Name: La cuantificación de Natación de peces comportamiento en respuesta a la exposición aguda acuosa de cobre usando asistida por ordenador y vídeo digital Análisis de Imágenes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 21 s
Description: Aprende a cuantificar el comportamiento de natación en esturión blanco expuesto a cobre usando análisis de video digital. Este método sensible permite detectar indicadores tempranos de toxicidad en ecotoxicología.

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Agradecemos al personal de la Rama de Ecología, la Rama de Toxicología y la Rama de Química Ambiental del Servicio Geológico de EE. UU., Centro de Investigación Ambiental de Columbia por su asistencia técnica y analítica. Financiamiento proporcionado en parte por Teck American Incorporated a través de un acuerdo con la Agencia de Protección Ambiental de EE. UU. (USEPA por sus siglas en inglés) Región 10 con fondos proporcionados por USEPA al Servicio Geológico de EE. UU. (USGS) a través del Fondo Central de Materiales Peligrosos del Departamento del Interior.

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Los cambios en el comportamiento debido a la exposición a un contaminante a menudo se utilizan como criterio de valoración de la toxicidad subletal, pero pueden ser difíciles de medir. En general, las respuestas de comportamiento se miden por medio de observaciones visuales y análisis de datos manual que requiere una gran cantidad de tiempo para procesar. Sin embargo, con el avance de la tecnología, los métodos para cuantificar la actividad de natación se han centrado en el uso de la videografía 18 y de análisis de movimiento o software de seguimiento digital que reduce el tiempo de procesamiento y análisis. Durante el análisis del vídeo capturado los datos, la cuantificación de las variables de natación manualmente habrían sido mucho tiempo por lo que el uso de grabaciones de datos de vídeo y software de seguimiento de peces provistos de una manera más eficaz y eficiente para analizar el comportamiento de natación esturión. Aunque el procedimiento destacó el comportamiento de natación de un pez, la personalización de otros organismos tales como anfibios e invertebrados acuáticos requerirían modificaciones sencillas. Dependiendo de lo que endpoin conductualts se están abordando, diseño y sistemas de cámaras experimentales pueden ser desarrollados para su uso con casi cualquier paquete de software de seguimiento disponible en el mercado. El método se demostró utilizando cobre disuelto, pero es aplicable a otros contaminantes o características tales como la temperatura o el contenido de oxígeno acuoso. Los protocolos desarrollados y presentados en este documento utilizan una cámara de vídeo digital simple como el dispositivo de grabación. Los archivos digitales se pueden transferir fácilmente a un ordenador y se cargan en el software de análisis de movimiento. Los métodos están siendo modificados constantemente y refinado para agilizar el proceso de cuantificación. Es imperativo que la calidad de vídeo sea en alta definición para que el software de análisis para identificar a cada individuo para el seguimiento de los peces. Cualquier fondo que no contrastan con los peces causará problemas cuando se trata de procesar los archivos de datos. Otro problema común con las dos dimensiones de seguimiento de vídeo es la identificación de los individuoscuando se cruzan los caminos de natación. Esto se puede corregir manualmente mediante la identificación de cada uno de los peces durante el cruce de ruta y la vinculación de los segmentos de trayectoria dentro del software. Alternativamente, la actividad total puede ser determinada a partir de cada cámara de la replicación como una media del grupo. Varias cámaras individuales con cada uno que contiene un pescado pueden ser filmados en el mismo campo de visión para calcular los movimientos de los peces. Actualmente hemos actualizado a la utilización de una serie de cámaras de vigilancia superiores sobre las cámaras de exposición que están vinculados a un dispositivo de grabación de vídeo digital de alta definición (HD-DVR). Sin embargo, el uso de cualquier sistema de cámara que puede grabar en alta definición MPEG-4 vídeos funcionará. El HD-DVR se puede configurar para grabar en un momento determinado y programado por hasta 7 días. Este manos libres enfoque automatizado permite la captura de varios videos al mismo tiempo para mantener la consistencia y reducir al mínimo las perturbaciones externas que puedan comprometer el comportamiento de los peces. El syste HD-DVRms se conectan a una red interna lo que la transferencia de archivos es relativamente simple. Mientras que el sistema de cámara automatizado es una técnica muy mejorado para cuantificar el comportamiento de natación, todavía es beneficioso para realizar observaciones visuales para servir como información de apoyo adicional para la documentación del deterioro del comportamiento durante las pruebas de toxicidad. Hay una larga historia de la literatura que documenta alterado comportamiento de los peces resultantes de la exposición a los metales que datan de la década de 1960 19,20,21. El cobre se ha demostrado que causa cambios en los niveles de