Name: Celular-como Stem Xenopus Embrionarias explantes para Estudiar Características Temprana del Desarrollo Neural In Vitro Y En Vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Aprende a utilizar explantes de techo de blastocelo de Xenopus laevis para estudiar mecanismos moleculares del desarrollo neural in vitro e in vivo. Estas técnicas versátiles permiten investigar la adquisición de destino celular y migración.

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El autor agradece a Hugo Juraver-Geslin, Marion Wassef y Anne Hélène Monsoro-Burq por su ayuda y consejos, y al Animalario del Institut Curie. El autor agradece a Paul Johnson por su trabajo de edición en el manuscrito. Este trabajo ha contado con el apoyo del Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS UMR8197, INSERM U1024) y por subvenciones de la "Association pour la Recherche sur le Cancer" (ARC 4972 y ARC 5115; FRC DOC20120605233 y LABEX Memolife) y la Fundación Pierre Gilles de Gennes (FPGG0039).

Los experimentos cumplen con la regulación nacional y europea sobre la protección de los animales utilizados para fines científicos y con los principios establecidos a nivel internacional de sustitución, reducción y refinamiento. 1.-montaje plana de Xenopus laevis renacuajos anterior Tubo Neural Después de todo el montaje hibridación in situ <ol><li> Obtener X. laevis embriones según los procedimientos estándar de 4 y los años hasta que alcancen neurula etapa 26 y más años (según Nieuwkoop y Faber mesa de desarrollo 17. </li><li> Fix X. laevis renacuajos mediante su incubación en una solución de 4% de paraformaldehído (PFA). Roca y rotar los embriones en un vial de vidrio de 2 ml, de 1 a 1.5 hr a RT durante la etapa 26 a la etapa 38 embriones, 2 horas a RT para los embriones en etapas posteriores. PRECAUCIÓN: PFA es tóxico por contacto y un posible carcinógeno. Debe ser manipulado bajo una campana. NOTA: Uno X. laevis cría espor lo general fijado en un vial de vidrio de 2 ml, pero un vial de vidrio más grande puede ser utilizado. </li><li> Lavar los embriones en el mismo vial utilizando 1x PBS con 0,1% de Tween (PBT), 3 min a RT, dos veces. NOTA: A menos que de otro modo especificar el PBS utilizado es con o sin calcio y magnesio. </li><li> Deshidratar los embriones en 100% de metanol (MeOH) durante al menos 12 horas a RT en el mismo vial. Cambie el MeOH 100% al menos dos veces bajo el capó con una micropipeta de plástico. NOTA: El MeOH se vuelve ligeramente amarillo como lípidos disueltos en ella. Precaución al MeOH es tóxico por inhalación y debe manipularse bajo una campana. </li><li> Rehidratar los embriones utilizando el mismo vial a través de una serie graduada de baños de MeOH: MeOH 75% en PBS, MeOH 50% en PBS, MeOH 25% en PBS, PBS dos veces, cada baño de 5-10 minutos a TA. Las soluciones de MeOH se cambian bajo el capó con una micropipeta de plástico. </li><li> Usando una pipeta de plástico, la transferencia del embrión a ser disecado en una placa de Petri de 60 mm lleno hasta el tope con PBT. El uso de dos pinzas finas cuidadoeliminar totalmente los ojos mediante la inserción de uno pinzas finas entre los ojos y el tubo neural, a nivel del tallo óptico. Separe los ojos del tubo neural. Introducir con cuidado la pinza por debajo del ectodermo que recubren el tubo neural. Con cuidado, retire el ectodermo partiendo de detrás de la cabeza y lo descarta. </li><li> Realice una ISH doble o individual utilizando digoxigenina-etiquetados o sondas marcadas con fluoresceína como anteriormente descritos 18,19. </li><li> Después de la ISH transferir los embriones de un nuevo 60 mm placa de Petri llena hasta el tope con PBT con una pipeta de plástico. </li><li> Usando unas pinzas finas separar cuidadosamente el tubo neural del resto del embrión. En esta etapa, el tubo neural anterior se separa del tubo neural posterior. Separar cuidadosamente restantes partes del ectodermo que recubren el tubo neural, la notocorda que se adjunta suelta debajo del tubo neural, las vesículas óticas y restantes partes del mesodermo. Asegúrese de que el tubo neural está desprovisto de cualquier apéndiceen este punto. NOTA: Para evitar daños en el tubo neural realizar todas las transferencias de tubo / embrión neuronal con una pipeta de transferencia de plástico o una micropipeta si es necesario con un corte de punta en su extremo. El diámetro del extremo de la punta se ajusta al tamaño del tubo neural. </li><li> Transferir