Name: Un estudio de la complejación de Mercurio (II) con Dicysteinyl tetrapéptidos por electrospray espectrometría de masas de ionización (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-08T13:00:01.000+00:00
Duration: 12 min 59 s
Description: Aprende a caracterizar complejos de mercurio(II) con tetrapéptidos dicisteínicos mediante espectrometría de masas por ionización electrospray. Este método permite analizar complejos metálicos con mínima fragmentación.

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MN-S reconoce el apoyo de la National Science Foundation, RUI conceder CHE 1011859. Los autores agradecen el Fondo Tríada Espectrometría de Masas de la Universidad de Carolina del Norte en Greensboro para el uso del espectrómetro de masas Thermo Fisher Scientific LTQ Orbitrap XL. Los autores agradecen a Daniel Todd, Vincent Sica y Brandie Erhmann en la Universidad de Carolina del Norte en Greensboro para sugerencias y comentarios útiles con respecto a este trabajo.

Nota: Por favor consulte a todas las hojas de datos de seguridad de materiales pertinentes (MSDS) antes de usar. Cloruro de mercurio es una sustancia química tóxica. Equipo de protección personal (guantes, gafas de seguridad y bata de laboratorio) deben ser usados ​​cuando entregarlo y todas las soluciones asociadas. Deshágase de las soluciones en botellas de residuos químicos etiquetados claramente designadas para los metales pesados. 1. Preparación de 5 mM desgasificado formiato de amonio Buffer, pH 7,5 <ol><li> Disolver 0,1576 g de tampón de formiato de amonio en 450 ml de agua de grado HPLC. Ajustar el pH de la solución anterior con 1 M de ácido fórmico y de hidróxido de amonio 1 M a 7,5. Transferir dicha solución a un matraz aforado de 500 ml y añadir agua HPLC a la línea de calibración para hacer una solución de formiato de amonio 5 mM. </li><li> Desgasificar la 5 mM de tampón de formiato de amonio en virtud de un sistema de vacío durante 10 min y purga con argón. Repetir dos veces y solución de tienda bajo argón. En el día de uso, filtrar la solución tampón a través de un filtro de 0,2 micras se acabene uso. </li></ol> 2. Preparación de mercurio (II) Cloruro de Soluciones <ol><li> Pesar 0,2375 g de mercurio (II). Disolver en 25 ml de tampón de formiato de amonio 5 mM para producir una (II) solución de cloruro de 0.035 M mercurio. </li><li> Añadir 0,214 ml de solución 0,035 M de mercurio (II) cloruro de 9.785 ml de 5 mM de tampón de formiato de amonio para crear una solución 7,5 x 10 -4 M. Manta la solución 7,5 x 10 -4 M de mercurio (II) con gas argón. </li></ol> 3. Preparación de CGGC de la Solución <ol><li> Disolver 2,0 mg del tetrapéptido dicysteinyl, CGGC, en 0.118 ml de acetonitrilo de grado HPLC y luego añadir 1,0647 ml de formiato de amonio 5 mM, pH 7,5 tampón que ha sido desgasificado en argón para dar una solución madre 5 mM CGGC. </li><li> Añadir 225 l de la solución madre 5 mM CGGC a 1.275 l de 5 mM formación de amonio pH 7,5 tampón para dar una solución M CGGC 7,5 x 10 -4. </li></ol> 4. Preparaciónde diversas mezclas de reacción de mercurio (II) y CGGC <ol><li> Preparación de 1: 0,5 proporción de mercurio (II): solución CGGC <ol><li> Coloque de 255 l de formiato de amonio 5 mM, tampón pH 7,5 