actividad tales como la hipoactividad de agallas azules 22 (Lepomis macrochirus Rafinesque) y los cambios en la actividad locomotora y la alimentación de la trucha de arroyo 23 (Salvelinus fontinalis). Al menos algunos peces jóvenes confían en su sentido del olfato para detectar y evitar a los depredadores, y el cobre inducida por la privación quimiosensorial puede afectar los comportamientos relacionados con la detección de sustancias químicas de alarma 24,25,26 </sup&gt;. El epitelio olfativo está dañado debido a la exposición al cobre se afectan los mecanismos sensoriales que podrían resultar en la desorientación, la evitación conductual, reducción en la alimentación y cualquier otro comportamiento que se guían por el olfato 27. Estos comportamientos alterados fueron consistentes con lo observado durante las exposiciones. El comportamiento de natación de esturión blanco se vio afectada en gran medida durante la exposición subletal a concentraciones de cobre acuosas .. Estos resultados ilustran cómo el comportamiento se ve afectada en concentraciones subletales de cobre y se puede utilizar como un indicador de estrés tóxico. El análisis basado en vídeo ha demostrado su eficacia en la cuantificación de la conducta natación y también sirvió como documentación visual cualitativa de los impactos severos sobre el esturión expuestos al cobre. El software de análisis también es capaz de cuantificar otros diversos criterios de valoración del comportamiento. Por favor refiérase a la Tabla 1 para obtener una lista. El sistema de exposición puede ser modificado para hacer frente a cada punto final enmodo de tiempo real y puede ser utilizado para cuantificar las diferencias en el comportamiento asociado con la exposición a diversos contaminantes de interés. El uso de criterios de valoración del comportamiento en la investigación toxicológica acuática es cada vez más ocupados y debe ser considerado en la evaluación de los efectos de los contaminantes porque la función del comportamiento adaptativo es crucial en la determinación del daño ambiental 9. Los impactos de los contaminantes ambientales a comportamiento de los peces es a menudo subjetiva y desafiando particularmente cuando se trata de efectos sub-letales en ausencia de métodos estándar .. Piscina actividad tal como se cuantifica mediante el uso de estos métodos se puede controlar rigurosamente, es no destructiva con el estrés mínimo para el organismo y puede repetirse. Natación comportamiento es un índice válido y consistente de la toxicidad subletal que debe ser incorporado en los protocolos de ensayo para ampliar la sensibilidad de las pruebas de toxicidad estándar 5.

La comprensión de cómo la exposición a contaminantes puede afectar el comportamiento es a veces muy difícil y subjetiva. El comportamiento se define normalmente como una serie de actividades abiertas y observables, de todo el cuerpo que operan a través del sistema nervioso central y permiten a un organismo para sobrevivir, crecer y reproducirse. Los cambios en el comportamiento debido a la exposición a un tóxico son algunos de los indicadores más sensibles de estrés ambiental frecuencia entre 10-100 veces más sensible en comparación con la supervivencia 1. La mayoría de estos estudios examinaron la actividad de la natación, la ventilación y el comportamiento de alimentación de los peces 2,3,4. Natación actividad es el punto final subletal más utilizado en la determinación de un cambio de comportamiento en respuesta a un contaminante en las pruebas de toxicidad 5. las variables de natación incluyen la frecuencia y duración del movimiento, la velocidad y la distancia recorrida, la frecuencia y el ángulo de vueltas, posición en la columna de agua y el patrón de natación. La natación es la actividaduna medida eficaz de comportamiento natatorio la hora de evaluar la sensibilidad a un agente tóxico en base a los criterios propuestos en el capítulo 9 por Rand 6 en el libro Fundamentos de Aquatic Toxicology. En este trabajo se presenta un estudio toxicológico como un ejemplo de cómo la toxicidad de cobre a primeras fases de vida del esturión blanco (Acipenser transmontanus) en diversas etapas de desarrollo temprano en el agua de sólo exposición relativa de esturión se evaluó el comportamiento de natación e ilustra métodos para cuantificar la natación comportamiento. En estudios anteriores, las respuestas de comportamiento adversos fueron evidentes con aparición temprana durante los primeros días de la exposición aguda y crónica al cobre y se hicieron progresivamente más severos con el tiempo de exposición y la concentración 7.8.9. La magnitud y el momento de la aparición de estas respuestas de comportamiento es probable suficiente para limitar la supervivencia a largo plazo y por lo tanto son de interés dadas las implicaciones para recruiinsuficiencia tamento 10. Con el fin de interpretar con precisión la importancia de esta sensibilidad a los métodos y los procedimientos de exposición de metal se han desarrollado para la cuantificación de la evolución en el tiempo y el grado de alteraciones del comportamiento en relación con las concentraciones de cobre. protocolos de ensayo para la función y el desarrollo del comportamiento se establecieron mediante el