el tubo neural diseccionado (ver nota paso 1,9) en un tubo de 1,5 ml lleno con 50% de glicerol diluido en PBS. Espere hasta que los tubos neurales han caído a la parte inferior de la solución de glicerol, por lo general O / N a 4 ° C. </li><li> Retirar la solución de 50% de glicerol / PBS utilizando una micropipeta P1000 y añadir en el mismo tubo de 1,5 ml de una solución de 90% de glicerol / PBS utilizando una micropipeta P1000. Espere hasta que los tubos neurales caen hacia el fondo de la solución de 90% de glicerol / PBS, por lo general O / N a 4 ° C. NOTA: para almacenamiento a largo plazo, utilizar 90% de glicerol / PBS más antibióticos para prevenir el desarrollo de bacterias. </li><li> Transferir los tubos neurales en una placa de vidrio, o un portaobjetos de microscopio con una pipeta de transferencia de plástico. </li><li> Dissecta de los tubos neurales a lo largo de la dorsal y ventral líneas medias utilizando agujas de tungsteno. Durante ese paso de los tubos neurales se mantienen en 90% de glicerol / PBS. </li><li> Montar los dos lados del tubo neural en 90% de glicerol / PBS utilizando anillos de refuerzo cubiertos con un cubreobjetos de vidrio. </li><li> Fijar los cubreobjetos con barniz y mantener a 4 ° C. </li></ol> 2. Cap Animal explantes de inducción usando perlas de resina de intercambio de aniones <ol><li> Transferir 100 l de perlas de resina de intercambio aniónico en un tubo de 2 ml utilizando una micropipeta P1000. Lavar las perlas por lo menos cinco veces consecutivas con agua destilada estéril. Permitir que las perlas se sedimentan en la parte inferior del tubo y reemplazar el agua destilada estéril utilizando una micropipeta P1000. No toque las bolas. </li><li> Deje que los granos en remojo O / N en un tubo de 2 ml llena de agua destilada estéril con albúmina de suero bovino (BSA) (10 mg / ml) a 4 ° C. </li><li> Dos horas antes de la recogida de las CCAA, coloque la mitad de los granos en un nuevo 1,5 mltubo usando una micropipeta P1000. Reemplazar el agua destilada estéril con 500 l de medio que contiene la molécula a ensayar por su potencial inductivo, o sabe que inducen un destino específico. Mantenga la otra mitad de las perlas, ya que se pueden utilizar como un control negativo. </li><li> Incubar las perlas a 4 ° C durante al menos 2 hr. </li><li> Llevar a cabo todos los pasos subsiguientes bajo el microscopio estereoscópico y realizar todas las transferencias de CA con una micropipeta. </li><li> Transferencia de embriones o blástula gástrula muy tempranas en PBS con calcio y magnesio complementado con 0,2% de BSA utilizando una pipeta de transferencia de plástico. NOTA: Los embriones en desarrollo a los 12 ° C blástula y gástrula etapas alcance de 20 a 24 horas. </li><li> Retirar membrana vitelina del embrión utilizando pinzas 20 como se describió anteriormente. Fijar el embrión con uno fórceps. Pellizcar la membrana vitelina con el lado de las otras pinzas. La celebración de la membrana, lentamente despegarlo del embrión. Realice este procedimiento en la venlado del embrión tral (vegetal). No dañe el lado animal del embrión. </li><li> Aislar pequeñas CCAA como se describió anteriormente 21. El polo animal es parte pigmentada del embrión. Usando unas pinzas finas cortan un pequeño cuadrado de tejido fuera del polo animal. El tejido AC contiene sólo las células ectodérmicas. Asegúrese de que el tejido es de espesor uniforme. Si no es así, retire la AC del análisis. </li><li> Coloque cada CA en unos Terasaki placas de múltiples pocillos en 0.5x modificados de Barth salinos (MBS) 4. Coloque el AC en el pozo con su lado animal pigmentada abajo, en contacto con el fondo redondo del pozo. NOTA: pipetas de recubrimiento con una solución de BSA 0,1% impide la adherencia de pequeños trozos de tejido adhesivo para el plástico. </li><li> Coloque una perla en cada tapa usando una micropipeta P20. Si es necesario, el uso de fórceps para colocar cuidadosamente la perla en el centro de la tapa. NOTA: Cuando empapado en un medio acondicionado, las perlas son de color de rosa. Seleccione la mayor cantidad de coperlas lored. </li><li> Se incuba a RT (18 a 22 ° C) durante 6 horas sin mover la placa de múltiples pocillos Terasaki. El cordón se adhiere a la AC en menos de 2 hr. </li><li> Coloque la placa de múltiples pocillos Terasaki en la parte superior de papeles empapados en agua. Cubra la placa con un recipiente de plástico. NOTA: Este &#39;cámara