Name: Mapeo de todo el genoma de la droga-ADN interacciones en células con COSMIC (reticulación de pequeñas moléculas para aislar la cromatina) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Aprende a mapear interacciones genoma-amplia de moléculas pequeñas que se unen al ADN usando el método COSMIC en cultivos celulares. Esta técnica mide directamente las interacciones ligando-ADN para avanzar en el diseño de agentes terapéuticos.

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Agradecemos a los miembros del laboratorio Ansari y al Prof. Parameswaran Ramanathan por sus útiles discusiones. Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de los NIH CA133508 y HL099773, la beca de la facultad H. I. Romnes, y el Premio de Investigación Médica W. M. Keck a A.Z.A. G.S.E. fue apoyado por una beca Peterson del Departamento de Bioquímica y Biociencias Moleculares Subvención de Capacitación NIH T32 GM07215. A.E. fue apoyado por la beca de posgrado Morgridge y la beca del Centro de Células Madre y Medicina Regenerativa, y D.B. recibió el apoyo de la beca NSEC de NSF.

1. La reticulación en células vivas <ol><li> Comience con ~ 2.5x10 7 células H1, ​​u otras células cultivadas. NOTA: Este número de células H1 corresponde a cinco platos de 10 cm (aproximadamente 40% de confluencia). </li><li> Cultivar las células en medios E8 en placas revestidas en una superficie que soporta las células madre pluripotentes (ver Lista de Materiales), y se incuba a 37 ° C en ambiente humidificado del 5% de CO 2. Células Cosecha enzimáticamente (ver Lista de Materiales). Nota: No permita que las células H1 excedan el 90% de confluencia; confluencia induce la diferenciación espontánea de células H1. Para contar las células, crecen un extra de 10 cm de placa de células, levantar las células enzimáticamente como se describe en las secciones 1.8-1.10, y contar con un hemocitómetro. <ol><li> Preparar E8 medios de cultivo como se describe en Chen et al. 54 </li></ol></li><li> Antes de la adición de poliamida, extraiga el medio de cultivo gastado con una pipeta Pasteur unido a una trampa de vacío. Añadir medio fresco con la mayorpipeta erological y dispensador de pipeta (8 ml por 10 cm de plato). NOTA: Agregue los medios de comunicación para el lado del plato con el fin de evitar la interrupción de las células. Desde este punto en adelante proteger a las células de la luz para evitar la prematura foto-reticulación. </li><li> Añadir poliamida con una pipeta (8 l de 400 mM de poliamida en DMSO, 400 nM de concentración final) directamente a los medios de cultivo de cada plato. Agitar el plato para dispersar la poliamida uniformemente en los medios de comunicación. NOTA: La concentración puede ser variada, pero asegurar que ninguna toxicidad celular se observa para el tratamiento seleccionado. </li><li> Se incuban las células 24 horas 37 ° C en un ambiente humidificado del 5% de CO 2, y asegurarse de que están protegidos de la luz. NOTA: El tiempo de incubación puede variarse para medir la unión de poliamida a través del tiempo. </li><li> Lave cada placa de 10 cm con 4 ml de PBS (1,05 mM fosfato monobásico de potasio, cloruro de sodio 155,17 mM, 2,97 mM fosfato dibásico de sodio) con una pipeta y pipetas serológicas disdispensador. Aspirar PBS y añadir 3 ml E8 medios de cultivo. </li><li> Con las luces se apagaron, retire la tapa de 5 placas de cultivo y colocar las células en una superficie plana exterior de la campana. Coloque un filtro de vidrio sobre las 5 placas de cultivo para filtrar la luz con λ &lt;300 nm. Coloque la fuente de UV en la parte superior del filtro. Muestras de reticulación 30 min con 365 nm de la irradiación UV (2,4 mW / cm 2). NOTA: El tiempo de reticulación se debe determinar empíricamente. </li><li> Traslado placas de cultivo de vuelta a la campana. Aspirar los medios de comunicación con una pipeta Pasteur unido a una trampa de vacío. Lave cada placa de 10 cm con 4 ml de PBS. Aspirar el PBS. Añadir 3 ml de enzima de disociación celular (ver Lista de Materiales) por 10 cm plato de disociar las células. Incubar 5 minutos a 37 ° C. NOTA: No precalentar la enzima. </li><li> Se inactiva la enzima con 3 ml E8 medios de comunicación por plato. Transferencia de células disociada en un tubo cónico de 15 ml. NOTA: Coloque las células en hielo desde este punto en adelante. </li><li> Centrifuge disociada células 5 min, 500 xga 4 ° C. Aspirar el sobrenadante para eliminar la enzima y medios de comunicación. NOTA: Punto Pausa. Las células pueden ser-flash congelado en nitrógeno líquido, se almacena a -80 ° C para su posterior procesamiento en un momento posterior. </li></ol> 2. Aislamiento de la cromatina <ol><li> Añadir 1,2 ml de tampón cósmicos (20 mM Tris-HCl [pH 8,1], EDTA 2 mM, NaCl 150 mM, 1% Triton-X100, 0,1% SDS) y la pipeta arriba y abajo varias veces para resuspender el sedimento de células para cada muestra en 1,2 ml de tampón cósmica. <ol><li> Añadir 133 l de cada uno de 100 mM fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF), benzamidina 100 mM y 150 mM, pepstatina inhibidores de la proteasa fresca a una concentración final de 1 mM PMSF y para benzamidina y 1,5 M durante pepstatina. Solución de Split de lisado celular en dos tubos de microcentrífuga de 1,7 ml de color ámbar. </li></ol></li><li> Sonicar con ultrasonidos 35 minutos (10 segundos en 10 segundos apagado, la alimentación 60%) para fragmentar el genoma a entre 100nd 500 pb. <ol><li> Mantener el nivel de la solución de la cromatina en el tubo de microcentrífuga paralelo al nivel de agua en el depósito. Confirmar este nivel mediante inspección visual. NOTA:. Confirmar que el ADN se cortó con un gel de agarosa al 1,5% 55 </li><li> Optimizar el tiempo de sonicación empíricamente. Utilice