análisis de muestras de vídeo de arriba de esturión en cámaras de exposición. Las muestras de vídeo proporcionan una evaluación cualitativa del desarrollo y la función de los tratamientos de cobre a lo largo del período de exposición. Se evaluó la actividad de la conducta y la búsqueda de refugio durante las exposiciones a concentraciones de cobre acuosas para determinar el momento de efectuar y caracterizar la secuencia temporal de deterioro que afecta a la búsqueda de refugio, letargo, nadando la coordinación, el equilibrio y la respiración. Además, las grabaciones de vídeo fueron hechas de esturión submuestras de cada réplica con el propósito de documentar cuantitativamente natación acti espontáneavidad. Estos puntos finales incluyeron medidas de la duración o de tiempo en movimiento, nadando velocidad y la distancia recorrida 5,11 usando un paquete de software de análisis de imágenes digitales disponibles en el mercado. Este software define el contorno de cada imagen dentro de un campo de visión y de esto, se define el centro de gravedad para cada imagen. El software se puede realizar un seguimiento de la posición de cada centroide en un marco por sucesión marco para determinar las trayectorias de movimiento. Este estudio cumplió con todas las secciones aplicables de las Reglas Finales de los reglamentos de la Ley de Bienestar Animal (9 CFR), y con todas las directrices institucionales para el tratamiento humano de los organismos de prueba durante el cultivo y la experimentación. A la finalización del estudio, todos los peces fueron sacrificados según las directrices adecuados con la aprobación por el Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional para el US Geological Survey, Columbia Centro de Investigación del Medio Ambiente.

<table><tbody><tr><td>sulfato de cobre II pentahidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>contaminante de preocupación dispensador de</td></tr><tr><td>jeringa</td><td>Hamilton MicroLab Serie</td><td></td> 600 <td>Aparato para espigar productos químicos</td></tr><tr>Contenedor de<td>matraz</td><td></td><td></td> volumétrico de 2 L <td>para la solución</td></tr><tr><td>de almacenamiento de frascos de vidrio de 24-1,5 L cámara de</td><td></td><td></td> prueba para cámara de video de <td>esturión de 2 dph</td></tr><tr><td></td><td>Sony Handycam Software de seguimiento digital HDR-CX550V</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Monitores de pantalla</td> plana <td>Noldus Ethovision</td><td></td><td></td></tr><tr><td>de 3-17"</td> 24 cámaras de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>vigilancia</td><td>Modelo CL101</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dispositivos</td><td></td><td></td><td></td>de grabación digital de 3-16 canales</tr><tr><td>Medidor de OD</td><td>Medidor de pH YSI</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Orion 940</td><td></td><td></td></tr><tr><td>sonda</td><td>de ph Orion&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr>medidor <td></td><td></td><td></td><td>de amoníaco</td></tr><tr><td>sonda de amoníaco</td><td>unidad</td> enfriadora <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> Orion <tr><td>bomba de agua</td><td></td><td></td><td></td> de recirculación</tr></tbody></table>

la cuantificación de natación de peces comportamiento en respuesta a la exposición aguda acuosa de cobre usando asistida por ordenador y vídeo digital análisis de imágenes

Quantifying Fish Swimming Behavior in Response to Acute Exposure of Aqueous Copper Using Computer Assisted Video and Digital Image Analysis

Las respuestas conductuales de los organismos acuáticos a los contaminantes ambientales pueden ser precursoras de otros efectos como la supervivencia, el crecimiento o la reproducción. Sin embargo, estas respuestas pueden ser sutiles y la medición puede ser un desafío. Utilizando esturión blanco juvenil (Acipenser transmontanus) con exposiciones al cobre, este artículo ilustra las técnicas utilizadas para cuantificar las respuestas conductuales mediante el análisis de imágenes digitales y video asistido por computadora. En estudios previos, se observaron graves deficiencias en el comportamiento de natación entre el esturión blanco en las primeras etapas de su vida durante exposiciones agudas y crónicas al cobre. El comportamiento del esturión se deterioró rápidamente y hasta el punto de que la supervivencia en el campo se vería comprometida, ya que los peces serían arrastrados río abajo o fácilmente capturados por los depredadores. Los objetivos de esta investigación fueron ilustrar los protocolos para cuantificar la actividad de natación durante una serie de exposiciones agudas al cobre para determinar el tiempo de efecto durante el desarrollo de las primeras etapas de la vida, y comprender la importancia de estas respuestas en relación con la supervivencia de estos peces vulnerables en las primeras etapas de la vida. Dado que la mortalidad se encuentra en un continuo de tiempo, determinar cuándo el cobre afecta por primera vez a la capacidad de natación nos ayuda a comprender las implicaciones de los efectos a nivel poblacional. Las técnicas utilizadas son fácilmente adaptables a diseños experimentales con otros organismos y estresores.

