Análisis comparativo de la hormona de crecimiento humano en suero utilizando SPRI, Nano-SPRI y ELISA Ensayos

El objetivo general de este estudio es evaluar el potencial diagnóstico de los ensayos de imagen de resonancia de plasmones de superficie directa y amplificada, o SPRi, en la detección de biomarcadores en suero, y compararlos directamente con el kit comercialmente disponible de ensayo inmunoenzimático tipo ELISA. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo biomédico, como destacar la etapa temprana de una enfermedad y proporcionar medios para monitorear la eficacia terapéutica. La principal ventaja del SPRi es que permite el monitoreo y la visualización en tiempo real y sin marcadores de interacciones biomoleculares mediante el registro de los cambios en el índice de refracción adyacente a la superficie del sensor.

Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el diagnóstico de niveles de hGH en suero, ya que se ha relacionado la hGH endógena con numerosos trastornos médicos que afectan el crecimiento y desarrollo humanos. La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos de preparación de la química superficial del biochip son difíciles de aprender, y cualquier error puede afectar enormemente los resultados. Después de preparar las soluciones y las muestras de proteína según el protocolo descrito, utilice 120 mililitros de solución de piraña estabilizada para limpiar el chip de oro mediante sonicación a 50 grados Celsius durante 90 minutos.

Use agua para enjuagar el chip y sométalo a ultrasonidos en agua durante cinco minutos. Luego enjuague el chip con etanol y utilice una corriente de nitrógeno para secarlo. Coloque el chip de oro en una cámara de ozono UV durante 30 minutos para eliminar cualquier contaminante.

A continuación, agregue 150 miligramos de ácido 11-mercaptoundecanoico a 20 mililitros de etanol en un tubo de ensayo que contenga una tapa de plástico para dar soporte al chip y una barra de agitación, con el fin de mezclar homogéneamente la solución. Coloque el chip en el tubo de ensayo y tápelo. Luego, irradie el tubo en el microondas a 50 vatios y 50 grados Celsius durante cinco minutos.

Con etanol, enjuague el chip y sumérjalo en etanol durante cinco minutos. Repita el enjuague con agua y sumerja durante cinco minutos. Añada 150 miligramos de 1-Etil-3-carbodiimida a 20 mililitros de agua en un tubo de ensayo que contenga una barra de agitación.

Transfiera el chip al tubo de ensayo y caliente en el microondas tal como se acaba de demostrar. Use agua para enjuagar el chip y déjelo en remojo durante cinco minutos en agua. Luego agregue 150 miligramos de N-hidroxysuccinimida a 20 mililitros de agua en un tubo de ensayo con una barra de agitación.

Agregue el chip al tubo de ensayo, séllelo con una tapa y colóquelo en el microondas. Después de enjuagar y remojar el chip en agua como antes, agregue 250 micromoles de polietilenglicol en 20 mililitros de agua a un tubo de ensayo con una barra de agitación. Agregue el chip y colóquelo en el microondas, luego enjuague y remoje con agua como antes.

Prepare una solución de anticuerpo anti-rhGH a 15 microgramos por mililitro y anti-IgG como control negativo, y agregue 10 microlitros de cada uno a un pocillo separado en una placa de 384 pocillos. Diseñe el patrón de impresión en el microdispensador y, con una punta de 500 micrómetros recubierta de teflón, imprima el chip con los anticuerpos. Incube el chip impreso a temperatura ambiente y 75 % de humedad durante dos horas.

Después de configurar el experimento de SPRi y bloquear el chip según el protocolo descrito, prepare una solución de rhGH con el siguiente conjunto de concentraciones en PBS, que contenga 10% de suero y un miligramo por mililitro de BSA. Es importante enfatizar el tipo de molécula de bloqueo elegida en este paso, ya que el objetivo es minimizar las interacciones no específicas.

Prepare una solución dos a uno añadiendo un microlitro de anticuerpos de detección biotinilados anti-rhGH de seis micromolares a tres microlitros de puntos cuánticos de infrarrojo cercano recubiertos con estreptavidina de un micromolar en un tubo microcentrífugo de 0,5 mililitros. Inyecte 150 microlitros de solución de suero humano enriquecido con hGH en el bucle de inyección. Se observará un fuerte aumento en la señal seguido de una lenta disminución debido al lavado de suero unido de forma no específica de la superficie.

Una vez que la señal se estabilice, use una solución de 450 milimolares de cloruro de sodio, añadida al tampón de flujo, para lavar la superficie. Con el tampón de flujo, diluya la solución de anticuerpos de detección anti-rhGH y puntos cuánticos hasta una concentración de 10 nanomolares, e inyéctelos en la celda de flujo. Importe los datos a un programa de análisis de datos.