una cantidad mínima de hielo en el depósito para enfriar las muestras, y asegurar el hielo no está interfiriendo entre las muestras y el cuerno taza. </li></ol></li><li> Centrifugar la muestra 12.000 xg 10 min. Guardar la solución acuosa que contiene la cromatina soluble mediante la transferencia a un nuevo tubo de microcentrífuga de color ámbar con una pipeta. Deseche la pastilla. </li><li> Transfiera 110 l (10%) de la muestra a un nuevo tubo de microcentrífuga y la etiqueta de ADN de entrada. Almacenar a -80 ° C. Guarde el resto de la muestra de la cromatina en hielo para su uso en el paso 3.3. </li></ol> 3. Captura de ligando de ADN Crosslinks <ol><li> Utilice una pipeta para dispensar 60 l streptavirecubierto-din perlas magnéticas en un tubo de microcentrífuga. Añadir 1 ml de tampón COSMIC y mezclar en un nutator 5 minutos a temperatura ambiente. Coloque perlas magnéticas en la separación magnética estante 2 min para capturar los granos. Retire búfer cósmica con una pipeta. NOTA: No permita que las perlas se sequen. Proceda inmediatamente al siguiente paso. </li><li> Añadir la muestra de la cromatina (~ 1 ml) a las perlas (60 l) y resuspender las perlas. Incubar la cromatina con perlas magnéticas recubiertas con estreptavidina al menos 4 h en un mezclador oscilante que gira a 4 ° C. Incubar las muestras S / N, si se desea. </li></ol> 4. Aislamiento de ADN purificado por afinidad <ol><li> Lavar los granos con intervalo de 7 min a TA con los siguientes tampones de lavado para eliminar las interacciones no específicas. Utilice un rack de separación magnética para capturar los granos después de cada lavado. Resuspender las perlas después de cada cambio de tampón de lavado. </li><li> Preparar tampones de lavado en agua destilada desionizada y el filtro (0,2 micras) antes de su uso. Los tampones de lavado tienda 1 y 2 a 4 ° C para smes arios. Preparar el tampón de lavado 3 fresco cada día. Agregar y quitar tampones de lavado de la muestra con una pipeta. Para 2 y 4, añadir 1 y 3 (5 mM), respectivamente, en los lavados. Las muestras pueden ser adicionalmente lavaron dos veces con tampón de COSMIC (una vez 12 hr, una vez 4 horas) antes de los lavados se enumeran a continuación. <ol><li> Lavar una vez con tampón de lavado 1 (10 mM Tris-Cl [pH 8,0], EDTA 1 mM, 3% de SDS). Lavar una vez con tampón de lavado 2 (10 mM Tris-Cl [pH 8,0], 250 mM LiCl, EDTA 1 mM, 0,5% NP40, 1% de desoxicolato de sodio). Lavar dos veces con tampón de lavado 3 (4 M urea, 10 mM Tris-Cl [pH 7,5], EDTA 1 mM, 0,1% NP-40). Lavar dos veces con Tris EDTA (TE) tampón (10 mM Tris-Cl [pH 8,0], EDTA 1 mM). </li></ol></li><li> Resuspender las perlas en tampón TE 200 l con una pipeta. Esta muestra de ADN capturado se conoce como ADN purificado por afinidad (AP). </li><li> Complementar el ADN de entrada y AP con 10x Crosslink Reversión Buffer (100 mM Tris-Cl [pH 8,0], 1 M KOH, 4 mMEDTA) a 1x concentración final. 56,57 Incubar 30 min a 90 ° C. NOTA: 254 nm irradiación UV también se puede usar para invertir la reticulación de psoraleno, 58 pero dímeros de pirimidina ciclobutilo pueden formarse a partir irradiación a esta longitud de onda e interferir con el procesamiento aguas abajo del ADN. </li><li> Para el ADN AP, coloque el tubo de microcentrífuga que contiene la muestra en la separación magnética rack de 2 min a TA y aislar líquido (ADN) con una pipeta. Transferir el ADN AP (que se ha liberado de las perlas) a un nuevo tubo de microcentrífuga ámbar. NOTA: El ADN AP deseado en el líquido, ya no se une a las perlas. </li><li> Neutralizar de entrada y el ADN AP con HCl concentrado hasta pH 7 mediante la adición de aproximadamente 1 l de HCl 6 N por 100 l de la muestra con una pipeta. Confirme las muestras se neutralizan mediante la adición de ~ 0,5 l en papel pH con una pipeta ADVERTENCIA:. HCl concentrado es un ácido corrosivo fuerte. Manipular de acuerdo a su institución217; s directrices para el equipo de protección personal adecuado. </li><li> Añadir RNasa A (100 mg / ml) a 0,2 g / l de concentración final tanto de entrada como de ADN AP. Incubar 1 hora a 37 ° C. Añadir a la proteinasa K (20 mg / ml) a 0,2 g / l de concentración final tanto de entrada como de ADN AP, agregar. Incubar 1 hora a 55 ° C. </li><li> Se purifica el ADN con un kit de limpieza de la columna de ADN (ver Lista de Materiales). 55 Eluir el ADN en 58 l de ADN de grado H 2 O. Muestras de entrada de la tienda y AP a -20 o -80 ° C </li><li> Analizar ADN AP mediante la reacción en cadena de polimerasa cuantitativa (qPCR) con cebadores específicos del locus, y / o por secuenciación de próxima generación. Para qPCR, utilizar 2 l de ADN AP por locus con los siguientes parámetros: 1 ciclo de 95 ° C 10 min y 40 ciclos de 95 ° C 20 seg, 54 ° C o 56 ° C 20 seg, 72 ° C 40 seg. NOTA: La temperatura de hibridación debe ser modificado de acuerdo con la temperatura de fusión de los pares de cebadores usados. Seleccione una temperatu recocidore que minimiza el ciclo de cuantificación sin amplificación no específica. NOTA: Para el análisis de secuenciación de próxima generación, el objetivo de al menos 10 millones de dólares asignada lee. El número de mapeado lee puede aumentarse mediante el aumento de la cantidad de ADN AP y mediante la combinación de menos muestras a correr para la secuenciación. Más lee mejorar la sensibilidad. Los paquetes estándar para el análisis de chip siguientes (por ejemplo, Homero, 59 MACS, 60 y 61 SPP) trabajan con datos COSMIC ss. Al igual que con otros métodos que se basan en la secuenciación de próxima generación, incluyendo la secuenciación del genoma y chip-ss, regiones repetitivas crear ambigüedades en la alineación y montaje y por lo tanto siguen siendo un desafío técnico. </li></ol>