en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Añadir 30 l de solución de mercurio (II) cloruro de 7,5 x10 -4 M en el tubo de microcentrífuga de 1,5 ml con el tampón de formiato de amonio. </li><li> Vortex la solución durante 10 s. A continuación, añadir 15 l de 7,5 x 10 -4 M solución CGGC en el microcentrífuga de 1,5 ml. Vortex la solución durante 10 s. Dejar reposar la solución durante 10 min antes de la inyección en el espectrómetro de masas. </li></ol></li><li> Preparación de 1: 1 relación de mercurio (II): solución CGGC <ol><li> Coloque 240 l de formiato de amonio 5 mM, tampón pH 7,5 en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Añadir 30 l de solución de mercurio (II) cloruro de 7,5 x10 -4 M en el tubo de microcentrífuga de 1,5 ml con el tampón de formiato de amonio. </li><li> Vortex la solución durante 10 s. entoncesañadir 30 l de 7,5 x 10 -4 M CGGC solución en el tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Repetir de manera similar a la descrita en el apartado 4.1. </li></ol></li><li> Preparación de 1: 2 proporción de mercurio (II): solución CGGC <ol><li> Coloque 210 l de formiato de amonio 5 mM, tampón pH 7,5 en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Añadir 30 l de solución de mercurio (II) cloruro de 7,5 x10 -4 M en el tubo de microcentrífuga de 1,5 ml con el tampón de formiato de amonio. </li><li> Vortex la solución durante 10 s. A continuación, añadir 60 l de 7,5 x 10 -4 M CGGC solución en el tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Repetir de manera similar a la descrita en el apartado 4.1. </li></ol></li></ol> 5. Preparación de PECO Stock Solución <ol><li> Disolver 3,5 mg del tetrapéptido dicysteinyl, PECO, en 0.145 ml de acetonitrilo de grado HPLC para disolver el péptido. A continuación, añadir 13.067 ml de formiato de amonio 5 mM, pH 7,5 tampón que ha sido desgasificado en argón para producir 0,5 mSolución M PECO. </li><li> Vortex la solución hasta que se disuelva todo péptido. Añadir 1,125 ml de 0,5 mM solución PECO y 0,375 ml de 5 mM de formiato de amonio, pH 7,5 tampón a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml para dar una solución x 10 -5 M PECO 7.5. Vortex hasta que se mezcle. </li></ol> 6. Preparación de diversas mezclas de reacción de mercurio (II) y la solución PECO <ol><li> Preparación de 1: 0,5 proporción de mercurio (II): solución de PECO <ol><li> Coloque de 255 l de formiato de amonio 5 mM, tampón pH 7,5 en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Añadir 30 l de solución de mercurio (II) cloruro de 7,5 x10 -4 M en el tubo de microcentrífuga de 1,5 ml con el tampón de formiato de amonio. </li><li> Vortex la solución durante 10 s. A continuación, añadir 15 l de 7,5 x 10 -4 M PECO solución en el tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Repetir de manera similar a la descrita en el apartado 4.1. </li></ol></li><li> Preparación de 1: 1 relación de mercurio (II): solución de PECO <ol><li> Coloque 24081; l de formiato de amonio 5 mM, tampón pH 7,5 en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Añadir 30 l de solución de mercurio (II) cloruro de 7,5 x10 -4 M en el tubo de microcentrífuga de 1,5 ml con el tampón de formiato de amonio. </li><li> Vortex la solución durante 10 s. A continuación, añadir 30 l