de humedad&#39; evita la evaporación prematura de los pozos. </li><li> Cultura de la CCAA en 0.5x MBS o 3.4 NAM (véase el paso 4.1) en la cámara de humedad a 15-20 ° C hasta que los embriones hermanos han llegado a la etapa correcta para probar el efecto de su factor. </li><li> Fijar las CCAA durante 1 hora en el recién preparada PFA al 4%. Deshidratar las CCAA en 100% MeOH como se ha descrito previamente (Paso 1.4). </li></ol> 3. Animal Cap Disociación Celular y reagregación antes del injerto en un Xenopus laevis neurula <ol><li> Escudo placas de Petri (60 mm) o 12 pozos placas con 3% de agarosa en agua estéril o en PBS sin calcio y magnesio. Agregar suficiente agarosa para cubrir la bottom de la placa de Petri o el pozo. Pre-calentar las placas a temperatura ambiente (18-22 ° C). Opcionalmente, almacenado las placas durante dos días a 4 ° C para evitar la deshidratación. </li><li> Preparar libre de calcio solución salina de Holtfreter (NaCl 60 mM, 0,7 mM KCl, 4,6 mM HEPES, 0,1% BSA (A-7888 Sigma pH 7,6)) y solución salina de Holtfreter (NaCl 60 mM, 0,7 mM KCl, 0,9 mM CaCl 2, 4,6 mM HEPES, 0,1% BSA pH 7,6) 5. NOTA: la solución de CaCl 2 no puede esterilizarse en autoclave. </li><li> Llene la agarosa recubiertas de bien en la parte superior con solución salina libre de calcio de Holtfreter. </li><li> Prepare blástula o embriones gástrula muy tempranas para aislar sus CCAA como se describió anteriormente (pasos 2,5 a 2,7). </li><li> Aislar al menos 15 o hasta 30, pequeña CCAA 21. Usando unas pinzas finas cortan un pequeño cuadrado de tejido fuera del polo animal. El tejido AC sólo contiene células ectodérmicas y por lo tanto es de espesor uniforme. Si no es así, retire la AC del análisis. NOTA: El polo animal es la Embryparte pigmentada del o. </li><li> Transferencia de las CCAA en una agarosa recubiertas de bien lleno hasta el tope con-calcio libre de solución salina de Holtfreter. Coloque las CCAA con el frente de su lado pigmentado hacia arriba. NOTA: El proceso de disociación comienza rápidamente en libre de calcio salina de Holtfreter. </li><li> Espere unos minutos para que las células empiezan a disociar. Observar esto a través de la desagregación de los tejidos. Usando unas pinzas finas, separar la capa pigmentada desde el resto de la AC y desecharlos con una micropipeta P20. Completar el proceso de disociación celular indica separación de las células entre sí. NOTA: Uno o dos capas pigmentadas se pueden dejar en el explante re-agregado para ayudar a la visualización durante el injerto. </li><li> Centrar las células usando movimientos circulares de la placa. Usando una micropipeta P1000 retire con cuidado todo medio posible. Tenga cuidado de no tocar las células. </li><li> Añadir 1 ml de solución salina de Holtfreter con el calcio para el pozo. Transfiera las CCAA disociadasen un tubo de 1,5 ml. NOTA: 2 ml tubos no se pueden utilizar debido a su fondo redondo. </li><li> Sedimentar las células por centrifugación, 5 min a una velocidad máxima de 2000 rpm para una centrífuga de mesa (500 xg). Retire con cuidado el sobrenadante con una micropipeta P1000. </li><li> Añadir a las células disociadas 20 l de solución salina de Holtfreter con calcio (NaCl 60 mM, 0,7 mM KCl, 0,9 mM CaCl 2, 4,6 mM HEPES, 0,1% de BSA (Sigma A-7888 pH 7,6) 5. </li><li> Mantenga las CCAA disociado, de 3 a 6 horas a temperatura ambiente (18-22 ° C). NOTA: Este es tiempo necesario para que las células se re-agregado. El re-agregación es visible como las células forman una pequeña bola en la parte inferior del tubo. </li><li> Separar el explante cuidadosamente de la parte inferior del tubo mediante la adición de 1 ml de 0.5X MBS o de 1 ml de 3/4 NAM (véase el paso 4.1). Transferir el explante en una placa de un-revestido con una pipeta de transferencia de plástico. </li><li> Etapa los explantes utilizando sus hermanos de control. Para utilizar la cultura antibióticos a largo plazo: kanamycin (50 g / ml), ampicilina (50 mg / ml) y gentamicina (50 mg / ml). </li></ol> 4. Injerto de Animal Caps explantes en la placa neural de X. laevis Embriones <ol><li> Preparar 3 cuartos NAM (NaCl 110 mM, KCl 2 mM, 1 mM Ca (NO 3) 2, 1 mM MgSO 4, EDTA 0,1 mM, 1 mM NaHCO 3, 0,2x PBS, 50 mg / ml de gentamicina). No mantener durante más de 1 semana para la disección y se almacena a 4 ° C. NAM Mayor se puede utilizar para la preparación de platos de disección de agarosa recubiertas con (abajo). </li><li> Placas de Petri