A.Z.A. es el único propietario de Vista Motif, LLC y WINStep Forward.

Uno de los principales desafíos con ChIP convencional es la identificación de anticuerpos adecuados. ChIP depende en gran medida de la calidad del anticuerpo, y la mayoría de los anticuerpos comerciales son inaceptables para ChIP. De hecho, el consorcio Encyclopedia of DNA Elements (ENCODE) encontró que solo el 20% de los anticuerpos comerciales son adecuados para los ensayos de ChIP. 50 Con COSMIC, los anticuerpos son reemplazados por estreptavidina. Debido a que las poliamidas se funcionalizan con biotina, l...

La información para hacer cada célula en el cuerpo humano está codificado en el ADN. El uso selectivo de la información que gobierna el destino de una célula. Los factores de transcripción (TFS) son proteínas que se unen a secuencias específicas de ADN para expresar un subconjunto particular de los genes en el genoma, y ​​el mal funcionamiento de TFS está vinculada a la aparición de una amplia gama de enfermedades, incluyendo defectos de desarrollo, el cáncer y la diabetes 1,2. Hemos estado interesados ​​en el desarrollo de moléculas que pueden unirse selectivamente al genoma y modular las redes de regulación de genes. Poliamidas compuestos de N -methylpyrrole y N metilimidazol son moléculas que pueden diana de ADN con especificidades y afinidades que los factores de transcripción naturales rivales. 3-6 Estas moléculas se unen a secuencias específicas en el surco menor del ADN racionalmente diseñados. 4,5,7 -11 Las poliamidas se han empleado tanto para reprimir y activar la expresión de g específicaenes. 4,12-19 También tienen interesantes antivirales 20-24 y anticancerígenas 12,13,25-30 propiedades. Una característica atractiva de poliamidas es su capacidad para acceder a secuencias de ADN que están metilados 31,32 y envuelven alrededor de las proteínas histonas 9,10,33. Para medir las especificidades de unión integrales de moléculas de unión al ADN, nuestro laboratorio creó el método de identificador de sitio de reconocimiento (CSI). 34-39 La aparición prevista de sitios de unión basado en in vitro especificidades (genomescapes) se puede visualizar en el genoma, ya que el in vitro intensidades de unión son directamente proporcionales a las constantes de asociación (K a). 34,35,37 Estos genomescapes proporcionan información sobre la ocupación de poliamida en todo el genoma, pero poliamida medir la unión en células vivas ha sido un reto. ADN está estrechamente empaquetado en el núcleo, que podría influir en la accesibilidad de los sitios de unión. La Accesibilidad de estas secuencias de ADN cromatinizados a poliamidas sigue siendo un misterio. Recientemente, muchos métodos para estudiar las interacciones entre pequeñas moléculas y ácidos nucleicos han surgido. 40-48 La captura por afinidad química y la secuenciación del ADN masivamente paralelo (chem-ss) es una de estas técnicas. Chem-ss utiliza formaldehído para reticular moléculas pequeñas a una diana genómica de interés y un derivado biotinilado de una pequeña molécula de interés para capturar la interacción ligando-diana. 48,49 Reticulación formaldehído conduce a interacciones indirectas que pueden producir falsos positivos. 50 Hemos desarrollado un nuevo método, la reticulación de moléculas pequeñas para aislar la cromatina (cósmica), 51 con un fotoentrecruzador para eliminar estos llamados picos &quot;fantasma&quot;. 50 Para empezar, hemos diseñado y sintetizado derivados trifuncionales de poliamidas. Estas moléculas contienen una pol unión al ADNyamide, un fotoentrecruzador (psoraleno), y un asa de afinidad (biotina, Figura 1). Con poliamidas trifuncionales, podemos capturar covalentemente interacciones de ADN de poliamida con irradiación UV 365 nm, una longitud de onda que no daña el ADN o inducir no psoraleno-basado de reticulación. 51 A continuación, fragmentar el genoma y purificar el ADN capturado bajo estrictas, semi condiciones -denaturing para disminuir ADN que es no covalentemente. Por lo tanto, visión cósmica como un método relacionado con chem-SEQ, pero con una lectura más directa de ADN de direccionamiento. Es importante destacar que los débiles (K a 10 3 -10 4 M -1) afinidad de psoraleno para el ADN no detectable de poliamida de impacto especificidad. 51,52 Los fragmentos de ADN enriquecidos pueden ser analizados por cualquiera de reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa 51 (COSMIC-qPCR) o mediante la secuenciación de próxima generación 53 (COSMIC-ss). Estos datos permiten un diseño imparcial genoma guiada de ligandos que entreactuar con sus loci genómica deseada y minimizar los efectos fuera de objetivo. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53510/53510fig1.jpg"/> Figura 1. poliamidas bioactivos y esquema cósmico. (A) poliamidas horquilla 1-2 diana la secuencia de ADN 5&#39;-WACGTW-3 &#39;. Poliamidas lineales 3 - 4 diana 5&#39;-AAGAAGAAG-3 &#39;. Anillos de N-metilimidazol están en negrita para mayor claridad. Los círculos vacíos y llenos representan N -methylpyrrole y N metilimidazol, respectivamente. Plaza representa 3-clorotiofeno y diamantes representan β-alanina. Psoralen y la biotina se denotan por P y B, respectivamente. (B) esquema cósmico. Las células se tratan con derivados trifuncionales de poliamidas. Después de la reticulación con 365 nm de la irradiación UV, las células son lse corta ADN genómico y ysed. Se añaden perlas magnéticas recubiertas con estreptavidina para capturar aductos de ADN-poliamida. El ADN se libera y puede ser analizado mediante PCR cuantitativa (qPCR) o mediante la secuenciación de próxima generación (NGS). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53510/53510fig1highres.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF)</td><td>cualquier fuente</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Benbenzamidina</td><td>cualquier fuente</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pepstatina</td><td>cualquier fuente</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Proteinasa K</td><td>cualquier fuente</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Estreptavidina C1</td><td>Life Technologies</td><td>65001</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td>Se pueden utilizar otras fuentes</td></tr><tr><td>: StemPro, Accutase, Reactivo de disociación celular</td><td>Life Technologies</td><td>, A1110501</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Kit de purificación</td>, <td>Qiagen</td><td>28104</td><td>Hemos probado con éxito otros fabricantes de columnas de ADN.</td></tr><tr><td>Kit de preparación de muestras TruSeq ChIP</td><td>Illumina</td><td>IP-202-1012</td><td>Este kit se puede utilizar para preparar el ADN COSMIC para la secuenciación de próxima generación</td></tr><tr><td>Matrigel Matriz de membrana basal</td><td>BD Biosciences</td><td>356231</td><td>Se utiliza para recubrir placas con el fin de cultivar ESC H1 Papel de</td></tr> pH Tubos de <tr><td>microcentrífuga ámbar</td> de <td>cualquier</td> fuente Tubos de microcentrífuga de cualquier fuente <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>cualquier fuente</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtro Pyrex</td><td>Cualquier fuente</td><td></td><td>Los platos para hornear Pyrex son adecuados</td></tr><tr><td>Mezcla maestra de qPCR</td><td>Cualquier fuente</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNasa</td><td>cualquier fuente</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HCl (6 N)</td><td>cualquier fuente</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultivo de tejidos de 10 cm Cualquier</td><td>fuente</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetas serológicas</td><td>cualquier fuente</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetas Pasteur de</td><td>cualquier fuente</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Puntas de pipeta</td><td>de cualquier fuente</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos cónicos de 15 ml</td> Cualquier <td>fuente</td> Centrífuga de cualquier fuente <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífuga</td><td>Cualquier fuente</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nutator</td><td>cualquier fuente</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Magnético Bastidor de separación</td><td>cualquier fuente</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fuente UV</td><td>CalSun</td><td>B001BH0A1A</td><td>Se pueden utilizar otras fuentes UV, pero el tiempo de reticulación debe optimizarse empíricamente</td></tr><tr><td>Misonix Sonicator</td><td>Qsonica</td><td>S4000 con bocina de copa 431C1</td> Se <td>pueden utilizar otros sonicadores, pero las condiciones de sonicación deben optimizarse empíricamente</td></tr><tr><td>Incubadora de CO2 humidificada</td><td>cualquier fuente</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cabina de seguridad biológica con salida de vacío</td><td>cualquier fuente</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mapeo de todo el genoma de la droga-adn interacciones en células con cosmic (reticulación de pequeñas moléculas para aislar la cromatina)