de 7,5 x 10 -4 M PECO solución en el tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Repetir de manera similar a la descrita en el apartado 4.1. </li></ol></li><li> Preparación de 1: 2 proporción de mercurio (II): solución de PECO <ol><li> Coloque 210 l de formiato de amonio 5 mM, tampón pH 7,5 en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Añadir 30 l de solución de mercurio (II) cloruro de 7,5 x10 -4 M en el tubo de microcentrífuga de 1,5 ml con el tampón de formiato de amonio. </li><li> Vortex la solución durante 10 s. A continuación, añadir 60 l de 7,5 x 10 -4 M PECO solución en el tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Repetir de manera similar a la descrita en el apartado 4.1. </li></ol></li></ol> 7. Analyzing las mezclas de reacción de mercurio (II) y muestras CGGC por espectrometría de masas ESI Orbitrap <ol><li> Preparar el espectrómetro de masas ESI 16 <ol><li> Dibuje 100 l de estándares de calibración en una jeringa de vidrio de 500 l. </li><li> Coloque la jeringa en la cuna de la bomba de jeringa MS, conecte el tubo, e inyectar en el espectrofotómetro de masas. </li><li> Configure el nombre de archivo para la carrera seleccionando el icono del archivo y escribiendo el nombre del archivo. </li><li> Seleccione el botón de datos adquieren en el módulo de adquisición de datos y recoger 150 exploraciones. </li><li> Analizar el cromatograma para verificar los estándares de calibración mediante la apertura del módulo de procesamiento de datos del software. Abra el módulo, vaya al menú Archivo y seleccione &quot;Abrir&quot; y seleccione el archivo en el cuadro de diálogo. Compruebe que los picos en el cromatograma se correlacionan con la masa para cargar proporciones de los estándares. </li><li> Limpie la jeringa de vidrio de 500 l mediante la elaboración de 500 l de metanol grado HPLC y luego distribuir el metanol en un vaso de precipitados. </li><li> Elaborar 500 l de metanol grado HPLC en la jeringa de vidrio y limpiar el sistema como en el paso 7.1.2. </li><li> Seleccione el módulo de configuración de métodos de software para ajustar los parámetros. Seleccione el menú de modo de exploración e identificar el analizador como FTMS, y luego haga clic en &quot;Aceptar&quot;. A continuación, haga clic en los varios iconos en la página de vista de espectro en tiempo real, establecer los siguientes parámetros: Envoltura caudal de gas: 10, la temperatura Fuente: 0, la tensión capilar: 37 V, lente del tubo: 95 V, el voltaje de pulverización: 4,20 kV , caudal 10,00 l / min, Analizador: FTMS, Número de exploraciones: 150. </li></ol></li><li> Ejecución de muestras CGGC en ESI espectrómetro de masas <ol><li> Ejecutar el formiato de amonio, pH 7,5 5 mM. <ol><li> Coloque 500 l de tampón de formiato de amonio 5 mM en la jeringa de vidrio de 500 l, colocarlo en el soporte de jeringa de la bomba de la EM, y conecte el tubo. </li><li> Ejecutar tampón a través del tubo durante 1-2 min. </li><li> Configure el nombre de archivo para la carreraseleccionando el icono del archivo y escribiendo el nombre del archivo. </li><li> Seleccione el botón de datos adquieren en el módulo y recoger 150 exploraciones. </li><li> Haga clic en el botón de ejecución para detener colección después se recogen 150 