Escudo (60 mm) con un 3% de agarosa en 3.4 NAM en la que los pequeños agujeros se han realizado utilizando un molde de silicona, o la tapa de una raqueta de tenis de mesa. NOTA: La agarosa cubre la parte inferior de la placa de Petri. Deje algo de espacio para que la placa de Petri se llene de 3/4 NAM. Alternativamente hacer platos de disección con la no-sequedad plastilina. Dentro de la arcilla, apretar los embriones ligeramente durante el procedimiento de disección. Dig pequeños agujeros en elagarosa utilizando pinzas redondeadas Este &#39;plato de disección&#39; ayuda a mantener los embriones durante el procedimiento de disección. </li><li> Recoger herramientas de disección: pipetas de transferencia de plástico, un &quot;cuchillo de la ceja &#39;(hecho con pelo de las cejas embebidos en parafina en la punta de una pipeta Pasteur de vidrio) 22, dos pinzas de disección finas, micropipeta P1000 y consejos, un stereosmicroscope con magnificación 8-40X, una fuente de luz brillante con guías de fibra óptica. Mantenga todas las herramientas de disección limpia; después de cada experimento, enjuagarlos dos veces con agua destilada, una vez con etanol al 100% y deje secar. Almacene lejos del polvo y si autoclave necesarias las herramientas de disección metal. </li><li> Deje que la disociada y re-agregado CCAA (protocolo 3), y sus hermanos X. embriones laevis desarrollan hasta alcanzar la etapa 13 (neurula) según Nieuwkoop y Faber mesa de desarrollo 17. Para el trasplante dentro de la etapa placa neural 13 a la etapa 15 embriones se utilizan. </li><li> Llevar a cabo todasetapas subsiguientes bajo el microscopio estereoscópico. </li><li> Usando una pipeta de transferencia de plástico, la transferencia de los embriones en PBS con calcio y magnesio complementado con 0,2% de BSA. Retirar membrana vitelina del embrión a lo descrito previamente 20. Fijar el embrión con uno fórceps. Pellizcar la membrana vitelina con el lado de las otras pinzas. La celebración de la membrana con firmeza, lentamente despegarlo del embrión. NOTA: Realice este procedimiento en la parte ventral (vegetal) del embrión. No dañe los embriones placa neural. Si los embriones han sido dañados durante la etapa de eliminación de la membrana vitelina, la transferencia de los embriones en una placa de Petri de 60 mm que contiene 3/4 NAM utilizando una pipeta de transferencia de plástico y esperar 15 minutos, un tiempo suficiente para el proceso de curación que se produzca. </li><li> Rellene el plato de la disección a la cima con frescos 3.4 NAM. </li><li> Con una pipeta de transferencia de plástico, la transferencia de los embriones sin su membrana vitelina en el plato de la disección. Coloca los embriones lado dorsal arriba enlos pozos. Durante el proceso de transferencia no permita que el embrión para entrar en contacto con la interfase aire-líquido desde X. laevis se lisan por la tensión superficial. </li><li> Transferir el explante de CA para ser injertado en la placa de disección con una pipeta de transferencia de plástico o una micropipeta P1000. Una vez que la pipeta está dentro del líquido, permitir que los explantes a hundirse lentamente hacia abajo por la gravedad, o empujar con mucha suavidad. </li><li> Mantener los embriones con fórceps redondeadas. Con el cuchillo de la ceja hacer una incisión en la placa neural donde va a injertar pieza de su explante. NOTA: En la etapa 14 la curvatura anterior de la placa neural se puede utilizar como punto de referencia, que marca el territorio diencéfalo (Figura 4). </li><li> Corte un pequeño trozo de neuroepitelio, utilizando pinzas redondeadas y un knive ceja. Corte un pequeño trozo del explante con el cuchillo de la ceja. NOTA: La pieza de explante debe ser aproximadamente del mismo tamaño y forma que la zona de ablación neuroepitelio. </li&gt; <li> Coloque la pieza de explante en la incisión neuroepitelio usando el cuchillo ceja y unas pinzas finas. Asegúrese de que el explante se une rápidamente al embrión. </li><li> Alternativamente coloque un pedazo de cubreobjetos de vidrio en el embrión injertada para mantener el injerto en su lugar. Para ello, cortar un cubreobjetos de vidrio fino en pedazos muy pequeños utilizando pinzas gruesas. Asegúrese de que el tamaño es de aproximadamente 1,5 mm 2. Sumerja las piezas en una placa de Petri que contiene 3/4 NAM o PBS utilizando fórceps. Elige un pedazo de vidrio más grande que el embrión para evitar dañarlo. El embrión será