Un estudio de la complejación de Mercurio (II) con Dicysteinyl tetrapéptidos por electrospray espectrometría de masas de ionización

El objetivo general de este procedimiento es preparar complejos de mercurio y péptidos dicysteinílicos bajo diferentes estequiometrías de reacción, y caracterizar los diferentes complejos formados por ionización por electrospray y espectrometría de masas oribitrap. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre las tendencias de complejación del mercurio y los compuestos de tiol, lo que mejorará el diseño racional de agentes quelantes para secuestrar iones de mercurio. La principal ventaja de esta técnica es que facilita el análisis de complejos iónicos metálicos con fragmentación insignificante.

Otros incluyen un patrón de distribución isotópica distinto del mercurio. Facilidad en la asignación de la carga y el análisis de picos superpuestos mediante espectrometría de masas en tándem. Aunque este método proporciona información sobre los complejos de péptidos de mercurio, también se puede aplicar con otros complejos, especialmente con iones metálicos que existen en diferentes formas isotópicas.

Desgasificar un tampón de formiato de amonio de cinco milimolares bajo un sistema de vacío durante 10 minutos y purgar con argón. Repita dos veces y guarde la solución bajo argón. El día de uso, filtre la solución tampón a través de un filtro de 0,2 micras antes de usar.

Para preparar soluciones de cloruro de mercurio, pese 0,2375 gramos de cloruro de mercurio. Disolver en 25 mililitros de tampón de formiato de amonio de cinco milimolares, para producir una solución de cloruro de mercurio 0,035 molar. Agregue 0,214 mililitros de la solución de cloruro de mercurio a 9,785 mililitros de tampón de formiato de amonio de cinco milimolares, para crear una solución de 0,75 milimolares.

Cubra la solución resultante con gas argón. A continuación, agregue 225 microlitros de una solución madre de CGGC de cinco milimolares a 1,275 mililitros de tampón de formiato de amonio de cinco milimolares pH 7,5, para obtener una solución de CGGC de 0,75 milimolares. A continuación, prepare una proporción de uno a 0,5 de mercurio a la solución de CGGC colocando 255 microlitros de tampón de formiato de amonio de cinco milimolares de pH 7,5 en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros.

A continuación, añade 30 microlitros de solución de cloruro de mercurio de 0,75 milimolares en el tubo. Agita la solución durante 10 segundos. A continuación, añade 15 microlitros de solución de CGGC de 0,75 milimolares en el tubo.

Agite la solución en vórtice durante otros 10 segundos y luego deje reposar la solución durante 10 minutos antes de inyectarla en el espectrómetro de masas. Para preparar el espectrómetro de masas ESI, o MS, extraiga 100 microlitros de patrones de calibración en una jeringa de vidrio de 500 microlitros. Coloque la jeringa en la base de la jeringa de la bomba MS.

Conecte el tubo e inyéctelo en el espectrómetro de masas. Configure el nombre de archivo para la ejecución seleccionando el icono de archivo y escribiendo el nombre del archivo. Seleccione el botón Adquirir datos en el módulo de adquisición de datos y recopile 150 escaneos.

Analice el cromatograma para verificar los patrones de calibración abriendo el módulo de procesamiento de datos del software. A continuación, vaya al menú de archivos y seleccione abrir, seguido del archivo en el cuadro de diálogo. Verifique que los picos en el cromatograma se correlacionen con las relaciones masa-carga de los estándares.

Limpie la jeringa de vidrio de 500 microlitros extrayendo 500 microlitros de metanol de grado HPLC y luego dispensándolo en un vaso de precipitados. Extraiga 500 microlitros de metanol de grado HPLC en la jeringa de vidrio y enjuague el sistema. Seleccione el módulo de configuración de métodos del software para establecer los parámetros.

Elija el menú del modo de escaneo e identifique los analizadores FTMS, luego haga clic en aceptar. A continuación, haga clic en los distintos iconos de la página de espectro de vista en tiempo real para configurar los parámetros como se detalla en el protocolo de texto. Para hacer funcionar el tampón, coloque 500 microlitros de tampón de formiato de amonio de cinco milimolares en la jeringa de vidrio de 500 microlitros.

Colóquelo en la base de la jeringa de la bomba MS y separe el tubo. Pase el tampón a través del tubo durante uno o dos minutos. Configure el nombre de archivo para la ejecución, seleccionando el icono de archivo y escribiendo el nombre del archivo.

Seleccione el botón adquirir datos en el módulo y recopile 150 escaneos. Haga clic en el botón Detener ejecución para detener la recopilación después de recopilar 150 exámenes. A continuación, abra el módulo del navegador de datos, vaya al menú de archivos y seleccione abrir, seguido del archivo en el cuadro de diálogo.

Verifique que no haya picos presentes en la sobrecarga de masa 483, 683, 1163 y 1363 que se asemejen a los complejos peptídicos o peptídicos de iones de mercurio. Ejecute la solución de proporción de mercurio a CGGC de uno a 0,5 colocando 250 microlitros de la muestra en la jeringa. Coloque la jeringa en la base de la jeringa de la bomba MS.