exploraciones. </li><li> Abra el módulo explorador de datos, a continuación, vaya al menú Archivo y seleccione &quot;Abrir&quot; y seleccione el archivo en el cuadro de diálogo. Verifique que no hay picos a 483, 683, 1.163 y 1.363 m / z están presentes que se asemejan al péptido o mercurio (II) -péptido. </li></ol></li><li> Ejecute el 1: 0,5 de mercurio (II): Solución relación CGGC. <ol><li> Colocar 250 ml de 1: 0,5 de mercurio (II): relación CGGC de la muestra en la jeringa. </li><li> Coloque la jeringa en la cuna de la bomba de jeringa MS, conecte el tubo, y el primer aparato. </li><li> Seleccione un nombre de archivo para la carrera seleccionando el icono del archivo y escribiendo el nombre del archivo. </li><li> Pulse el botón de datos adquieren en el módulo de adquisición de datos y recoger 150 exploraciones y haga clic en el botón de ejecución para detener la colección. </li><li> Abra el módulo, vaya al menú Archivo y seleccione &quot;Abrir&quot; y seleccione el archivo en el cuadro de diálogo. Verifique que el cromatograma contiene picos incluyendo el uno para el péptido CGGC solo. </li><li> Lavar la jeringa mediante la aspiración con 500 l de tampón formiato de amonio y luego dispensar el tampón de formiato amónico en un vaso de precipitados. </li><li> Seleccione el botón de residuos en la MS y lave el tubo tres veces con tampón de formiato amónico 500 l. </li><li> Lavar la jeringa mediante la aspiración con 500 l de metanol y luego dispensar el metanol en un vaso de precipitados. </li><li> Enjuague bien el tubo una vez con 500 l de metanol. </li><li> Seleccione el botón detector de carga en la MS. </li><li> Añadir 500 l de tampón de formiato de amonio a la jeringa. </li><li> Coloque la jeringa en la cuna de la bomba de jeringa MS, conecte el tubo, y el primer aparato. </li><li> Seleccione un nombre de archivo para la memoria intermedia de ejecutar seleccionando el icono del archivo y escribiendo el nombre del archivo. </li><li> oprimael botón y datos adquieren recoger 150 exploraciones y luego haga clic en el botón de parada de ejecución. </li><li> Abra el módulo de datos del navegador, vaya al menú Archivo y seleccione &quot;Abrir&quot; y seleccione el archivo en el cuadro de diálogo. Verifique que el cromatograma es nula de los picos de los últimos Hg: run CGGC. </li></ol></li><li> Ejecute el 1: 1 de mercurio (II): Solución relación CGGC. <ol><li> Colocar 250 ml de 1: 1 de mercurio (II): relación CGGC muestra en la jeringa. </li><li> Repita de una manera similar a la descrita para los pasos 7.2.2.2 a 7.2.2.15. </li></ol></li><li> Ejecute el 1: 2 de mercurio (II): Solución relación CGGC <ol><li> Colocar 250 ml de 1: 2 de mercurio (II): CGGC muestra la concentración en la jeringa. </li><li> Repita de una manera similar a la descrita para los pasos 7.2.2.2 a 7.2.2.15. </li></ol></li></ol></li></ol> 8. Analizar las mezclas de reacción de Mercurio y muestras de los PECO por Orbitrap ESI Espectrometría de Masas <ol><li> Ejecución de las muestras de los PECO en ESI espectrómetro de masas <ol><li> Repita el procedimiento de análisis (Pasos 7.1 a 7.2), utilizando muestras de los PECO y las mezclas de reacción de mercurio (II) y los PECO en diversas proporciones estequiométricas. </li></ol></li></ol>

