Control óptico de células vivas Actividad Eléctrica por conjugadas Polímeros

El objetivo general de este método es controlar el potencial de la membrana celular tras la estimulación por pulsos de luz visible. El proceso de fototransducción está mediado por un polímero conjugado sensible a la luz. Este método proporciona una nueva herramienta en el campo de las tecnologías, ya que representa una valiosa alternativa a los métodos existentes, como la optogenética y la estimulación térmica, para el control óptico de la actividad de las células vivas.

Las principales ventajas de esta técnica son la pronta integrabilidad con cualquier tipo de electrofisiólogo, la potencialmente alta resolución especial y temporal, que reducen la invasividad. Además, permite evitar una transferencia de genes que es requerida por la optogenética. Aquí se describe nuestro método para la fotoestimulación del cultivo celular in vitro.

Pero también podría abrir oportunidades interesantes para aplicaciones in vivo. Las demostradoras del procedimiento serán Caterina Bossio y Susana Vaquero Morata a postdoctorados de nuestros laboratorios con formación en química biológica y física respectivamente. Para comenzar, prepare una solución del polímero conjugado sensible a la luz mezclando P3HT y PCBM en clorobencina a una concentración relativa de uno a uno.

Mezcle la solución con un agitador magnético durante al menos cuatro horas a 60 grados centígrados. A continuación, limpie los portaobjetos de vidrio recubiertos de óxido de indio y estaño con baños consecutivos de 10 minutos de agua desionizada, acetona e isopropanol en un sonicador. Seque los cubreobjetos con una pistola de nitrógeno y luego trate los sustratos con un limpiador de plasma.

Una vez limpio, coloque la corredera en el mandril de una máquina de recubrimiento giratorio, con el lado recubierto de ITO hacia arriba. A continuación, añada 150 microlitros de la solución de PCBM P3HT al portaobjetos y centrifuga la muestra. Una vez finalizado el spincoater, retire la muestra y use un hisopo de sala limpia humedecido en acetona para limpiar la parte posterior del sustrato.

Esterilice los sustratos fotoactivos colocándolos en un recipiente tapado resistente al calor y calentándolos a 120 grados centígrados durante dos horas. A continuación, transfiera las muestras a una funda estéril y déjelas enfriar. A partir de este punto, mantener la esterilidad de las muestras.

Coloque los sustratos fotoactivos en una placa de seis pocillos. Dada la hidrofobicidad de la capa de polímero conjugado, haga un pocillo de polidimetilsiloxano para fijar la muestra y limite las soluciones como se describe en el protocolo de texto adjunto. Luego, coloque los sustratos fotoactivos en los pocillos de la placa y cubra toda la superficie de cada muestra con 500 a 750 microlitros de una solución de dos miligramos por litro de fibronectina en PBS.

Incubar las muestras a 37 grados centígrados durante al menos una hora. Después de la incubación, use una pipeta de vidrio para eliminar la solución de fibronectina y luego lave los sustratos una vez con dos mililitros de PBS. Primero, agregue un volumen total de 750 a 1,000 microlitros de medio de crecimiento completo por pocillo.

A continuación, coloque 15.000 células AGK293 por centímetro cuadrado de sustrato fotoactivo en cada pozo. Luego, incuba las células durante 24 a 48 horas. Las células se pueden cultivar fácilmente en los sustratos fotoactivos, siempre que se deposite una capa de adhesión adecuada, como la fibronectina.

Para comenzar, prepare las soluciones extracelulares e intracelulares como se describe en el protocolo de texto adjunto. Esterilizar las soluciones pasándolas a través de un filtro de 0,2 micras. Luego, precalienta la solución extracelular colocándola en un baño de agua a 37 grados centígrados.

Además, llene una jeringa de un mililitro con la solución intracelular y equípela con una aguja de calibre 34. Mantenga la solución intracelular en contacto con el hielo para evitar la degradación del ATP. A continuación, tome un sustrato recubierto de células de la incubadora y retire con cuidado el pozo de PDMS.

