La cuantificación de Natación de peces comportamiento en respuesta a la exposición aguda acuosa de cobre usando asistida por ordenador y vídeo digital Análisis de Imágenes

El objetivo general de este procedimiento es demostrar cómo cuantificar las respuestas conductuales en el esturión blanco a la exposición subletal al cobre acuoso. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la ecotoxicología, como cómo la exposición subletal a contaminantes afecta el comportamiento de natación de los peces. Este método puede proporcionar información importante para la conservación del esturión blanco.

También se puede aplicar fácilmente a otras especies de peces, anfibios e invertebrados. La principal ventaja de esta técnica es que la respuesta es altamente sensible, proporciona una indicación temprana de toxicidad y es relevante para la supervivencia del organismo. Inicialmente, este método puede ser un desafío si el individuo no está familiarizado con la realización de mediciones de comportamiento.

La coautora Holly Puglis será la encargada de demostrar el protocolo. Primero, prepare dos litros de cobre de grado reactivo acuoso de dos sulfatos pentahidratados. A continuación, equilibre el sistema de dilución y los tanques de exposición.

Coloque el tubo de entrada del dispensador automático de jeringas en el matraz de solución madre. Luego, configure el volumen de pico de la bomba automatizada a un mililitro y encienda el diluyente. El sistema realiza una serie de dilución al 50% de cinco concentraciones y un control.

A través de un divisor de cuatro vías, estas soluciones se entregan a las cuatro cámaras de exposición replicadas. A continuación, encienda la bomba del enfriador configurado para mantener el baño de agua a 15 grados centígrados. Ahora, usando el temporizador automático en el diluyente, configúrelo para que haga un ciclo cada 30 minutos.

El nivel de agua en los tanques se mantiene mediante un desagüe de tubería vertical. Prepare las cámaras de exposición colocando un orificio de cuatro centímetros en el costado y cubriendo el orificio con una malla de acero inoxidable de 30 micras. Asegúrese de seleccionar cámaras de exposición que contengan al menos un litro de agua por cada 10 gramos de pescado.

Por ejemplo, un esturión blanco de 89 días pesa alrededor de 373 miligramos y, por lo tanto, se puede probar en una cámara cuadrada de 28 centímetros por 13 punto cinco centímetros por 25 centímetros. Al inicio, a la mitad y al final de un experimento, recoja submuestras de solución de prueba de 24 mililitros para el análisis químico. Use pajitas para sorber conectadas a jeringas de plástico.

Reemplace la pajita del sorbo con un filtro de polietersulfona de cero coma cuatro cinco micras y dispense cuatro mililitros de agua de prueba a través del filtro. Deseche esta agua. Luego, filtre los 20 mililitros de agua restantes en una botella de polietileno limpia con ácido.

Acidificar la muestra con ácido nítrico 16 molares hasta el 1% volumen por volumen. Estas muestras pueden almacenarse hasta tres meses. Una vez que se confirmen las exposiciones de prueba, almacene tres esturiones en cada cámara de prueba replicada para aproximadamente 172 miligramos de pescado por litro de cámara.

Recoja el esturión con una red no abrasiva y transfiérelo a un balde pequeño. En total, se necesitan 144 peces para recopilar datos de seis soluciones de prueba. Durante las 96 horas de exposición, no alimente a los peces.

Se deben realizar observaciones diarias constantes para evaluar la mortalidad y el comportamiento anormal. La mañana es el mejor momento del día para hacer esto, e idealmente el observador está ciego a las condiciones de la prueba. La pérdida de equilibrio se define como la incapacidad de los peces para mantener una posición vertical dentro de la columna de agua.

La inmovilidad se define como la incapacidad de los peces para moverse o nadar a menos que se les empuje. También registre cualquier otra anomalía, como letargo, hiperactividad, aumentos o disminuciones en la respiración, cambios de color, temblores, espasmos, abdomen hinchado, posición en la columna de agua y cualquier otro patrón de natación inusual. Los peces muertos siempre deben eliminarse de inmediato.

Cada día, también mida los niveles de oxígeno disuelto con un medidor de mano a partir de dos muestras de agua. Al final de las 96 horas de exposición, haga videos para analizar el comportamiento de natación. Coloque la arena de prueba dentro de un tanque de exposición.

Asegúrese de seleccionar una arena de prueba que sea lo suficientemente grande para que los peces naden libremente. Justo encima de cada campo de pruebas, coloque una cámara de vídeo de mano en un trípode. Ahora, de los peces tratados, seleccione al azar hasta tres supervivientes.

Transfiere tres a la arena de prueba usando una pequeña red de malla. Deje que los peces se aclimaten a la arena durante unos 30 minutos. Mientras los peces se aclimatan, enfoca la imagen, minimiza las distorsiones del deslumbramiento del agua en movimiento y maximiza el contraste de los peces con el fondo, ajustando la vista para que el pez no se oscurezca.