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No hay divulgación para el trabajo informado.

El tetrapéptido dicysteinyl hidrófobo CGGC (C 10 H 18 N 4 O 5 S 2; MW = 338) (Figura 1), forma complejos con mercurio (II) como se muestra en la Figura 2 y la Tabla 1 Además, forma dímeros peptídicos y trímeros. incremental a medida que la cantidad de péptido aumentos en la mezcla de reacción. Como se muestra por los valores de m / z de los dímeros asociados [(2M + ...

Los fármacos clínicos actuales prescritos para la terapia de quelación de la intoxicación por mercurio1 contienen grupo(s) tiol(es), que es/son responsables de unir y secuestrar los iones de mercurio2,3. Sin embargo, los estudios han demostrado que estos pequeños compuestos tioles [ácido dimercaptosuccínico (DMSA) y ácido dimercaptopropano-sulfónico (DMPS)] no son óptimos para la terapia de quelacióndel mercurio 4-6. Por lo tanto, es necesario comprender la asociación y las tendencias de formación compleja del mercurio con los tioles para mejorar el diseño racional de fármacos de compuestos tioles para la quelación del mercurio. Recientemente, informamos que los tripéptidos de n-alquilo y arilo dicysteinil con grupos ditiol pueden servir como "anclajes dobles" efectivos para acomodar los sitios de coordinación de mercurio (II) para formar complejos 1:1 de mercurio (II):p péptido y 1:2 de mercurio (II) :(péptido)2 7. Además, estudiamos el efecto del aumento de los residuos de cistinilo en formaciones de tipo complejo8. En este estudio, investigamos la asociación del mercurio (II) con dos tetrapéptidos de dicistenilo, donde los residuos de cisteínilo están separados por dos residuos de aminoácidos. Con el fin de evaluar el efecto de los grupos de unión auxiliares para el mercurio, los aminoácidos intermedios son dos residuos de glicina (no sustituidos) o dos residuos de ácido glutámico (gamma-carboxilado). 
La reacción del péptido cisteínilo con el mercurio (II) requiere condiciones que impidan la oxidación de los grupos cisteinil tiol para formar enlaces disulfuro9. Además, la asociación del mercurio (II) con los péptidos de cistinilo para formar varios tipos de complejos de mercurio-péptido depende de la proporción inicial de mercurio (II): péptido en la mezcla de reacción7,8. Los tipos de complejos de mercurio-péptidos formados en estas mezclas de reacción pueden analizarse mediante espectroscopia de masas de ionización suave, que es una herramienta analítica sensible para determinar las interacciones de las especies entre los iones metálicos y los péptidos10-14. En consecuencia, proporcionará un perfil de los diversos tipos de aductos de péptidos mercuriados que se forman bajo una condición de ionización por electrospray especificada. Aquí, mostraremos cómo los péptidos de cistinílo y las soluciones de cloruro de mercurio (II) se pueden preparar en una solución tampón de formiato de amonio desgasificada cubierta con argón para minimizar la oxidación. Al hacer reaccionar diferentes equivalentes molares de mercurio (II) con tetrapéptidos dicistetinilo, mostraremos cómo la proporción inicial de péptido de mercurio (II) :p tiene un efecto sobre los tipos de complejos formados. También mostraremos cómo la espectrometría de masas de ionización por electrospray (ESI) se puede utilizar como herramienta de caracterización para proporcionar una estequiometría precisa de mercurio a péptido en los complejos formados. El protocolo de vídeo asociado demostrará las condiciones experimentales para la preparación de los complejos de mercurio, el procedimiento para analizar las mezclas de reacción en condiciones de ionización por electropulverización especificadas y la caracterización de las estequiometrías de los complejos de tetrapéptidos de mercurio (II)-dicysteinilo, sobre la base de los distintos patrones de distribución de isótopos de mercurio, utilizando el programa ChemCal15. Está destinado a ayudar a aquellos que estén interesados en utilizar la espectrometría de masas ESI orbitrap para analizar varios complejos formados por iones metálicos que existen en diferentes formas isotópicas.

<table><tbody><tr><td>Cloruro de mercurio (II)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>429724</td><td>Altamente tóxico</td></tr><tr><td>Formiato de amonio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>516961</td><td></td></tr><tr><td>Ácido fórmico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0507</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de amonio</td><td>Fisher</td><td>A512-P500</td><td></td></tr><tr><td>HPLC agua</td><td>Fisher</td><td>W5-4</td><td></td></tr><tr><td>HPLC Acetonitrilo</td><td>Fisher</td><td>BP2405-1</td><td></td></tr><tr><td>HPLC Metanol</td><td>Fisher</td><td>A452-4</td><td></td></tr></tbody></table>

un estudio de la complejación de mercurio (ii) con dicysteinyl tetrapéptidos por electrospray espectrometría de masas de ionización

A Study of the Complexation of Mercury(II) with Dicysteinyl Tetrapeptides by Electrospray Ionization Mass Spectrometry