El procesamiento manual de los datos de las observaciones visuales mostraron anomalías por ciento de aumento con el aumento de la concentración de cobre después de sólo 72 horas de la exposición se inició con 2 día después de la escotilla (DPH) esturión (Figura 2). Las muestras de video documentadas las graves repercusiones que la exposición de cobre sobre el comportamiento natatorio de esturión (Video 2) y ayudaron a definir el deterioro del comportamiento como resultado. En otro ejemplo, el esturión a 30 DPH resultó sensible a la exposición de cobre con una mediana de 96 horas la concentración de efecto letal (LC50) de 40,3 mg / L basado en la mortalidad solamente. Sin embargo, cuando los puntos finales de comportamiento subletales de pérdida de equilibrio y la inmovilización se incluyen junto con la mortalidad la sensibilidad aumenta con una concentración estimada 96 hr efecto mediano (EC50), que van desde 2,4 hasta 5,0 g / L. Documentación en video capturados estos efectos subletales y más validados observaciones humanos de las anomalías de comportamiento registradosdurante la exposición. El uso de software de rastreo digital reduce el tiempo de procesamiento posterior de manera significativa en el análisis de la actividad de natación. Fish velocidad de natación, el tiempo empleado en movimiento, y la distancia recorrida disminuyó significativamente todos (Figura 3) con el aumento de la concentración de cobre. Trayectorias de natación también se redujeron con el aumento de la concentración de cobre (Figura 4). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53477/53477fig1.jpg" /> Figura 1:.. Por ordenador captura de pantalla de una plantilla de hoja de cálculo utilizado para determinar la concentración de prueba de disolución madre preparación química de stock para las pruebas de toxicidad diluidores se determinó utilizando una plantilla de hoja de cálculo en base a una concentración objetivo <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53477/53477fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Figura 2:. Diluter configuración y el diseño experimental Varias etapas de la vida de esturión blanco fueron expuestos al cobre. El tamaño del diluyente utilizado para las exposiciones se seleccionó en función del tamaño del pescado. (A) esturión primeras fases de vida se expusieron utilizando una configuración de diluyente pequeña y (b) el esturión mayores etapa de la vida se expusieron utilizando una configuración de diluyente grande. <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/53477/53477fig3.jpg" /> Figura 3: Natación conducta resulta de una etapa de la vida temprana del esturión blanco (Acipenser transmontanus) la exposición de cobre de 72 horas (a partir de 30 días tras la eclosión [DPH] pescado). Criterios de valoración de la actividad de natación (a) duración de movimiento entre 30 DPH esturión blanco; (B) la velocidad de la natación; y (c </fuerte distancia&gt;) movido disminuyó con el aumento de la concentración de cobre entre el esturión blanco expuesta durante 96 horas. El asterisco indica una diferencia significativa del control, las barras de error representan la desviación estándar. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53477/53477fig4.jpg" /> Figura 4: Los resultados de un primeras fases de vida del esturión blanco (Acipenser transmontanus) 96 horas de exposición de cobre (a partir de 2 días tras la eclosión [DPH] pescado) Sobrevivir esturión blanco en 2 DPH exhibir pérdida del equilibrio y la inmovilización después de 72 h de una. exposición 96 hr con el aumento de la concentración de cobre. El asterisco indica una diferencia significativa del control, las barras de error representan la desviación estándar. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/53477/53477fig5.jpg" /> Figura 5: Ejemplo de la natación de ruta resultados de un esturión blanco primeras fases de vida (Acipenser TRANSMOntanus) 96 horas de exposición de cobre (que mira fijamente con 30 días tras la eclosión [DPH] pescado). trayectorias de natación de esturión digitalizaron usando software de seguimiento digital a partir de (a) la replicación de control (n = 5 peces) y (b) a partir de un tratamiento de alto (50 g / L) replicar (n = 3 peces) después de una exposición de 96 horas. Tenga en cuenta el número de trayectorias de natación no representa el número de peces presentes en la cámara debido a algunos peces eran inactivos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53477/53477fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> El parámetro cuantificable </td><td> Parámetros de observación </td></tr><tr><td> Velocidad </td><td> Letargo / Hiperactividad </td></tr><tr><td> distancia recorrida </td><td> La pérdida de equilibrio </td></tr><tr><td> Duración del tiempo transcurrido en la zona </td><td> Espasmos / temblores / al revésabajo </td></tr><tr><td> Zona de transición de la cantidad de veces que organismo se desplaza entre zonas seleccionadas </td><td> Posición en la columna de agua </td></tr><tr><td> La partida a punto calcula la desviación de la trayectoria del animal hacia un punto de interés </td><td> Respiración (rápido / lento) </td></tr><tr><td> Encabezamiento calcula el título del punto del cuerpo seleccionado </td><td> Coloración </td></tr><tr><td> Girar ángulo diferencia en la partida entre dos muestras </td><td> Ocultación </td></tr><tr><td> -velocidad se calcula dividiendo el ángulo de giro por el intervalo de muestreo angular </td><td></td></tr><tr><td> Meandro calcula dividiendo el ángulo de giro por la distancia recorrida. Se utiliza para comparar convirtiendo en animales se mueven a diferentes velocidades </td><td></td></tr><tr><td> De tiempo en movimiento </td><td></td></tr><tr><td> Movilidad estado calcula la duración para la cual el área completa detectado como animales está cambiando, incluso si el cientoer punto sigue siendo el mismo </td><td></td></tr><tr><td> Rotación de una rotación se ha concluido cuando el punto del cuerpo seleccionado tiene un ángulo de giro acumulado de 360 ​​°. Gira en el sentido opuesto de menor que el umbral son ignorados. </td><td></td></tr><tr><td> Movilidad continua-calcula el porcentaje de la movilidad para el área completa del animal detectado, incluso si el punto central sigue siendo el mismo. </td><td></td></tr><tr><td> Distancia entre sujetos que se calcula la distancia entre todos los actores y los receptores seleccionados </td><td></td></tr><tr><td> Proximity-calcula la duración para la que el actor es o no en la proximidad del receptor </td><td></td></tr><tr><td> El movimiento relativo </td><td></td></tr><tr><td> movimiento-El Net ponderado movimiento del actor a (positivo) y de (negativo) el receptor, ponderado por la distancia entre ellos </td><td></td></tr><tr><td> movimiento ponderada de-moveme<html> nt del actor desde el receptor, ponderado por la distancia entre ellos. </td><td></td></tr><tr><td> movimiento ponderada To- movimiento del actor para el receptor, ponderada por la distancia entre ellos </td><td></td></tr><tr><td> Control Trial período entre dos eventos declaración de los elementos de control de prueba, o dentro de uno de los elementos </td><td></td></tr><tr><td> Control Trial eventos momento en el que un evento dentro de un elemento que ha definido en el Control de prueba se produce. </td><td></td></tr></tbody></table> Tabla 1:. Criterios de valoración del comportamiento cuantificados a través de un software de seguimiento digital de estos criterios de valoración se puede utilizar en los individuos o grupos y también sirven como una lista de comprobaciones de observación visual de deterioro conductual durante la exposición. <img alt="video 1" src="/files/ftp_upload/53477/53477movie1.jpg" /> /www.jove.com/files/ftp_upload/53477/53477video1.avi &quot;&gt; Video 1:. Visual definición de comportamiento anormal exhibida por esturión blanco afectado (Haga clic derecho para descargar) Se utilizó una lista de verificación de observación diaria para documentar anomalías La. pérdida del equilibrio y la inmovilización fueron las anomalías más frecuentes observadas durante las exposiciones. Modificado de Calfee y col. 7 <img alt="video 2" src="/files/ftp_upload/53477/53477movie2.jpg" /> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53477/53477video2.avi">Video 2: Visual documentación destacando un ejemplo de comportamiento natatorio blanco esturión. (Haga clic derecho para descargar)</a> la actividad natatoria del esturión blanco se redujo en gran medida con la exposición al aumento de la concentración de cobre. El esturión se muestra en este video son de un control, medio bajo y un alto tratamiento al final de un cobre acuosa 96 horasexposición. Aunque el esturión blanco todavía estaban vivos, es evidente el pescado se deteriora en gran medida en los tratamientos en comparación con los controles. Modificado de Calfee y col. 7

La medición de los impactos de los contaminantes ambientales en el comportamiento de los peces es a menudo subjetiva y desafiando particularmente cuando se trata de efectos sub-letales. Se describen métodos que incluyen la tecnología de video para cuantificar el comportamiento natatorio de la vida temprana etapa de esturión blanco (Acipenser transmontanus) durante y después de 96 horas la exposición aguda a varias concentraciones de cobre.

La cuantificación de Natación de peces comportamiento en respuesta a la exposición aguda acuosa de cobre usando asistida por ordenador y vídeo digital Análisis de Imágenes

Behavioral responses of aquatic organisms to environmental contaminants can be precursors of other effects such as survival, growth, or reproduction.  ...

