo cónico de 1,5 mililitros lleno con glicerol al 50% en PBS para un tratamiento nocturno a cuatro grados Celsius. Tras un segundo tratamiento nocturno en glicerol al 90%, transfiera el tubo neural a una placa de microscopio en una pequeña cantidad de glicerol y use agujas de tungsteno para diseccionar los tubos neurales a lo largo de las líneas medias dorsal y ventral.

Luego, utilice anillos de refuerzo cubiertos con una laminilla de vidrio para montar ambos lados del tubo neural en glicerol al 90 % y PBS. Para preparar la perla para la inducción del explante de la tapa animal, use una micropipeta P200 para dividir la mitad de un alícuota de perlas de resina tratadas con BSA en un nuevo tubo de 1,5 mililitros. A continuación, reemplace el agua destilada estéril en el nuevo tubo con 200 microlitros de medio que contenga la molécula experimental de interés durante dos horas a cuatro grados Celsius.

Al finalizar la incubación, transfiera los embriones en estado de blástula o muy temprano en gastrulación a PBS con calcio y magnesio suplementado con BSA al 0,2%. A continuación, bajo un microscopio estereoscópico, pellizque la membrana vitelina con el costado de un par de pinzas y utilice un segundo par de pinzas para desprender lentamente la membrana desde el lado vegetal del embrión, teniendo cuidado de no dañar el lado animal. Luego, usando pinzas finas, corte un pequeño cuadrado desde el polo animal de cada embrión.

Utilizando una punta de pipeta recubierta con BSA, transfiera las tapas a pozos individuales de una placa multipozo Terasaki que contenga solución salina de Barth modificada al 0,5X, colocando el lado animal pigmentado en contacto con el fondo redondeado del pozo. Con una micropipeta P20, seleccione las perlas de color rosa más intenso del tubo de tratamiento y coloque una perla sobre cada tapa, utilizando pinzas para centrar las perlas en las tapas. Una vez colocada la última perla, coloque la placa sobre papel humedecido con agua y cúbrala con un recipiente de plástico antes de la incubación.

Para preparar explantes de casquetes animales disociados y reagregados, aísle 15 a 30 casquetes animales tal como se acaba de demostrar. Utilice fórceps finos para cortar un pequeño cuadrado de tejido de los polos animales. Transfiera los casquetes animales a un pocillo recubierto con agarosa que contenga solución salina de Holtfreter sin calcio, con sus caras pigmentadas hacia arriba.

Después de unos minutos, se debería observar la desagregación. Utilice pinzas finas para separar las capas pigmentadas del resto del tejido. Luego, use una micropipeta P20 para descartar el pigmento.

Cuando se hayan eliminado la mayoría de las capas pigmentadas y las células estén completamente disociadas, gire suavemente la placa para centrar las células y use una micropipeta P1000 para retirar la mayor cantidad posible del medio, teniendo cuidado de no tocar las células. A continuación, agregue un mililitro de solución salina de Holtfreter con calcio al pocillo. Transfiera los capuchones animales disociados a un tubo de 1,5 mililitros.

Después de centrifugar las células, utilice una micropipeta P1000 para retirar cuidadosamente el sobrenadante y resuspender el sedimento en 20 microlitros de solución salina de Holtfreter con calcio. Permita que las células se reagreguen durante tres a seis horas a temperatura ambiente. Luego, agregue lentamente un mililitro de NAM 3/4 para desprender cuidadosamente los explantes del fondo del tubo y utilice una pipeta de transferencia de plástico para distribuir los explantes en placas individuales no recubiertas.

Para implantar explantes de casquete animal en placas neurales de Xenopus laevis, primero recubra placas de Petri de 60 milímetros con agarosa al 3% y NAM 3/4 en las que se han hecho pequeños orificios. A continuación, transfiera embriones en etapa de neurula temprana a PBS con calcio y magnesio suplementado con BSA al 0,2% para la eliminación de la membrana vitelina. Luego, llene el recipiente de disección recubierto con agarosa con NAM fresco 3/4 y transfiera los embriones al recipiente de disección con la cara dorsal hacia arriba.

Ahora, transfiera un explante de casquete animal reagregado a la placa de disección, permitiendo que el explante se hunda lentamente en el recipiente por gravedad una vez que la punta de la pipeta haya atravesado la superficie de NAM. Luego, bajo un microscopio estereoscópico, use fórceps redondeados para sostener el embrión en su lugar mientras utiliza una aguja de tungsteno para realizar una incisión en la placa neural destinada al explante. Corte un pequeño fragmento del explante de casquete animal reagregado utilizando fórceps redondeados y un bisturí de ceja.

Utilice el fragmento de tejido para dimensionar un trozo de explante para el injerto. Esta figura muestra tubos neurales anteriores de X laevis y X tropicalis montados en plano como se acaba de demostrar en las etapas 30, 32 y 35 tras la hibridación doble en montaje completo con NC2. Como se observa en estas imágenes, se detecta la expresión de sonic hedgehog de Xenopus en células en contacto con perlas impregnadas en medio condicionado suplementado con el extremo C-terminal del gen sonic hedgehog, pero no en células en contacto con perlas tratadas con medio control.

Después de la disociación y reagregación como se acaba de demostrar, estos explantes con células del casquete animal anteriorizadas se mezclaron con células del casquete animal anteriorizadas que expresaban Otx2. Como se observó, estas células que expresaban Otx2 no se segregaron de las células que no expresaban Otx2. Ambos tipos de células se mezclaron libremente a lo largo del explante.

En contraste, en los explantes donde las células que expresaban Otx2 se mezclaron con células que expresaban BAR HL-2, Otx2 e IRX3, las células que expresaban múltiples genes formaron parches cohesionados que no se extendieron uniformemente dentro del explante reagregado. Cuando estos explantes mixtos, compuestos por células que coexpresaban BAR HL-2, Otx2 e IRX3 mezcladas con células que expresaban la porción N-terminal del sonic hedgehog, se injertaron en la placa neural anterior de embriones de x laevis tal como se acaba de demostrar, mostraron expresión endógena de sonic hedgehog y se segregaron de las células epiteliales neurales anteriores. Por otro lado, cuando explantes mixtos compuestos por células que expresaban Otx2 y la porción N-terminal del sonic hedgehog se injertaron en la placa neural de x laevis, las células injertadas no expresaron sonic hedgehog ni se segregaron de sus vecinas.

Una vez dominada, la técnica de injertar el explante del casquete animal en placas neurales embrionarias puede realizarse en dos o tres horas, dependiendo del número de embriones injertados. Es una técnica muy robusta y muy satisfactoria. Al intentar este procedimiento, es fundamental tener extrema precaución con la contaminación bacteriana y fúngica.

Tras los procedimientos de injerto, se pueden realizar otros métodos como la hibridación in situ en preparación total para seguir las líneas celulares y los comportamientos de las células injertadas. Los programas de desarrollo que subyacen a la organogénesis del tubo neural están ampliamente conservados, especialmente en vertebrados. Por lo tanto, la información obtenida en anfibios ha profundizado nuestra comprensión de los procesos celulares y moleculares que subyacen al desarrollo de vertebrados.