En este estudio evaluamos un método para la caracterización de complejos, formados en diferentes proporciones relativas de mercurio(II) a tetrapéptido dicysteinilo, por espectrometría de masas orbitrap de ionización por electrospray. Esta estrategia se basa en la caracterización exitosa previa de complejos de mercurio-dicitensteinilo que involucran tripéptidos mediante la utilización de espectrometría de masas, entre otras técnicas. El cloruro de mercurio (II) y un tetrapéptido dicysteinil se incubaron en un medio tamponado desgasificado en proporciones estequiométricas variables. Los complejos formados se analizaron posteriormente en un espectrómetro de masas por electrospray que consistía en un analizador de masas lineal híbrido de iones y orbis trampa. Los espectros de espectrometría de masas de ionización por electrospray (ESI-MS) se adquirieron en modo positivo y los picos observados se analizaron para determinar los distintos patrones de distribución isotópica del mercurio y los picos monoisotópicos asociados. Este trabajo demuestra que se puede determinar una estequiometría precisa del mercurio y el péptido en los complejos formados bajo condiciones de ionización por electrospray especificadas mediante el uso de ESI MS de alta resolución basada en distintos patrones de distribución isotópica de mercurio.

<html> Se realizó un estudio para caracterizar la posible composición compleja de mercurio de péptido durante dos tetrapéptidos, CGGC y PECO (Figura 1) por espectrometría de masas ESI. Los complejos de mercurio (II) con CGGC o PECO se investigaron mediante la reacción de las mezclas de mercurio (II) y soluciones de péptidos en tres proporciones diferentes molares: 1: 0,5, 1: 1 y 1: 2 (mercurio (II): péptido) . La concentración de mercurio (II) fue de 7,5 x 10 -6</sup...

Se presenta la caracterización de complejos formados en diferentes proporciones relativas de mercurio(II) a tetrapéptidos dicysteinil mediante espectrometría de masas orbitrap de ionización por electrospray.

Un estudio de la complejación de Mercurio (II) con Dicysteinyl tetrapéptidos por electrospray espectrometría de masas de ionización

In this study we evaluated a method for the characterization of complexes, formed in different relative ratios of mercury(II) to dicysteinyl tetrapeptide, ...