un poco aplanada. </li><li> Espere al menos 30 minutos sin moverse o sólo mover la placa de disección con suavidad. Deje el embrión recuperar durante 30 min a 2 hr y retire con cuidado el cubreobjetos si es necesario. Pipetear con cuidado los embriones injertadas en un plato limpio lleno de 03.04 NAM, usando la pipeta de transferencia de plástico. NOTA: Injertado embriones tienden a desarrollar bacterias o contaminación de hongos. Para largo plazo cULTURA usar antibióticos: kanamicina (50 mg / ml), ampicilina (50 g / ml) y gentamicina (50 mg / ml). </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Desarrollo neuronal es orquestada por una compleja interacción entre los programas de desarrollo celulares y señales de los tejidos circundantes (revisado en 3,31,32). Aquí se describe un conjunto de protocolos que se puede utilizar en X. laevis embriones para explorar factores extrínsecos e intrínsecos que intervienen en la determinación del destino neural y la morfogénesis neuronal in vitro e in vivo. Estos protocolos pueden ser utilizados como tales en X. embriones t...

El sistema nervioso de los vertebrados emerge de la placa neural como una capa homogénea de células neuroepiteliales. La comprensión de cómo se inducen los programas de desarrollo, codificados, y establecieron durante la regionalización de la placa neural es, en la actualidad, una meta importante en la biología del desarrollo. En comparación con otros sistemas, el embrión Xenopus experimentalmente susceptible es un modelo de elección para el análisis de los primeros pasos de 1,2 desarrollo neural. Es fácil de obtener un gran número de embriones, y el desarrollo externo da acceso a los primeros pasos de neurulation 3. Muchas herramientas están disponibles para manipular experimentalmente Xenopus laevis (X. laevis) el desarrollo embrionario. Micro-inyección de ARNm o morfolinos (MO), incluyendo OMs inducibles, junto con herramientas bioquímicas y farmacológicas, permite ganancia de función (GOF) y pérdida de función (LOF) y la alteración específica de las vías de señalización 4,5 controlada. El blastocoel techo ectodermo, situado alrededor del polo animal de una blástula, o un embrión gástrula muy temprano, y se refiere como el &quot;Cap Animal &#39;(AC), es una fuente de células pluripotentes que puede ser programado por la manipulación de la expresión génica antes de la explantes preparación. En este manuscrito son protocolos detallados para utilizar X. explantes laevis AC para poner a prueba in vitro e in vivo mecanismos moleculares y procesos celulares desarrollo neuronal subyacente. Una técnica se presenta, lo que permite la observación multa de patrones de expresión génica en un tubo neural renacuajo Xenopus, un paso preliminar en la identificación de señales de determinación de destino. Considerando que la observación de los tejidos planos montado se utiliza comúnmente en el estudio de embriones de pollo 6, no ha sido descrito adecuadamente en Xenopus. La manipulación de la expresión génica mediante la inyección de ARNm sintético o MO en los blastómeros de 2 o 4 embriones en fase celular permite la programación de ACexplantes 4. Por ejemplo inhibición de la vía proteína morfogenética ósea (BMP) por la expresión del anti-factor de BMP Noggin, da una identidad neural a las células de CA 3. El protocolo se detalla para llevar a cabo la exposición local y controlada en el tiempo de los explantes de corriente alterna a las señales extrínsecas a través de contacto directo con una perla de resina de intercambio aniónico. Finalmente se describe una técnica para el ensayo de características de desarrollo de los progenitores neurales in vivo mediante trasplante de explantes mixtos preparados a partir de células distintas programado disociados y re-asociados. El embrión de rana es un poderoso modelo para estudiar el desarrollo neuronal temprana de los vertebrados. La combinación de la manipulación de la expresión génica con la explantación cultivos in vitro proporciona información importante en el estudio de la regionalización neuroepitelio, la proliferación, y la morfogénesis 7-12. La programación de los explantes de CA permitido el desarrollo de un corazón funcional ex vivo 13,14. El usoexplante de injerto 15 condujo a la identificación del interruptor transcripcional mínimo inducir el programa de diferenciación de la cresta neural 16. La zona limitante intratalámica (ZLI) es un centro de señalización que