Una vez que el pez esté aclimatado, inicie la grabación y recopile dos minutos de datos de video. Después de tomar el video, practique la eutanasia y deseche el pescado. Después de convertir los archivos de video al formato necesario para el software de análisis digital, abra el software de seguimiento y seleccione nuevo experimento predeterminado en la opción crear un nuevo experimento en la pantalla principal.

Rellene las indicaciones y pulse OK. A continuación, ve a la opción de configuración del experimento en configuración y elige desde el archivo de vídeo en Fuente de vídeo. Establece el número de arenas en uno.

Establezca el número de sujetos por arena en tres. A continuación, seleccione Detección de punto central en Entidades rastreadas y seleccione las unidades deseadas. Ahora, en configuración, seleccione la opción de lista de prueba y haga clic en agregar videos en la parte superior de la pantalla.

Elija el orden alfabético en el cuadro de diálogo. Haga clic en Examinar. Navegue hasta la carpeta donde se encuentran los videos, resalte los archivos pertinentes y haga clic en abrir.

Ahora que los archivos de video están seleccionados, proceda a definir el alcance del experimento en el software. Primero, haga clic en agregar variable en la parte superior de la pantalla e ingrese concentración en el cuadro de etiqueta. Ingrese la concentración de cobre en microgramos por litro en el cuadro de descripción.

A continuación, elija numérico en la lista desplegable para tipo. Haga clic en el cuadro de valores predefinidos y elija la opción definir valores individuales en el cuadro de diálogo. Introduzca las concentraciones utilizadas para el experimento, haciendo clic en añadir entre cada suma de números.

Luego, desmarque la opción permitir otros valores y haga clic en Aceptar. Elija versión de prueba en el menú desplegable del cuadro de alcance. Introduzca la concentración adecuada para cada ensayo en las casillas proporcionadas.

Haga clic en agregar variable en la parte superior de la pantalla. Introduzca replicar en el cuadro de etiqueta. Introduzca el número de réplica en el cuadro de descripción.

Elija numérico en la lista desplegable para tipo. A continuación, haga clic en el cuadro de valores predefinidos y elija la opción definir valores individuales en el cuadro de diálogo. Introduzca uno, dos, tres y cuatro, y desmarque la opción Permitir otros valores.

A continuación, haga clic en Aceptar. Ahora, elija la opción de prueba en el menú desplegable en el cuadro de alcance. Introduzca el número de réplica adecuado para cada prueba.

La siguiente tarea es configurar los espacios de la arena. Comience eligiendo la configuración de la arena en la pestaña de configuración y asigne un nombre a la primera configuración como de prueba. En el cuadro de diálogo, seleccione la opción Capturar imagen de fondo y haga clic en Examinar.

Localice el archivo de vídeo de la primera versión de prueba y haga clic en abrir. Una vez que aparezca el video, haga clic en capturar en el cuadro de diálogo Capturar imagen de fondo. A continuación, haga clic en el icono del círculo blanco cerca de la parte superior de la pantalla en la configuración de la arena y manipule el círculo que parece rodear el área de natación.

A continuación, haz clic en el icono de la escala de calibración en la configuración de la arena. Use un movimiento de clic-mantener-arrastrar para seleccionar el espacio de la arena. Ahora, en el cuadro de distancia del mundo real en la distancia de calibración, ingrese 10 punto cinco.

A continuación, haga clic en Aceptar. Si es necesario, ajuste la línea de calibración para que abarque todo el diámetro de la arena circular. Haga clic en la opción validar la configuración de la arena en el cuadro de configuración de la arena y solucione cualquier problema en la configuración que no se haya validado.

Ahora, repita este proceso hasta que todas las arenas estén definidas para cada prueba. A continuación, configure los parámetros de detección de peces. En primer lugar, elija la configuración de detección en la opción de configuración de la barra de herramientas de exploración del experimento a la izquierda de la pantalla.

Luego, elija la sustracción dinámica en el menú desplegable debajo del método en el cuadro de diálogo de configuración de detección. Además, elija un color de relleno para cada sujeto en Identificación del sujeto en el cuadro de diálogo. A continuación, elija seleccionar video y ubique el video para la primera prueba.

En la configuración de detección un cuadro de diálogo, complete el cuadro de frecuencia de muestreo debajo del video con cinco punto nueve nueve cuatro uno. En el mismo cuadro, haga clic en configuración para la opción de imagen de referencia en detección. A continuación, haga clic en la opción empezar a aprender C en el cuadro de diálogo de la imagen de referencia.

Una vez que la imagen en el cuadro de diálogo de la imagen de referencia aparezca sin animales, haga clic en usar imagen de referencia dinámica en la configuración de adquisición dentro del cuadro de diálogo y cierre este cuadro de diálogo. Ahora, elija más oscuro en el menú desplegable para que el sujeto esté bajo detección en el cuadro de diálogo de configuración de detección. Para el contraste oscuro en la detección, establezca el número más pequeño en 33 y el número mayor en 153.