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

El genoma es el objetivo de algunos de los agentes quimioterapéuticos más eficaces, pero la mayoría de estos fármacos carecen de especificidad de secuencia de ADN, que conduce a la toxicidad limitante de la dosis y muchos efectos secundarios adversos. Targeting el genoma con pequeñas moléculas específicas de secuencia puede permitir moléculas con el aumento del índice terapéutico y menos efectos fuera de objetivo. -methylpyrrole N / N poliamidas metilimidazol son moléculas que pueden ser racionalmente diseñados para dirigir las secuencias de ADN específicas con exquisita precisión. Y a diferencia de la mayoría de los factores de transcripción naturales, poliamidas pueden unirse al ADN metilado y cromatinizados sin una pérdida en la afinidad. La especificidad de secuencia de poliamidas ha sido ampliamente estudiado in vitro con la identificación del emplazamiento cognado (CSI) y con los enfoques bioquímicos y biofísicos tradicionales, pero el estudio de poliamida unión a dianas genómicas en las células sigue siendo difícil de alcanzar. Aquí mostramos un método, la reticulación de moléculas pequeñas a Isolate cromatina (cósmica), que identifica los sitios de unión de poliamida en todo el genoma. Cósmico es similar a inmunoprecipitación de cromatina (ChIP), pero difiere en dos aspectos importantes: (1) un fotoentrecruzador se emplea para permitir la captura selectiva, controlada temporalmente de eventos de unión de poliamida, y (2) el asa de afinidad biotina se utiliza para purificar poliamida conjugados -ADN en condiciones semi-desnaturalizante para disminuir ADN que es no covalentemente. Cósmico es una estrategia general que puede ser utilizado para revelar los eventos de unión en todo el genoma de poliamidas y otros agentes quimioterapéuticos del genoma de metas.

Para tener en cuenta la fragmentación del genoma no uniforme y otras variables, el ADN purificado siempre debe ser normalizado contra una referencia de ADN de entrada. Los cebadores específicos de un locus de interés pueden ser utilizados. Es útil también para analizar un locus donde no se espera que la molécula para unirse, como un control negativo. Vemos un incremento&gt; 100 veces en la ocupación de poliamida tras la irradiación con luz de 365 nm (Figura 2). Enriquecido A...