segrega sonic hedgehog (Shh) para controlar el crecimiento y la regionalización del prosencéfalo caudal. Cuando se expone continuamente a Shh, las células neuroepiteliales coexpressing los genes del factor de tres de transcripción - BARH-como homeobox-2 (barhl2), orthodenticle-2 (Otx2) y iroquois-3 (Irx3) - adquieren dos características del compartimento ZLI: la competencia para expresar shh, y la capacidad para segregar a partir de células de la placa neural anterior. Como un sistema modelo, la inducción de un destino ZLI en células neuroepiteliales será presentado 8. Estos protocolos tienen por objeto proporcionar y herramientas eficientes simples, baratas para los biólogos del desarrollo y otros investigadores para explorar el mec fundamentalhanisms de comportamientos clave de células neuronales. Estos protocolos son muy versátiles y permiten la investigación de una amplia gama de señales de determinación neuronales intrínsecos y extrínsecos. Permite a largo plazo en el análisis in vivo de compromiso de linaje neuronal, interacciones inductivas y comportamientos celulares.

<table><tbody><tr><td>Paraformaldehído</td><td>VWR</td><td>&nbsp; 20909.290</td><td>Perlas de</td></tr><tr><td>resina de intercambio aniónico</td> tóxico <td>Biorad</td><td>140- 1231</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina&nbsp;</td><td>SIGMA</td><td>A-7888</td><td>Para el cultivo de capuchón animalpH 7.6</td></tr><tr><td>Gentamicina&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>15751-045&nbsp;</td><td>antibiótico</td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>SIGMA</td><td>A7906</td><td>&nbsp; para la preparación de cordones</td></tr></tbody></table>

celular-como stem<em&gt; xenopus</em&gt; embrionarias explantes para estudiar características temprana del desarrollo neural<em&gt; in vitro</em&gt; y<em&gt; en vivo</em

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Comprender los programas genéticos que subyacen al desarrollo neuronal es un objetivo importante de la biología del desarrollo y de las células madre. En la blástula de los anfibios, las células del techo del blastocoel son pluripotentes. Estas células pueden ser aisladas y programadas para generar varios tejidos a través de la manipulación de la expresión de genes o la inducción por morfógenos. En este manuscrito se describen los protocolos para el uso de explantes de techo de blastocoel de Xenopus laevis como sistema de ensayo para investigar las características clave in vivo e in vitro del desarrollo neuronal temprano. Estos protocolos permiten la investigación de la adquisición del destino, los comportamientos de migración celular y las propiedades autónomas y no autónomas de la célula. Los explantes de techo de blastocoel pueden cultivarse en un medio definido libre de suero e injertarse en embriones hospedadores. Este trasplante en un embrión permite investigar el compromiso del linaje a largo plazo, las propiedades inductivas y el comportamiento de las células trasplantadas in vivo. Estos ensayos pueden aprovecharse para investigar los mecanismos moleculares, los procesos celulares y las redes reguladoras de genes que subyacen al desarrollo neuronal. En el contexto de la medicina regenerativa, estos ensayos proporcionan un medio para generar tipos de células derivadas de neuronas in vitro que podrían utilizarse en el cribado de fármacos.

En base a consideraciones morfológicas en diferentes especies, las manipulaciones embriológicas, y el patrón de expresión de genes reguladores, un modelo conceptual sostiene que la placa neural se divide en segmentos transversales y longitudinales que definen una rejilla de desarrollo generar campos histogenic distintas. En la placa neural, los primordios del prosencéfalo, mesencéfalo, cerebelo y la médula espinal están todos ya establecidos a lo largo del eje antero-posterior (AP) duran...

En los embriones de Xenopus, las células del techo del blastocelo son pluripotentes y pueden programarse para generar varios tejidos. Aquí, describimos los protocolos para usar explantes de techo de blastocoel de anfibios como un sistema de ensayo para investigar las características clave in vivo e in vitro del desarrollo neuronal temprano.

Celular-como Stem<em&gt; Xenopus</em&gt; Embrionarias explantes para Estudiar Características Temprana del Desarrollo Neural<em&gt; In Vitro</em&gt; Y<em&gt; En Vivo</em

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, ...