A continuación, haz clic en Guardar cambios en la parte inferior derecha. Ahora, confirme que ese software está rastreando con éxito a los animales, en lugar de las sombras o los desechos. Haga clic en el botón de reproducción en el cuadro de diálogo de control de reproducción y ajuste los números para el contraste oscuro según sea necesario.

Asegúrese de guardar los ajustes realizados. El software ahora está configurado para recopilar datos del video, por lo que la siguiente tarea es rastrear a los peces en cada prueba. En primer lugar, elija adquisición en la opción de configuración de la barra de herramientas del explorador de experimentos a la izquierda de la pantalla.

A continuación, haga clic en Seguimiento de la siguiente prueba planificada en el cuadro de diálogo Configuración de adquisición y confirme que la configuración correcta de la prueba, el vídeo y la arena se muestra en la configuración del cuadro de diálogo Configuración de adquisición. Luego, marque la opción de detección determina la velocidad en el cuadro de diálogo de control de adquisición. Haga clic en el botón con el círculo verde encerrado en un cuadrado blanco para comenzar el proceso de adquisición.

Repita este proceso hasta que se haya realizado un seguimiento de todas las pruebas. Ahora, los objetos rastreados que son los peces pueden ser analizados. En primer lugar, haga clic en Perfiles de datos en la opción de análisis de la barra de herramientas del Explorador de experimentos a la izquierda de la pantalla.

A continuación, elija el tiempo en la opción de anidamiento de la barra de herramientas de componentes. En la opción Seleccionar intervalo de tiempo de pista en el cuadro de diálogo de tiempo, ajuste el valor de a dos minutos y haga clic en Aceptar. A continuación, arrastre el cuadro nido entre el cuadro de inicio y el cuadro de resultado en el área de perfiles de datos en el lado derecho de la pantalla.

En la barra de herramientas del explorador de experimentos a la izquierda de la pantalla, busque en la opción de análisis y haga clic en perfil de análisis. A continuación, en la barra de herramientas de variables dependientes, en el encabezado de distancia y tiempo, haga clic en velocidad. Haga clic en agregar y, en el encabezado de distancia y tiempo de la barra de herramientas de variables dependientes, haga clic en distancia movida.

A continuación, haga clic en Agregar en el cuadro de diálogo Distancia recorrida y, en el encabezado Comportamiento individual de la barra de herramientas Variables dependientes, haga clic en Movimiento. En el cuadro de diálogo de movimiento, busque en el encabezado del filtro de valores atípicos y ajuste el intervalo de promedio a uno. Luego, bajo el encabezado de umbral, ajuste la velocidad de inicio a dos punto cero cero y ajuste la velocidad de parada a uno punto siete cinco.

En el encabezado Calcular estadísticas para, marque las dos casillas de Mover y No moverse. A continuación, haga clic en Agregar y, en la opción de resultados de la barra de herramientas del explorador de experimentos, a la izquierda de la pantalla, haga clic en Salida del análisis. Ahora, haga clic en calcular.

Una vez calculadas las variables dependientes, haga clic en exportar en la parte superior de la pantalla. Elija la carpeta de destino en el cuadro de diálogo de salida del análisis de exportación y seleccione Excel en el menú desplegable de tipo de archivo. A continuación, haga clic en Aceptar.

Finalmente, haga clic en guardar experimento en la pestaña archivo en la parte superior de la pantalla. Cierre el software de seguimiento digital. Importe los datos a un archivo de hoja de cálculo y analícelos utilizando un paquete de software de análisis estadístico comercial.

Después de solo 72 horas de exposición a varias concentraciones de cobre, dos días después de la eclosión, el esturión mostró muchas anomalías observables. Hubo un impacto obvio en el comportamiento de natación. Los datos de video ayudaron a definir este deterioro del comportamiento.

En pruebas posteriores, el esturión a los 30 días después de la eclosión demostró ser sensible a exposiciones de cobre de 96 horas. La velocidad de natación, el tiempo de movimiento y la distancia recorrida disminuyeron significativamente con el aumento de las concentraciones de cobre. Las rutas de natación también se redujeron con el aumento de las concentraciones de cobre.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo cuantificar el comportamiento en una prueba de toxicidad. Esta técnica puede proporcionar a los administradores ambientales un medio para utilizar criterios definidos por el comportamiento para documentar el daño ambiental y guiar la restauración. Al realizar este procedimiento, es importante recordar ser constante al registrar las observaciones de comportamiento.

Otros comportamientos, como la alimentación y la agresión, se pueden cuantificar siguiendo este procedimiento para responder preguntas adicionales sobre los impactos a largo plazo de la exposición a contaminantes en la supervivencia.