El objetivo general de este procedimiento es demostrar cómo cuantificar las respuestas conductuales en esturión blanco frente a exposiciones subletales al cobre en solución acuosa. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la ecotoxicología, como el modo en que la exposición subletal a contaminantes afecta el comportamiento natatorio de los peces. Este método puede proporcionar información importante para la conservación del esturión blanco.También puede aplicarse fácilmente a otras especies de peces, anfibios e invertebrados. La principal ventaja de esta técnica es que la respuesta es altamente sensible, proporciona una indicación temprana de la toxicidad y es relevante para la supervivencia del organismo. Inicialmente, este método puede resultar desafiante si la persona no está familiarizada con la realización de mediciones conductuales.La encargada de demostrar el protocolo será mi coautora Holly Puglis. Primero, prepare dos litros de sulfato de cobre(II) pentahidratado de grado reactivo acuoso. A continuación, equilibre el sistema diluidor y los tanques de exposición.Coloque el tubo de entrada del dispensador automático de jeringas en el frasco de la solución stock. Luego, ajuste el volumen de inyección de la bomba automática a un mililitro y encienda el diluidor. El sistema realiza una serie de diluciones al 50% con cinco concentraciones y un control.Mediante un divisor de cuatro vías, estas soluciones se entregan a las cuatro cámaras de exposición replicadas. A continuación, encienda la bomba del enfriador configurada para mantener el baño de agua a 15 grados Celsius. Ahora, utilizando el temporizador automático del diluidor, ajústelo para que ciclé cada 30 minutos.El nivel de agua en los tanques se mantiene mediante un desagüe con tubo de rebose. Prepare las cámaras de exposición haciendo un orificio de cuatro centímetros en el lateral y cubriendo el orificio con una malla de acero inoxidable de 30 micrones. Asegúrese de seleccionar cámaras de exposición que contengan al menos un litro de agua por cada 10 gramos de pez.Por ejemplo, un esturión blanco de 89 días de edad pesa aproximadamente 373 miligramos y, por lo tanto, puede ser analizado en una cámara cuadrada de 28 centímetros por 13,5 centímetros por 25 centímetros. Al inicio, en el punto medio y al final de un experimento, recolecte muestras de 24 mililitros de la solución de prueba para análisis químico. Utilice pipetas de sorber conectadas a jeringas de plástico.Sustituya la pajilla dispensadora por un filtro de politetrafluoroetileno de cero punto cuatro cinco micrones y vierta cuatro mililitros de agua de prueba a través del filtro. Deseche este agua. A continuación, filtre los 20 mililitros restantes de agua en una botella de polietileno limpiada con ácido.Aciifique la muestra con ácido nítrico 16 molar hasta un 1% en volumen por volumen. Estas muestras pueden almacenarse durante hasta tres meses. Una vez confirmadas las exposiciones de prueba, coloque tres esturiones en cada cámara de prueba por réplica, con aproximadamente 172 miligramos de pescado por litro de cámara.Recolecte los esturiones utilizando una red no abrasiva y transfiéralos a un balde pequeño. En total, se necesitan 144 peces para recopilar datos de seis soluciones de prueba. Durante la exposición de 96 horas, no alimente a los peces.Se deben realizar observaciones diarias constantes para evaluar la mortalidad y el comportamiento anormal. La mejor hora del día para hacerlo es por la mañana, y idealmente el observador debe estar ciego a las condiciones del ensayo. La pérdida de equilibrio se define como la incapacidad de los peces para mantener una posición vertical dentro de la columna de agua.La inmovilidad se define como la incapacidad de los peces para moverse o nadar a menos que se les estimule. Registre también cualquier otra anormalidad, como letargo, hiperactividad, aumentos o disminuciones en la respiración, cambios de color, temblores, espasmos, abdomen hinchado, posición en la columna de agua y cualquier otro patrón inusual de nado. Los peces muertos siempre deben retirarse inmediatamente.Cada día, mida también los niveles de oxígeno disuelto con un medidor portátil a partir de dos muestras de agua. Al final de la exposición de 96 horas, realice videos para el análisis del comportamiento de nado. Coloque el área de prueba dentro de un tanque de exposición.Asegúrese de seleccionar una arena de prueba lo suficientemente grande para que el pez pueda nadar libremente. Directamente encima de cada arena de prueba, coloque una cámara de video manual sobre un trípode. Ahora, seleccione al azar hasta tres sobrevivientes de los peces tratados.Transfiera tres peces al área de prueba utilizando una pequeña red de malla. Permita que los peces se aclimaten al área durante aproximadamente 30 minutos. Mientras los peces se aclimatan, enfoque la imagen, minimice las distorsiones por reflejos causadas por el movimiento del agua y maximice el contraste de los peces respecto al fondo, ajustando la vista para que el pez no quede oculto.Una vez que el pez se haya aclimatado, inicie la grabación y recopile dos minutos de datos en video. Después de tomar el