La identificación de los blancos directos de moléculas del genoma de metas sigue siendo un reto importante. Para entender cómo las moléculas de unión al ADN involucran el genoma, hemos desarrollado un método que se basa en la reticulación de moléculas pequeñas para aislar la cromatina (cósmica).

Mapeo de todo el genoma de la droga-ADN interacciones en células con COSMIC (reticulación de pequeñas moléculas para aislar la cromatina)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...

El objetivo general de este procedimiento es determinar los perfiles de unión a nivel del genoma de poliamidas y otras moléculas pequeñas que se dirigen al ADN en células. Este método puede ayudar a avanzar en el campo de la química de fármacos con ADN mediante el uso del genoma para guiar el diseño de moléculas que se dirigen al ADN. La principal ventaja de esta técnica es que se miden directamente las interacciones entre el ligando y el ADN, lo que proporciona información sobre el mecanismo de acción de los ligandos que actúan sobre el genoma.Algunos de los agentes terapéuticos más exitosos son moléculas pequeñas que se unen al ADN e interfieren con las transacciones genómicas. Aunque este método fue desarrollado para estudiar poliamidas, también puede aplicarse a otras clases de moléculas dirigidas al ADN. Las células para este experimento se cultivan en medio E8 sobre placas de 10 cm, con el recubrimiento de superficie que soporta células madre pluripotentes a 37 grados Celsius en una atmósfera humedecida de 5% de dióxido de carbono.Antes de agregar el poliamida, retire el medio de cultivo usado y agregue 8 ml de medio fresco por cada placa de 10 cm. A partir de este momento, proteja las células de la luz para evitar la fotoactivación prematura. Mediante el uso de una pipeta, agregue el poliamida directamente al medio de cultivo de cada placa.Agite suavemente el recipiente para dispersar uniformemente el poliamida en el medio. Incube las células a 37 grados Celsius en una atmósfera humedecida con 5% de dióxido de carbono durante 24 horas y asegúrese de que estén protegidas de la luz. Al día siguiente, lave cada placa de 10 cm con 4 ml de PBS utilizando una pipeta serológica y un dispensador de pipetas.Aspire el PBS y agregue 3 ml de medio de cultivo E8. Con la luz tenue, coloque las células sobre una superficie plana fuera de la campana y retire las tapas de los cinco platos de cultivo. Coloque un filtro de vidrio sobre los cinco platos de cultivo para filtrar la luz con longitud de onda menor a 300 nanómetros.Coloque la fuente de UV encima del filtro. Cruzar enlazar las muestras durante 30 minutos con radiación UVA de 365 nanómetros. Después de la radiación UVA, transfiera las placas de cultivo de vuelta a la cabina.Aspire el medio con una pipeta de Pasteur conectada a un trampa de vacío y lave cada placa de 10 cm con 4 ml de PBS. Aspire el PBS y añada 3 ml de enzima para disociación celular por cada placa de 10 cm. Incube durante cinco minutos a temperatura ambiente.Detenga la enzima con 3 ml de medio E8 por placa. Transfiera las células disociadas a un tubo cónico de 15 ml. A partir de este momento, mantenga las células en hielo.Centrifugar las células disociadas a 500 x g y 4 grados Celsius durante cinco minutos. Aspirar el sobrenadante para eliminar la enzima y el medio. Para comenzar el procedimiento de aislamiento de cromatina, preparar el tampón cósmico con inhibidores de proteasas frescos.Añada 12,1 µL de cada uno de los inhibidores de proteasas PMSF 100 milimolar, benzamidina 100 milimolar y pepstatina 150 micromolar, recién preparados, al tampón cósmico basal. Añada 1,2 ml del tampón cósmico al pellet celular y aspire y expulse varias veces con una pipeta para resuspenderlo. Luego, divida la solución celular en dos tubos ámbar de microcentrífuga de 1,7 ml.Sonicar con un sonicador para fragmentar el genoma en tamaños entre 100 y 500 pares de bases. Mantenga el nivel de la solución de cromatina en el tubo de microcentrífuga paralelo al nivel del agua en el depósito. Confirme este nivel mediante inspección visual.El tiempo de sonicación se ha optimizado empíricamente: sonique a 60 % de potencia, 10 segundos encendido y 10 segundos apagado, durante 35 minutos. Utilice una cantidad mínima de hielo en el depósito para enfriar las muestras y asegúrese de que el hielo no interfiera entre las muestras y el cuerno de copa. Cuando finalice la sonicación, centrifugue la muestra a 12 000 g durante 10 minutos.Guarde la solución acuosa que contiene la cromatina soluble transfiriéndola a un nuevo tubo microcentrífugo ámbar. Deseche el precipitado. Transfiera 110 microlitros o el 10 % de la muestra a un nuevo tubo microcentrífugo.Etiquételo como ADN de entrada y almacénelo a 80 grados Celsius. Guarde el resto de la muestra de cromatina en hielo para su uso