Conecte el tubo y cebe el aparato. Al adquirir 150 escaneos de datos, abra el módulo del navegador, vaya al menú de archivos y seleccione abrir. A continuación, seleccione el archivo en el cuadro de diálogo.

Verifique que el cromatograma contenga picos, incluido el del péptido CGGC solo. Un aspecto crítico de este procedimiento es asegurarse de que los analitos de la ejecución anterior se eliminen por completo antes de cada análisis de la mezcla de reacción. La minimización de la contaminación de la muestra de los analitos de arrastre se garantiza mediante la limpieza exhaustiva de la línea de inyección.

Lave la jeringa aspirándola con 500 microlitros de tampón de formiato de amonio y, a continuación, dispense el tampón en un vaso de precipitados. A continuación, seleccione el botón de residuos del MS y enjuague el tubo tres veces con 500 microlitros de tampón de formiato de amonio. Lave aún más la jeringa, aspirando 500 microlitros de metanol y dispensándola en un vaso de precipitados.

Enjuague el tubo una vez con 500 microlitros de metanol. Luego, seleccione el botón del detector de carga en el MS. Después de agregar 500 microlitros de tampón de formiato de amonio a la jeringa, coloque la jeringa en la base de la jeringa de la bomba MS. Conecte el tubo y cebe el aparato.

Seleccione un nombre de archivo para la ejecución del búfer como antes y adquiera 150 exámenes antes de hacer clic en el botón detener ejecución. Abra el módulo del navegador de datos para verificar que el cromatograma esté libre de picos de la ejecución anterior de mercurio a CGGC. Repita el procedimiento de análisis para las muestras de CGGC restantes.

Para preparar una proporción de uno a 0,5 de mercurio por la solución de CEEC, coloque 255 microlitros de tampón de formiato de amonio de cinco milimolares pH 7,5 en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Agregue 30 microlitros de solución de cloruro de mercurio de 0,75 milimolares en el tubo. Después de agitar la solución en vórtice durante 10 segundos, agregue 15 microlitros de una solución CEEC de 0,75 milimolares en el tubo.

Agita la solución durante otros 10 segundos. Y deje reposar la solución durante 10 minutos antes de la inyección del espectrómetro de masas. Repita el procedimiento de análisis utilizando muestras de CEEC y mezclas de reacción de iones de mercurio y CEEC.

Se muestra un espectro de masas representativo. Después de 10 minutos, los diversos tipos de complejos de péptidos de mercurio son visibles para la mezcla de reacción de uno a 0,5 de mercurio a CGGC, junto con un pico de péptidos de 339,08 y un dímero de péptidos de 677,15. Como se observó en el espectro anterior, la mezcla de reacción de mercurio a CGGC contiene algunos picos similares.

Por ejemplo, el pico 539.03 indica el complejo uno a uno de mercurio y péptido. La vista ampliada muestra el patrón isotópico de mercurio característico correspondiente a los siete isótopos principales de mercurio que se producen de forma natural. También se observa un complejo de uno a dos de mercurio a CGGC, como se informó anteriormente para el tripéptido de dicysteinilo de mercurio.

Este complejo aparece en las tres mezclas de reacción de mercurio y CGGC. Se analizó fácilmente mediante un patrón isotópico de mercurio distinto, con un pico monoisotópico en 877. Sin embargo, si el mercurio es excesivo, como en la mezcla de reacción de uno a 0,5 de mercurio a CGGC, se detecta un complejo adicional de dos a dos de mercurio a CGGC.

Esta firma isotópica de mercurio corresponde a un complejo de dos mercurios calculado utilizando el programa químico. La masa monoisotópica prototonada teórica corresponde a un valor de sobrecarga de masa de 1077, que es el noveno pico en el grupo isotópico observado. Se muestra un espectro representativo que muestra varios complejos de mercurio a los PECO.

De interés son los picos superpuestos asociados con el mercurio a los aductos CEEC en la carga más uno, mostrando un pico monoisotópico en 883. Y en la carga más dos, con un valor máximo monoisotópico calculado de 1765. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en menos de dos horas, si se realiza correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar desgasificar los tampones y enjuagar bien la línea para evitar el arrastre de analitos. Siguiendo este procedimiento, se pueden utilizar otros métodos como la espectroscopia de resonancia magnética nuclear de protones, carbono-13 y mercurio-199, o potenciometría, para proporcionar una determinación más precisa de los complejos de contenido en la fase de solución. Después de ver este vídeo, debería ser capaz de analizar varios complejos de mercurio y sus distintos patrones de distribución isotópica de mercurio y formaciones de carga utilizando espectrometría de masas orbitrap con ionización por electrospray, así como distinguir picos superpuestos mediante análisis de MS en tándem.

No olvide que trabajar con soluciones de mercurio puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones como el uso de equipo de protección personal al realizar este procedimiento.