video, eutanasia y deseche el pez. Después de convertir los archivos de video al formato necesario para el software de análisis digital, abra el software de seguimiento y seleccione un nuevo experimento predeterminado en la opción crear un nuevo experimento en la pantalla principal.Complete los campos solicitados y presione aceptar. Luego, vaya a la opción de configuración del experimento en el menú de configuración y seleccione archivo de video como fuente de video. Establezca el número de áreas de prueba en uno.Establezca el número de sujetos por área en tres. A continuación, seleccione la detección del punto central en las características rastreadas y seleccione las unidades deseadas. Ahora, en la configuración, seleccione la opción de lista de pruebas y haga clic en agregar videos en la parte superior de la pantalla.Seleccione orden alfabético en el cuadro de diálogo. Haga clic en examinar. Navegue hasta la carpeta donde se encuentran los videos, resalte los archivos pertinentes y haga clic en abrir.Ahora que se han seleccionado los archivos de video, continúe definiendo el alcance del experimento en el software. Primero, haga clic en agregar variable en la parte superior de la pantalla e ingrese concentración en el cuadro de etiqueta. Ingrese concentración de cobre en microgramos por litro en el cuadro de descripción.A continuación, seleccione numérico en la lista desplegable para tipo. Haga clic en el cuadro de valores predefinidos y elija la opción definir valores individuales en el cuadro de diálogo. Ingrese las concentraciones utilizadas para el experimento, haciendo clic en agregar entre cada número introducido.Luego, desactive la opción permitir otros valores y haga clic en aceptar. Seleccione prueba en el menú desplegable del cuadro de ámbito. Ingrese la concentración adecuada para cada prueba en los cuadros proporcionados.Haga clic en "agregar variable" en la parte superior de la pantalla. Introduzca "replicado" en el cuadro de etiqueta. Introduzca "número de replicado" en el cuadro de descripción.Seleccione numérico en la lista desplegable para el tipo. A continuación, haga clic en el cuadro de valores predefinidos y elija la opción de definir valores individuales en el cuadro de diálogo. Ingrese uno, dos, tres y cuatro, y desactive la opción permitir otros valores.Luego, haga clic en aceptar. Ahora, seleccione la opción de prueba en el menú desplegable del cuadro de alcance. Ingrese el número de réplica adecuado para cada prueba.La siguiente tarea consiste en configurar los espacios del área. Comience seleccionando la configuración del área en la pestaña de configuración y asigne al primer ajuste el nombre de prueba uno. En el cuadro de diálogo, seleccione la opción capturar imagen de fondo y haga clic en examinar.Localice el archivo de video para el primer ensayo y haga clic en abrir. Después de que aparezca el video, haga clic en capturar en el cuadro de diálogo para capturar la imagen de fondo. A continuación, haga clic en el ícono de círculo blanco cerca de la parte superior de la pantalla en la configuración de la arena, y manipule el círculo que aparece para que rodee el área de nado.A continuación, haga clic en el icono de escala de calibración en la configuración de la arena. Utilice un movimiento de clic-mantener-arrastre para seleccionar el espacio de la arena. Ahora, en el cuadro de distancia real, ingrese 10 point five en la distancia de calibración.Luego, haga clic en aceptar. Si es necesario, ajuste la línea de calibración para que abarque todo el diámetro de la arena circular. Haga clic en la opción validar configuración de la arena en el cuadro de configuración de la arena, y resuelva cualquier problema en la configuración que no haya sido validado.Ahora, repita este proceso hasta que todas las áreas sean definidas para cada ensayo. A continuación, configure los parámetros de detección de los peces. Primero, elija la configuración de detección en la opción de configuración del menú de exploración de experimentos ubicado en el lado izquierdo de la pantalla.A continuación, seleccione sustracción dinámica en el menú desplegable bajo el método en la configuración de detección de un cuadro de diálogo. Asimismo, elija un color de relleno para cada sujeto en la identificación de sujetos dentro del cuadro de diálogo. Luego, seleccione elegir video y localice el video para el ensayo uno.En la configuración de detección, en un cuadro de diálogo, complete el campo de frecuencia de muestreo bajo video con cinco punto nueve nueve cuatro uno. En el mismo cuadro, haga clic en configuración para la opción de imagen de referencia bajo detección. Luego, haga clic en la opción iniciar aprendizaje C en el cuadro de diálogo de imagen de referencia.Una vez que la imagen en el cuadro de diálogo de imagen de referencia aparezca sin animales, haga clic en usar imagen de referencia dinámica en la configuración de adquisición dentro del cuadro de diálogo y cierre este cuadro de diálogo. Ahora, seleccione más oscuro en el menú desplegable para el sujeto está en detección en el cuadro de diálogo de configuración de detección. Para el contraste oscuro en detección, establezca el número menor en 