en los siguientes pasos de este protocolo. Para capturar los enlaces cruzados ligando-ADN, agregue el resto de la muestra de cromatina a las perlas magnéticas recubiertas con estreptavidina y re-suspenda la mezcla.Incube la cromatina con las perlas durante al menos cuatro horas en un mezclador rotatorio oscilante a 4 grados Celsius. El tampón de lavado necesario debe prepararse en agua destilada desionizada y filtrarse con un filtro de 0,2 micrómetros antes de su uso. Los tampones 1 y 2 pueden almacenarse a 4 grados Celsius durante varios meses, pero el tampón 3 debe prepararse fresco cada día.Una vez finalizada la incubación de la cromatina con las perlas magnéticas recubiertas de estreptavidina, lave la muestra durante siete minutos con tampón de lavado 1. Coloque la muestra en un soporte de separación magnética para retener las perlas y elimine el tampón de lavado 1. Añada el tampón de lavado 2 y lave durante otros 7 minutos.Luego, lave dos veces con tampón de lavado 3 durante siete minutos por lavado. Por último, lave dos veces con tampón TE. Después del último lavado con tampón TE, re-suspenda las perlas en 200 microlitros de tampón TE.Esta muestra de ADN capturado se denomina ADN purificado por afinidad o ADN AP. A continuación, suplemente el ADN de entrada y el ADN AP con tampón 10x para la reversión del entrecruzamiento hasta alcanzar una concentración final de 1x. Incube durante 30 minutos a 90 grados Celsius.Coloque el tubo de microcentrífuga que contiene el ADN AP en el soporte de separación magnética durante dos minutos a temperatura ambiente, luego transfiera el líquido que contiene el ADN AP a un nuevo tubo de microcentrífuga ámbar. Después de neutralizar el ADN de entrada (Input) y el ADN AP, añada RNasa A a ambas muestras de ADN hasta alcanzar una concentración final de 0,2 microgramos por microlitro. Incube durante una hora a 37 grados Celsius.Después de una hora, añada Proteinasa K tanto al ADN de entrada como al ADN de inmunoprecipitación (AP) hasta alcanzar una concentración final de 0,2 microgramos por microlitro. Incube durante una hora a 55 grados Celsius. Posteriormente, el ADN de entrada y el ADN de AP se purifican utilizando un kit de purificación con columnas de ADN y se eluyen en agua grado ADN.Almacene el ADN a 20 o 80 grados Celsius hasta que esté listo para el análisis. El ADN purificado por afinidad siempre debe normalizarse frente a una referencia de ADN de entrada. Los resultados representativos de la PCR cuantitativa con cebadores específicos del locus muestran un aumento superior a 100 veces en la ocupación del poliamida tras la irradiación con luz de 365 nanómetros.El ADN enriquecido también puede analizarse mediante secuenciación de próxima generación. Una vez secuenciado, las lecturas de ADN crudas se alinean con el genoma y se preparan pistas de densidad. Este ejemplo muestra la pista de densidad para el poliamida lineal 4 diseñado para dirigirse a repeticiones AAG.Un análisis de las distribuciones de poliamidas en células reveló que los sitios de unión agrupados que abarcan un amplio rango de afinidades predicen mejor la ocupación en células. Se desarrolló un algoritmo para puntuar todo el genoma en cuanto a la unión, utilizando datos de identificación de sitios cognados in vitro. Estos gráficos de violín muestran las puntuaciones predichas para la unión de la Poliamida 2 y la Poliamida 4 en todo el genoma.Asimismo, se muestran paisajes genómicos representativos para el poliamida 4. Este método de puntuación reveló que los loci con múltiples secuencias de baja y media afinidad presentan una ocupación por poliamidas similar a la de los loci con pocas secuencias de alta afinidad. Una vez dominada, esta técnica puede completarse en dos días si se realiza adecuadamente.Al realizar este procedimiento, es importante recordar proteger las muestras de la luz hasta que el ADN sea purificado. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la RT-PCR y la RNasa C para responder preguntas adicionales, como el efecto del enlazamiento sobre la expresión génica. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión sobre cómo utilizar cosmic para mapear los perfiles de unión en todo el genoma de las poliamidas.

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Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

El método de Hi-C permite la identificación imparcial de todo el genoma de las interacciones entre la cromatina (1). Hi-C parejas ligadura de proximidad y de secuenciación masiva en paralelo. Los datos resultantes se pueden utilizar para estudiar arquitectura genómica a diferentes escalas, los resultados iniciales identificaron características tales como los territorios de cromosomas, la segregación de la cromatina abierta y cerrada, y la estructura de la cromatina en la escala de megabase.