El objetivo general de este protocolo es utilizar explantes del techo del blastocele o de la región cap animal de x laevis para probar los mecanismos moleculares y los procesos celulares subyacentes al desarrollo neural in vitro e in vivo. Estos métodos pueden ayudar a responder preguntas clave en los campos de la biología del desarrollo y de las células madre sobre la adquisición del destino celular, la migración celular y las propiedades autónomas y no autónomas de las células neurales. Las técnicas presentadas proporcionan herramientas sencillas, económicas, versátiles y eficientes para explorar los mecanismos fundamentales de los comportamientos clave de las células neurales.Estos ensayos permiten evaluar los determinantes del destino neural para la reprogramación de células madre pluripotentes inducidas y la generación madura de células derivadas del tejido neural, facilitando así el cribado. En general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades, ya que las técnicas requieren destreza manual. Tuve la idea original para estos métodos cuando estaba pensando en analizar el comportamiento de segregación celular.Para montar planamente un tubo neural anterior de Xenopus laevis, utilice una pipeta de transferencia plástica para transferir un embrión fijado, deshidratado y rehidratado a una placa de Petri de 60 milímetros llena hasta el borde con PBT. A continuación, inserte un par de pinzas finas entre los ojos y el tubo neural a la altura del pedículo óptico y separe los ojos. Luego, introduzca cuidadosamente las pinzas debajo del ectodermo que recubre el tubo neural por detrás de la cabeza y desprenda cuidadosamente el ectodermo.Después de realizar la transferencia de etiquetado por hibridación NC2 adecuada, transfiera el embrión a una nueva placa de Petri de 60 mililitros llena con PBT y use pinzas finas para aislar groseramente el tubo neural anterior del embrión. Luego, retire cuidadosamente la notocorda que está débilmente adherida por debajo del tubo neural. Si es necesario, también retire las vesículas óticas y las partes restantes del mesodermo.Una vez que se hayan seccionado todos los apéndices del tubo neural, separe el tubo neural anterior del embrión. Luego, transfiera el tubo neural aislado a un tubo cónico de 1,5 mililitros lleno con glicerol al 50% en PBS para un tratamiento nocturno a cuatro grados Celsius. Tras un segundo tratamiento nocturno en glicerol al 90%, transfiera el tubo neural a una placa de microscopio en una pequeña cantidad de glicerol y use agujas de tungsteno para diseccionar los tubos neurales a lo largo de las líneas medias dorsal y ventral.Luego, utilice anillos de refuerzo cubiertos con una laminilla de vidrio para montar ambos lados del tubo neural en glicerol al 90 % y PBS. Para preparar la perla para la inducción del explante de la tapa animal, use una micropipeta P200 para dividir la mitad de un alícuota de perlas de resina tratadas con BSA en un nuevo tubo de 1,5 mililitros. A continuación, reemplace el agua destilada estéril en el nuevo tubo con 200 microlitros de medio que contenga la molécula experimental de interés durante dos horas a cuatro grados Celsius.Al finalizar la incubación, transfiera los embriones en estado de blástula o muy temprano en gastrulación a PBS con calcio y magnesio suplementado con BSA al 0,2%. A continuación, bajo un microscopio estereoscópico, pellizque la membrana vitelina con el costado de un par de pinzas y utilice un segundo par de pinzas para desprender lentamente la membrana desde el lado vegetal del embrión, teniendo cuidado de no dañar el lado animal. Luego, usando pinzas finas, corte un pequeño cuadrado desde el polo animal de cada embrión.Utilizando una punta de pipeta recubierta con BSA, transfiera las tapas a pozos individuales de una placa multipozo Terasaki que contenga solución salina de Barth modificada al 0,5X, colocando el lado animal pigmentado en contacto con el fondo redondeado del pozo. Con una micropipeta P20, seleccione las perlas de color rosa más intenso del tubo de tratamiento y coloque una perla sobre cada tapa, utilizando pinzas para centrar las perlas en las tapas. Una vez colocada la última perla, coloque la placa sobre papel humedecido con agua y cúbrala con un recipiente de plástico antes de la incubación.Para preparar explantes de casquetes animales disociados y reagregados, aísle 15 a 30 casquetes animales tal como se acaba de demostrar. Utilice fórceps finos para cortar un pequeño cuadrado de tejido de los polos animales. Transfiera los casquetes animales a un pocillo recubierto con agarosa que contenga solución salina de Holtfreter sin calcio, con sus caras pigmentadas hacia arriba.Después de unos minutos, se debería observar la desagregación. Utilice pinzas finas para separar las capas pigmentadas del resto del tejido. Luego, use una micropipeta P20 para descartar el pigmento.Cuando se hayan