El objetivo general de este procedimiento es preparar complejos de mercurio y péptidos dicisteínicos bajo diferentes estequiometrías de reacción, y caracterizar los distintos complejos formados mediante espectrometría de masas por ionización por electrospray y analizador tipo orbitrap. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre las tendencias de complejación del mercurio y los compuestos tiol, lo que mejorará el diseño racional de agentes quelantes para el secuestro de iones de mercurio. La principal ventaja de esta técnica es que facilita el análisis de complejos de iones metálicos con fragmentación despreciable.Otros incluyen un patrón distintivo de distribución isotópica del mercurio. Facilidad para asignar la carga y analizar picos solapados mediante espectrometría de masas en tándem. Aunque este método proporciona información sobre complejos peptídicos de mercurio, también puede aplicarse a otros complejos, especialmente con iones metálicos que existen en diferentes formas isotópicas.Degase un tampón de formiato de amonio 5 mM mediante un sistema de vacío durante 10 minutos y purifique con argón. Repita dos veces y almacene la solución bajo argón. En el día de uso, filtre la solución tampón a través de un filtro de 0,2 micrones antes de su uso.Para preparar soluciones de cloruro de mercurio, pese 0,2375 gramos de cloruro de mercurio. Disuelva en 25 mililitros de tampón de formiato de amonio cinco milimolar, para producir una solución de cloruro de mercurio 0,035 molar. Añada 0,214 mililitros de la solución de cloruro de mercurio a 9,785 mililitros de tampón de formiato de amonio cinco milimolar, para crear una solución 0,75 milimolar.Cubra la solución resultante con gas argón. A continuación, agregue 225 microlitros de una solución stock de CGGC cinco milimolar a 1,275 mililitros de tampón de formiato de amonio cinco milimolar pH 7,5, para obtener una solución de CGGC 0,75 milimolar. Luego, prepare una proporción de uno a 0,5 de mercurio a solución de CGGC colocando 255 microlitros de tampón de formiato de amonio cinco milimolar pH 7,5 en un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros.Luego, agregue 30 microlitros de solución de cloruro de mercurio 0,75 milimolar al tubo. Vortexee la solución durante 10 segundos. A continuación, agregue 15 microlitros de solución de CGGC 0,75 milimolar al tubo.Vortex la solución durante otros 10 segundos y luego deje reposar la solución durante 10 minutos antes de inyectarla en el espectrómetro de masas. Para preparar el espectrómetro de masas por ionización por electrospray, o MS, aspire 100 microlitros de patrones de calibración en una jeringa de vidrio de 500 microlitros. Coloque la jeringa en el soporte para jeringas de la bomba del MS.Conecte el tubo e inyecte en el espectrómetro de masas. Configure el nombre del archivo para la corrida seleccionando el icono de archivo y escribiendo el nombre del archivo. Seleccione el botón de adquisición de datos en el módulo de adquisición de datos y recolecte 150 escaneos.Analice el cromatograma para verificar los patrones de calibración abriendo el módulo de procesamiento de datos del software. Luego, vaya al menú de archivo y seleccione abrir, seguido del archivo en el cuadro de diálogo. Verifique que los picos en el cromatograma se correspondan con las relaciones masa a carga de los patrones.Limpie la jeringa de vidrio de 500 microlitros extrayendo 500 microlitros de metanol grado HPLC y luego dispensándolos en un vaso de precipitados. Extraiga 500 microlitros de metanol grado HPLC en la jeringa de vidrio y purgue el sistema. Seleccione el módulo de configuración de métodos del software para establecer los parámetros.Seleccione el menú del modo de escaneo e identifique los analizadores FTMS, luego haga clic en aceptar. A continuación, haga clic en los distintos iconos de la página del espectro de vista en tiempo real para configurar los parámetros según se detalla en el protocolo del texto. Para ejecutar el tampón, coloque 500 microlitros de tampón de formiato de amonio 5 milimolar en la jeringa de vidrio de 500 microlitros.Colóquelo en el soporte de la jeringa de la bomba MS y desconecte el tubo. Pase el tampón a través del tubo durante uno o dos minutos. Configure el nombre del archivo para la corrida, seleccionando el icono de archivo y escribiendo el nombre del archivo.Seleccione el botón adquirir datos en el módulo y recopile 150 escaneos. Haga clic en el botón detener ejecución para finalizar la recopilación después de que se hayan recopilado los 150 escaneos. A continuación, abra el módulo del explorador de datos, vaya al menú archivo y seleccione abrir, seguido del archivo en el cuadro de diálogo.Verifique que no estén presentes picos en 483, 683, 1163 y 1363 de masa sobre carga que se asemejen a los complejos de péptido o de ion de mercurio con el péptido. Inyecte la solución con una relación de mercurio a CGGC de uno a 0,5 colocando 250 microlitros de la muestra en la jeringa. Coloque la jeringa en el soporte de jeringas de la bomba de espectrometría de masas.Conecte el tubo y cebre el aparato. Tras adquirir 150 escaneos de datos, abra el módulo del navegador, vaya al menú de archivo y seleccione abrir. Luego, seleccione el archivo en el cuadro de diálogo.Verifique que el cromatograma contenga