El radiomarcado y cuantificación de los niveles celulares de Fosfoinosítidos por acoplado a cromatografía líquida de alto rendimiento de flujo de centelleo

El objetivo general de este procedimiento es medir la cantidad de cada especie de fosfoinositida en las células bajo diversas condiciones genéticas y ambientales para comprender la función y regulación del fosfoinositido. Los lípidos de fosfoinositida controlan las funciones celulares como la migración, la replicación y el tráfico de memoria. Este método identifica las condiciones genéticas y ambientales que afectan a los fosfoinositidos y aumenta nuestro conocimiento sobre su regulación y función.

La principal ventaja de esta técnica es que permite una medición precisa y simultánea de todos los fosfoinositidos dentro de las células. Aunque este método puede proporcionar información sobre la regulación de los fosfoinositidos en las levaduras, también se puede aplicar a células de mamíferos cultivadas. Las personas nuevas en este método tendrán dificultades debido a los muchos pasos necesarios para el etiquetado, el procesamiento y el análisis.

Recomendamos practicar primero sin la etiqueta radiactiva. Para comenzar, cultive un cultivo líquido de 20 mililitros de la cepa de levadura SEY6210, en medio sintético completo a 30 grados centígrados con agitación constante hasta la fase de registro medio. A continuación, transfiera un total de 10 a 14 OD de las células de levadura a un tubo de centrífuga de fondo redondo de 12 mililitros y centrifugue a 800 veces G durante cinco minutos.

Decantar el medio. Y vuelva a suspender el pellet en 2 mililitros de medio libre de inositol. Vuelve a centrifugar las células.

Y luego vuelva a suspender el pellet en 440 microlitros de medio libre de inositol. Incuba las células a temperatura ambiente durante 15 minutos. Después de la incubación, agregue 60 microlitros de mioinositol marcado con tritio y haga crecer las células durante una a tres horas adicionales a 30 grados centígrados con agitación constante.

Transfiera la suspensión celular a un tubo de microcentrífuga que contenga 500 microlitros de ácido perclórico al 9% y 200 microlitros de perlas de vidrio lavadas con ácido. Mezcle invirtiendo repetidamente el tubo y luego incube en hielo durante cinco minutos. Después, agite el tubo a máxima velocidad durante 10 minutos.

A continuación, transfiera el lisado a un nuevo tubo de microcentrífuga utilizando una punta de carga de gel para evitar aspirar las perlas de vidrio. A continuación, centrifuga el tubo y desecha el sobrenadante. Sonicar el pellet en un mililitro de EDTA 100 milimolar helado hasta que se disperse por completo y centrifugar de nuevo.

Después de centrifugar, aspire el EDTA del tubo que contiene el gránulo radiomarcado. Añadir 50 microlitros de agua y sonicar para volver a suspender el pellet. Prepare el reactivo de desacilación fresco de acuerdo con el protocolo de texto.

A continuación, añada 500 microlitros del reactivo de desacilación al tubo y sonique para mezclar. Incubar la muestra a temperatura ambiente durante 20 minutos. A continuación, transfiera la muestra a un bloque calefactor a 53 grados centígrados durante 50 minutos.

Después, coloque la muestra en una centrífuga de vacío y déjela secar durante un mínimo de tres horas. Vuelva a suspender el pellet sonicándolo en 300 microlitros de agua e incubarlo a temperatura ambiente durante 20 minutos. A continuación, seque la muestra completamente en una centrífuga de vacío durante un mínimo de tres horas.

Después del secado, agregue 450 microlitros de agua al tubo y vuelva a suspender el pellet sonicando hasta que se disperse por completo. Prepare el reactivo de extracción fresco de acuerdo con el protocolo de texto. Añadir 300 microlitros de reactivo de extracción y vórtice a máxima velocidad durante cinco minutos.

Centrifugar el tubo a 18000 veces G durante dos minutos y pipetear cuidadosamente la capa acuosa inferior en un tubo nuevo. A continuación, seque la fracción acuosa final por centrifugación al vacío durante un mínimo de tres horas. A continuación, disperse completamente el pellet sonicando en 50 microlitros de agua y almacene la muestra a 20 grados centígrados.

Por último, determine la radiactividad de la muestra añadiendo dos microlitros a cuatro mililitros de líquido de centelleo en un vial de centelleo de polietileno de 6 mililitros. Registre el CPM del vial utilizando un contador de centelleo líquido con una ventana abierta. Para configurar el sistema de HPLC para la separación de los gliceroinosítidos marcados con tritio, primero prepare los tampones A y B, y la columna de cromatografía de acuerdo con el protocolo de texto.