Luego, grafique la señal de SPRi frente al tiempo y determine la diferencia entre los puntos de anticuerpo anti-rhGH y los puntos de anticuerpo de control negativo tras el lavado con alta salinidad. Para realizar el ELISA, después de preparar los reactivos, las pocillos recubiertos con anticuerpo y los patrones según el protocolo descrito en el texto, prepare las muestras de la hormona rhGH en suero humano al 10 % en las siguientes concentraciones. Añada 50 microlitros de cada patrón, control y muestra a cada pocillo en tríplicado.

Luego selle los pocillos y incube a cuatro grados Celsius con agitación suave durante la noche. Al día siguiente, retire la placa del agitador y déjela alcanzar la temperatura ambiente. Deje que el anti-rhGH HRP, el tampón de conjugado, el tampón de lavado, el cromógeno tetrametilbencidina, o TMB, y el reactivo de parada se calienten a temperatura ambiente.

Para preparar los reactivos de trabajo, utilice tampón de conjugado para realizar una dilución 40x del anti-rhGH HRP. Use agua destilada para diluir el tampón de lavado 200x. Añada 50 microlitros del conjugado de anti-rhGH HRP en cada pocillo.

Cierre herméticamente los pocillos e incube a temperatura ambiente durante 30 minutos con agitación suave. Vierta la solución de los pocillos, invierta la placa y déjela secar golpeando suavemente sobre un tejido absorbente. Añada 200 microlitros de tampón de lavado en cada pocillo, antes de verterlo y secar nuevamente golpeando suavemente.

Repita el lavado tres veces. Es importante golpear suavemente la placa de 96 pocillos para eliminar los agentes accesorios, ya que confiar únicamente en la pipeta no es efectivo. A continuación, agregue 100 microlitros de cromógeno en cada pocillo, dentro de los 15 minutos posteriores al paso de lavado.

Incubar a temperatura ambiente en la oscuridad durante 30 minutos con agitación suave. Las soluciones incoloras se volverán azules. Añadir 100 microlitros del reactivo de parada en cada pocillo.

Las soluciones cambiarán de color azul a amarillo. Utilice un lector de placas a 450 nanómetros para leer inmediatamente la absorbancia de cada pocillo. Finalmente, trace la curva estándar para los estándares proporcionados y luego represente la densidad óptica de la rhGH en muestras de suero al 10%, frente a la concentración de cada muestra.

En este video, se comparó el rendimiento de SPRi y nano-SPRi con ELISA para la detección de rhGH. Esta figura representa la curva de titulación de rhGH agregado a suero humano al 10 %, y se grafica frente a la DO obtenida a 450 nanómetros. Se observó una buena respuesta lineal, y el límite de detección se determinó en un nanogramo por mililitro.

Aquí, la detección de rhGH se evaluó mediante SPRi. Cada punto en la curva de gradiente de concentración representa el valor promedio de la diferencia de reflectividad calculada a partir de tres curvas cinéticas de SPRi para cada concentración. El límite de detección, o LoD, se determinó en 3,61 nanogramos por mililitro.

Para aumentar la sensibilidad del biosensor SPRi, se introdujeron secuencialmente nanoamplificadores en el sensor. En este experimento, los nanoamplificadores incrementaron la respuesta del biosensor hasta en un 7,9 %, sin embargo, con un cambio de señal mínimo en el control. La factibilidad del biosensor nano-SPRi se evaluó midiendo el rango de rhGH desde 30 000 hasta 0,25 picogramos por mililitro.

El LDD se calculó como 9,2 picogramos por mililitro, y el coeficiente de variación fue del 20 %. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en una hora para la detección directa y en dos horas para la nano-SPRi, si se lleva a cabo correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar optimizar las condiciones en cada paso, y tras hacerlo, los resultados pueden reproducirse fácilmente en un período más corto. Tras seguir este procedimiento, otros métodos como el análisis multi-tuff y maspeck pueden realizarse directamente sobre el chip después de un experimento de SPRi, con el fin de proporcionarle información adicional sobre la molécula capturada.

Después de su desarrollo, esta técnica debería allanar el camino para que los investigadores en el campo del diagnóstico médico exploren la detección simultánea de múltiples biomarcadores asociados a trastornos cancerígenos, neurológicos y cardiovasculares. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo configurar un ensayo de SPRi, un nano-SPRi y un ELISA para la detección de niveles de hGH en suero humano. No olvide que trabajar con reactivos puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones como usar guantes y equipo de protección ocular al realizar este procedimiento.