eliminado la mayoría de las capas pigmentadas y las células estén completamente disociadas, gire suavemente la placa para centrar las células y use una micropipeta P1000 para retirar la mayor cantidad posible del medio, teniendo cuidado de no tocar las células. A continuación, agregue un mililitro de solución salina de Holtfreter con calcio al pocillo. Transfiera los capuchones animales disociados a un tubo de 1,5 mililitros.Después de centrifugar las células, utilice una micropipeta P1000 para retirar cuidadosamente el sobrenadante y resuspender el sedimento en 20 microlitros de solución salina de Holtfreter con calcio. Permita que las células se reagreguen durante tres a seis horas a temperatura ambiente. Luego, agregue lentamente un mililitro de NAM 3/4 para desprender cuidadosamente los explantes del fondo del tubo y utilice una pipeta de transferencia de plástico para distribuir los explantes en placas individuales no recubiertas.Para implantar explantes de casquete animal en placas neurales de Xenopus laevis, primero recubra placas de Petri de 60 milímetros con agarosa al 3% y NAM 3/4 en las que se han hecho pequeños orificios. A continuación, transfiera embriones en etapa de neurula temprana a PBS con calcio y magnesio suplementado con BSA al 0,2% para la eliminación de la membrana vitelina. Luego, llene el recipiente de disección recubierto con agarosa con NAM fresco 3/4 y transfiera los embriones al recipiente de disección con la cara dorsal hacia arriba.Ahora, transfiera un explante de casquete animal reagregado a la placa de disección, permitiendo que el explante se hunda lentamente en el recipiente por gravedad una vez que la punta de la pipeta haya atravesado la superficie de NAM. Luego, bajo un microscopio estereoscópico, use fórceps redondeados para sostener el embrión en su lugar mientras utiliza una aguja de tungsteno para realizar una incisión en la placa neural destinada al explante. Corte un pequeño fragmento del explante de casquete animal reagregado utilizando fórceps redondeados y un bisturí de ceja.Utilice el fragmento de tejido para dimensionar un trozo de explante para el injerto. Esta figura muestra tubos neurales anteriores de X laevis y X tropicalis montados en plano como se acaba de demostrar en las etapas 30, 32 y 35 tras la hibridación doble en montaje completo con NC2. Como se observa en estas imágenes, se detecta la expresión de sonic hedgehog de Xenopus en células en contacto con perlas impregnadas en medio condicionado suplementado con el extremo C-terminal del gen sonic hedgehog, pero no en células en contacto con perlas tratadas con medio control.Después de la disociación y reagregación como se acaba de demostrar, estos explantes con células del casquete animal anteriorizadas se mezclaron con células del casquete animal anteriorizadas que expresaban Otx2. Como se observó, estas células que expresaban Otx2 no se segregaron de las células que no expresaban Otx2. Ambos tipos de células se mezclaron libremente a lo largo del explante.En contraste, en los explantes donde las células que expresaban Otx2 se mezclaron con células que expresaban BAR HL-2, Otx2 e IRX3, las células que expresaban múltiples genes formaron parches cohesionados que no se extendieron uniformemente dentro del explante reagregado. Cuando estos explantes mixtos, compuestos por células que coexpresaban BAR HL-2, Otx2 e IRX3 mezcladas con células que expresaban la porción N-terminal del sonic hedgehog, se injertaron en la placa neural anterior de embriones de x laevis tal como se acaba de demostrar, mostraron expresión endógena de sonic hedgehog y se segregaron de las células epiteliales neurales anteriores. Por otro lado, cuando explantes mixtos compuestos por células que expresaban Otx2 y la porción N-terminal del sonic hedgehog se injertaron en la placa neural de x laevis, las células injertadas no expresaron sonic hedgehog ni se segregaron de sus vecinas.Una vez dominada, la técnica de injertar el explante del casquete animal en placas neurales embrionarias puede realizarse en dos o tres horas, dependiendo del número de embriones injertados. Es una técnica muy robusta y muy satisfactoria. Al intentar este procedimiento, es fundamental tener extrema precaución con la contaminación bacteriana y fúngica.Tras los procedimientos de injerto, se pueden realizar otros métodos como la hibridación in situ en preparación total para seguir las líneas celulares y los comportamientos de las células injertadas. Los programas de desarrollo que subyacen a la organogénesis del tubo neural están ampliamente conservados, especialmente en vertebrados. Por lo tanto, la información obtenida en anfibios ha profundizado nuestra comprensión de los procesos celulares y moleculares que subyacen al desarrollo de vertebrados.

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Investigación

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