Hi-C: Un método para estudiar la arquitectura tridimensional de los genomas.

La trampa de cromosoma asociados (ACT) de ensayo es un nuevo método imparcial para la identificación de largo alcance interacciones ADN. La caracterización de las interacciones de largo alcance de ADN nos permitirá determinar la relación de la arquitectura nuclear de la expresión génica en la fisiología normal y en estados de enfermedad.

Cromosómicas asociadas trampa para la identificación de largo alcance Interacciones ADN

Se describe en este documento un ensayo mediante el acoplamiento de identificación de ADN metiltransferasa adenina (DamID) a alto rendimiento de secuenciación (DamID-ss). Este método mejorado proporciona una mayor resolución y un rango dinámico más amplio, y permite el análisis de datos DamID-Seq en conjunción con otros datos de secuenciación de alto rendimiento tales como chip-ss, RNA-Seq, etc.

-DamID siguientes: Genoma de toda la cartografía de la proteína-ADN Interacciones de alto rendimiento de secuenciación de fragmentos de ADN adenina-metilado

Describimos la división endógena de la cromatina junto con la secuenciación de alto rendimiento (ChEC-seq), un método ortogonal de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) para cartografiar los sitios de unión a proteínas del genoma con proteínas de fusión de nucleasa micrococcal (MNasa).

Genoma de todo el mapa de las interacciones Proteína-ADN con ChEC-seq in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Un análisis simplista de la fluorescencia se presenta para evaluar la eficiencia de amino-acil-tRNA-sintetasa/tRNA pares no-canónico-aminoácidos (ncAAs) incorporar las proteínas expresadas en células de mamíferos. Se describe la aplicación de ncAAs estudiar receptores acoplado proteína G (GPCRs), incluida la asignación de foto-reticulación de enlace sitios bioorthogonal GPCR etiquetado en células vivas.

Optimizar la incorporación genética de química sondas en GPCRs para foto-reticulación asignación y la química de Bioorthogonal en células de mamífero vivo

Presentamos un protocolo para identificar las implicaciones funcionales de las variantes no codificacionales identificadas por los estudios de asociación del genoma (GWAS) utilizando interacciones tridimensionales de cromatina.

Mapeo de variantes de la enfermedad de Alzheimer a sus genes objetivo mediante el análisis computacional de la configuración de la cromatina

La determinación precisa de las ubicaciones de unión a proteínas en todo el genoma es importante para entender la regulación genética. Aquí describimos un método de mapeo genómico que trata el ADN inmunoprecipitado con cromatina con digestión exonucleasa (ChIP-exo) seguido de secuenciación de alto rendimiento. Este método detecta interacciones proteína-ADN con resolución cartográfica de par base cercano y alta relación señal-ruido en las neuronas de mamíferos.

Mapeo de alta resolución de interacciones proteína-ADN en neuronas derivadas de células madre del ratón utilizando inmunoprecipitación de cromatina-exonucleasa (ChIP-Exo)

Hi-C 3.0 es un protocolo Hi-C mejorado que combina reticulantes de formaldehído y glutarato de disuccinimidil con un cóctel de enzimas de restricción DpnII y DdeI para aumentar la relación señal-ruido y la resolución de la detección de interacción de cromatina.

Captura de la conformación cromosómica a través de escalas de longitud

Aquí se presenta un protocolo para mapear la organización tridimensional del genoma con resolución de nucleosomas utilizando el método de captura de conformación cromosómica de todo el genoma Micro-C-XL.

Mapeo de las interacciones del genoma 3D de los mamíferos con Micro-C-XL

Presentamos un método rápido y eficiente para detectar roturas comunes de sitios frágiles a través de la inmunoprecipitación de cromatina nativa γH2A.X (ChIP). Este enfoque reduce significativamente tanto el tiempo como la mano de obra asociados con los ensayos ChIP γH2A.X tradicionales, al tiempo que mantiene una alta reproducibilidad y confiabilidad de los resultados.

Captura de roturas de sitios frágiles comunes mediante γH2A nativo. X ChIP

Aprende a mapear interacciones genoma-amplia de moléculas pequeñas que se unen al ADN usando el método COSMIC en cultivos celulares. Esta técnica mide directamente las interacciones ligando-ADN para avanzar en el diseño de agentes terapéuticos.

Mapeo de todo el genoma de la droga-ADN interacciones en células con COSMIC (reticulación de pequeñas moléculas para aislar la cromatina) (Video) | JoVE Journal

Mapeo de todo el genoma de la droga-ADN interacciones en células con COSMIC (reticulación de pequeñas moléculas para aislar la cromatina)

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