A continuación, cargue 10 millones de CPM de la muestra en un vial de inyección de dos mililitros, equipado con un inserto de 250 microlitros accionado por resorte, y agregue agua hasta obtener un volumen total de 55 microlitros. Tape el vial con un tapón de rosca equipado con un tabique de silicona de PTFE y colóquelo en la bandeja de automuestreo del sistema de HPLC, junto con un blanco de agua en un vial similar. Utilizando el software del sistema de HPLC, programe un protocolo de elución.

Un uno por ciento de búfer B durante cinco minutos, uno a 20 por ciento B durante cuarenta minutos, 20 a 100 por ciento B durante diez minutos, 100% B durante cinco minutos, 100 a uno por ciento B durante veinte minutos y luego uno por ciento B durante diez minutos. Ajuste el caudal de la bomba a 1,0 mililitros por minuto durante 90 minutos y el límite de presión a 400 bar. A continuación, configure un protocolo de detección en el centelleador de flujo para que funcione durante 60 minutos, con un caudal de fluido de centelleo de 2,5 por minuto y un tiempo de permanencia de 8,57 segundos.

A continuación, programe una secuencia de inyección automatizada en la HPLC para comenzar con el blanco de agua ejecutando el protocolo de equilibrio, seguido de la muestra radiomarcada en el protocolo de elución. Antes de completar el protocolo de equilibrio, cree una secuencia de lotes en el centelleador de flujo para medir todas las muestras utilizando el protocolo de detección, que se activa mediante el protocolo de elución. Para analizar los datos de HPLC, primero abra el archivo de datos sin procesar para cada muestra, utilizando el software de cuantificación del cromatógrafo.

En la pestaña cromatogramas, acérquese para estirar los picos menores manteniendo la resolución temporal. Utilice la herramienta Agregar ROI para resaltar cada pico para el análisis y, a continuación, identifique los picos en función de su tiempo de elución. Utilice la pestaña de la tabla de regiones para localizar y registrar el área de cada pico.

Al mismo tiempo, anote la hora de inicio y finalización de cada pico. A continuación, realice una resta de fondo para cada pico resaltando una región adyacente al pico, que abarque la misma cantidad de tiempo. Con el software de hoja de cálculo, reste el número de recuentos de esa región de los recuentos del pico correspondiente.

Normalice el área de cada pico frente al pico parental de inositol glicerado y registre como porcentaje del fosfatidilinositol parental. A continuación, normalice cada uno de los picos en cada condición experimental frente a la condición de control, y exprese como el aumento del pliegue final en comparación con el control. Exporte los archivos haciendo clic en Archivo y Guardar como, y eligiendo el formato CSV.

Finalmente, abra el archivo CSV en un programa de hoja de cálculo para trazar los datos. El análisis de los fosfoinositidos de levadura marcados radioeléctricamente se realizó por HPLC. Dado que las células de levadura generan solo cuatro fosfoinositidos, la resolución se puede lograr con un método de elución de doble gradiente de una hora.

El pico de inositol glicerado, aludiendo a los ocho o nueve minutos, eclipsó la señal de todas las demás especies fosforiladas. Por lo tanto, es necesario acercarse a la parte de la traza que contiene los otros picos antes de integrar las señales radiactivas. Se analizaron cepas de levadura de tipo salvaje, delecionadas con ATG18 y delecionadas con VAC14 para determinar los cambios en el fosfatidilinositol 3, 5-bisfosfato utilizando este método de HPLC.

Se demostró que el mutante eliminado ATG18 produjo la mayor cantidad de fosfatidilinositol 3, 5-bisfosfato y el mutante eliminado VAC14 produjo la menor. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en cuatro días si se hace correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar optimizar las condiciones de crecimiento y etiquetado en función de la cepa de levadura o los tipos de células específicos.

Siguiendo este procedimiento, se pueden utilizar otros métodos, como los biosensores fusionados con GFP, para complementar el centelleo de flujo de HPLC para la detección de fosfoinositidos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo etiquetar por radio, extraer y medir fosfoinositidos mediante centelleo de flujo acoplado a HPLC. No olvide que trabajar con radiactividad y solventes orgánicos puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones como el uso de equipo de protección personal y la capacitación adecuada mientras se realiza este procedimiento.