A continuación, retire el medio de crecimiento con una pipeta de vidrio y enjuague la muestra lentamente con solución extracelular para evitar el desprendimiento de células. Agregue tres mililitros de solución extracelular a cada pocillo y luego transfiera la placa al portamuestras de la estación de electrofisiología. Una vez en su lugar, coloque el electrodo de referencia en el pocillo que se va a probar.

A continuación, prepare una micropipeta de vidrio nueva para la pinza de parche con un extractor de micropipetas. Llene la mitad de la pipeta con solución intracelular. Utilice el micromanipulador para colocar la pipeta de parche muy cerca de la membrana celular seleccionada.

Durante el posicionamiento, aplique sobrepresión a la pipeta para evitar que la suciedad se adhiera a la punta. Con la pipeta unas pocas micras por encima de la célula, comience a bajar la pipeta hacia la membrana celular mientras reduce la resistencia de la pipeta en el software de control de parches. Cuando la resistencia de la pipeta aumente aproximadamente un megaohmio, retire la sobrepresión y aplique una succión suave para formar el gigasello entre la pipeta y la membrana celular.

A continuación, aplique un potencial negativo de menos 40 milivoltios a la pipeta para ayudar a estabilizar el sello. Compense la transitoriedad capacitiva debida a la capacitancia de la pipeta con los comandos relativos en el amplificador de parches y/o el software de control de parches. Aplique un breve e intenso impulso de succión a la pipeta para romper la membrana y permitir el acceso eléctrico al citoplasma de la célula.

A continuación, configure el amplificador de parche en modo de pinza amperimétrica para que no se inyecte corriente en la celda. En el modo de pinza amperimétrica, rastree el potencial de la membrana celular y espere unos minutos a que se estabilice. Una vez estable, aplique el protocolo de iluminación deseado a la célula iluminando la membrana fotoactiva debajo de la célula con luz en el rango de 450 a 600 nanómetros.

Registre el efecto de la luz sobre el potencial de membrana. Los pulsos cortos de luz de alrededor de 10 a 20 milisegundos dan como resultado una despolarización transitoria de la célula, mientras que con una iluminación prolongada del orden de cientos de milisegundos, se observa una hiperbolización hasta que se apaga la luz. La estimulación óptica de las células mediada por los sustratos fotoactivos puede dar lugar a diferentes efectos sobre la membrana celular, dependiendo de la duración del estímulo luminoso.

Un pico rápido, como el que se muestra aquí, es seguido por una despolarización transitoria del orden de decenas de milisegundos. Para pulsos cortos de luz, cuando la luz se apaga, se observa un comportamiento opuesto. Estas señales se han atribuido a una variación en la capacitancia de la membrana debido al calentamiento local después de la absorción de luz.

Para una iluminación prolongada, la despolarización inicial se convierte en una hiperpolarización celular. Este fenómeno tiene de nuevo un origen térmico, pero en este caso, está relacionado con una variación del potencial de equilibrio de la membrana debido a un cambio en las conductividades del canal iónico inducido por el aumento de la temperatura. Es importante tener en cuenta que esta técnica es bastante flexible y se puede adaptar a las necesidades particulares de un experimento específico, por ejemplo, cambiando el polímero fotóxico, el proceso de fabricación o el protocolo de iluminación.

Sin embargo, antes de cambiar el protocolo, primero se deben verificar las propiedades importantes del polímero activo, como su biocompatibilidad, idoneidad para el proceso de esterilización, estabilidad electroquímica y temporal. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo realizar una interfaz híbrida entre polímeros conectivos y células vivas y cómo usarla para el control óptico de la actividad celular. Creemos que esta técnica también promete convertirse en una herramienta complementaria en neurociencia para investigaciones in vitro y también abrir una nueva perspectiva de aplicaciones in vivo.

Sin embargo, para perfeccionar el protocolo, es necesario un esfuerzo fuerte y conjunto de científicos de materiales y neurocientíficos, físicos y médicos.