33 y el número mayor en 153.A continuación, haga clic en guardar cambios en la parte inferior derecha. Ahora, confirme que el software esté rastreando correctamente a los animales, y no sombras ni detritos. Haga clic en el botón de reproducción en el cuadro de diálogo de control de reproducción y ajuste los números de contraste oscuro según sea necesario.Asegúrese de guardar todos los ajustes realizados. El software ahora está configurado para recopilar datos del video, por lo que la siguiente tarea consiste en rastrear los peces en cada ensayo. Primero, seleccione adquisición en la opción configuración desde la barra de herramientas del explorador de experimentos situada a la izquierda de la pantalla.A continuación, haga clic en "seguir el próximo ensayo planificado" en el cuadro de diálogo de configuración de adquisición y confirme que se muestran correctamente el ensayo, el video y la configuración de la arena bajo la sección de configuración en el cuadro de diálogo de configuración de adquisición. Luego, active la opción de detección que determina la velocidad en el cuadro de diálogo de control de adquisición. Haga clic en el botón con el círculo verde dentro de un cuadrado blanco para comenzar el proceso de adquisición.Repita este proceso hasta que se hayan rastreado todos los ensayos. Ahora, los objetos rastreados, que son los peces, pueden analizarse. Primero, haga clic en perfiles de datos en la opción de análisis desde la barra de herramientas del explorador de experimentos situada a la izquierda de la pantalla.Luego, seleccione tiempo en la opción de anidamiento en la barra de herramientas de componentes. En la configuración de intervalo de tiempo de pista en el cuadro de diálogo de tiempo, ajuste el valor de a dos minutos y haga clic en aceptar. A continuación, arrastre el cuadro anidado entre el cuadro de inicio y el cuadro de resultado en el área de perfiles de datos situada en el lado derecho de la pantalla.En la barra de herramientas del explorador de experimentos situada a la izquierda de la pantalla, busque bajo la opción de análisis y haga clic en perfil de análisis. Luego, en la barra de herramientas de variables dependientes, bajo el encabezado de distancia y tiempo, haga clic en velocidad. Haga clic en agregar, y bajo el encabezado de distancia y tiempo en la barra de herramientas de variables dependientes, haga clic en distancia recorrida.Luego, haga clic en agregar en el cuadro de diálogo de distancia recorrida y, bajo el encabezado de comportamiento individual en la barra de herramientas de variables dependientes, haga clic en movimiento. En el cuadro de diálogo de movimiento, busque bajo el encabezado de filtro de valores atípicos y ajuste el intervalo de promediado a uno. Luego, bajo el encabezado de umbral, ajuste la velocidad de inicio a dos punto cero cero y ajuste la velocidad de detención a uno punto siete cinco.Bajo el encabezado calcular estadísticas, marque las dos casillas para móvil y no móvil. Luego, haga clic en agregar y, bajo la opción de resultados en la barra de herramientas del explorador de experimentos situada a la izquierda de la pantalla, haga clic en salida de análisis. Ahora, haga clic en calcular.Una vez que se hayan calculado las variables dependientes, haga clic en exportar en la parte superior de la pantalla. Elija la carpeta de destino desde el cuadro de diálogo de exportación de resultados del análisis y seleccione Excel desde el menú desplegable de tipo de archivo. Luego, haga clic en aceptar.Finalmente, haga clic en guardar experimento bajo la pestaña archivo en la parte superior de la pantalla. Cierre el software de seguimiento digital. Importe los datos a un archivo de hoja de cálculo y analícelos utilizando un paquete de software comercial para análisis estadístico.Tras solo 72 horas de exposición a diversas concentraciones de cobre, los esturiones de dos días post-eclosión mostraron muchas anomalías observables. Hubo un impacto evidente en el comportamiento de nado. Los datos de video ayudaron a definir este deterioro conductual.En pruebas adicionales, los esturiones a los 30 días post-eclosión demostraron ser sensibles a exposiciones de cobre de 96 horas. La velocidad de nado, el tiempo dedicado al movimiento y la distancia recorrida disminuyeron significativamente con el aumento de las concentraciones de cobre. Asimismo, las trayectorias de nado se redujeron con el aumento de las concentraciones de cobre.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión sobre cómo cuantificar el comportamiento en una prueba de toxicidad. Esta técnica puede proporcionar a los responsables de la gestión ambiental un medio para utilizar criterios basados en el comportamiento con el fin de documentar los daños ambientales y orientar la restauración. Al realizar este procedimiento, es importante recordar ser constante al registrar las observaciones de comportamiento.Otros comportamientos, como la alimentación y la agresión, pueden cuantificarse siguiendo este procedimiento para responder preguntas adicionales sobre los efectos a largo plazo de la exposición a contaminantes en la supervivencia.

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