picos, incluido el del péptido CGGC solo. Un aspecto crítico de este procedimiento es asegurar que los analitos de la corrida anterior se eliminen completamente antes de cada análisis de la mezcla de reacción. La minimización de la contaminación de la muestra por analitos de arrastre se garantiza limpiando minuciosamente la línea de inyección.Lave la jeringa aspirando 500 microlitros de tampón de formiato de amonio y luego dispensando el tampón en un vaso de precipitados. A continuación, seleccione el botón de desecho en el MS y enjuague el tubo tres veces con 500 microlitros de tampón de formiato de amonio. Lave adicionalmente la jeringa aspirando 500 microlitros de metanol y dispensándolos en un vaso de precipitados.Lave la tubería una vez con 500 microlitros de metanol. Luego, seleccione el botón del detector de carga en el MS. Después de agregar 500 microlitros de tampón de formiato de amonio a la jeringa, coloque la jeringa en el soporte de jeringas de la bomba del MS. Conecte la tubería y purgue el aparato.Seleccione un nombre de archivo para la corrida del tampón como antes, y adquiera 150 escaneos antes de hacer clic en el botón de detener la corrida. Abra el módulo del explorador de datos para verificar que el cromatograma esté libre de picos provenientes de la corrida anterior de mercurio a CGGC. Repita el procedimiento de análisis para las muestras restantes de CGGC.Para preparar una relación de uno a 0,5 de mercurio con la solución CEEC, coloque 255 microlitros de tampón de formiato de amonio 5 milimolar pH 7,5 en un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros. Añada 30 microlitros de solución de cloruro de mercurio 0,75 milimolar al tubo. Después de agitar la solución en vórtex durante 10 segundos, agregue 15 microlitros de una solución CEEC 0,75 milimolar al tubo.Vortex la solución durante otros 10 segundos y deje reposar la solución durante 10 minutos antes de la inyección en el espectrómetro de masas. Repita el procedimiento de análisis utilizando muestras de CEEC y mezclas de reacción de ion mercurio y CEEC.Se muestra un espectro de masas representativo. Después de 10 minutos, son visibles los diversos tipos de complejos de péptido con mercurio para la mezcla de reacción de mercurio a CGGC en una proporción de uno a 0,5, junto con un pico del péptido de 339,08 y un dímero del péptido de 677,15. Como se observó en el espectro anterior, la mezcla de reacción de mercurio a CGGC en una proporción de uno a uno contiene algunos picos similares.Por ejemplo, el pico 539,03 indica el complejo uno a uno de mercurio y péptido. La vista ampliada muestra el patrón isotópico característico del mercurio correspondiente a los siete isótopos principales de mercurio que ocurren naturalmente. También se observa un complejo de uno a dos de mercurio con CGGC, como se informó previamente para el tríptido dicitisinílico con mercurio.Este complejo aparece en las tres mezclas de reacción de mercurio y CGGC. Fue analizado fácilmente mediante un patrón isotópico distintivo de mercurio con un pico monoisotópico en 877. Sin embargo, si el mercurio está en exceso, como en la mezcla de reacción de mercurio a CGGC en relación uno a 0,5, se detecta un complejo adicional de dos mercurios por CGGC.Esta firma isotópica de mercurio corresponde a un complejo de dos átomos de mercurio, según se calculó utilizando el programa chem cal. La masa monoisotópica protonada teórica corresponde a un valor de masa sobre carga de 1077, que es el noveno pico en el grupo isotópico observado. Se muestra un espectro representativo que ilustra varios complejos de mercurio con CEEC.Es de interés la superposición de picos asociados al mercurio con los aductos de CEEC en la carga más uno, que muestra un pico monoisotópico en 883, y en la carga más dos, con un valor calculado del pico monoisotópico de 1765. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en menos de dos horas, si se lleva a cabo correctamente.Al intentar este procedimiento, es importante recordar desgasificar sus tampones y enjuagar cuidadosamente la línea para evitar analitos de arrastre. Tras seguir este procedimiento, se pueden utilizar otros métodos como resonancia magnética nuclear de protones, carbono-13 y mercurio-199, o potenciometría, para obtener una determinación más precisa de los complejos presentes en la fase de solución. Después de ver este video, usted debería ser capaz de analizar diversos complejos de mercurio y sus patrones distintos de distribución isotópica del mercurio y formaciones de carga utilizando espectrometría de masas con analizador orbitrap y ionización por spray de electros, así como distinguir picos solapados mediante análisis de espectrometría de masas en tándem.No olvide que trabajar con soluciones de mercurio puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones, como usar equipo de protección personal, al realizar este procedimiento.

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Un estudio de la complejación de Mercurio (II) con Dicysteinyl tetrapéptidos por electrospray espectrometría de masas de ionización (Video) | JoVE Journal

Un estudio de la complejación de Mercurio (II) con Dicysteinyl tetrapéptidos por electrospray espectrometría de masas de ionización

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