ADN electroporación, aislamiento e Imagen de miofibras

El objetivo general de este procedimiento es aislar las fibras miométricas del flexo digital corto de ratones, de modo que el sarcolema pueda dañarse posteriormente mediante heridas láser. La principal ventaja de esta técnica es que se puede estudiar la función y localización de proteínas en fibras miométricas maduras sin tener que generar ratones transgénicos. Este método se puede adaptar para probar agentes farmacéuticos y otros métodos de herida celular.

Comience descongelando la solución de colagenasa. A continuación, prepare dos pocillos de una placa de 12 pocillos. Para que cada fibra quede aislada en una, se añade bien un mililitro de precalentamiento, DMEM más BSA se carga bien la otra con un mililitro de Precalentamiento uno x timbres.

Prepare también una fuente de puros de 35 milímetros con 10 mililitros de uno x timbres frescos. Después de quitar las patas del animal transfectado, sujete con alfileres la suela de un pie hacia arriba en el plato de sigar con agujas de calibre 30 a través de cada una de las cinco puntas de los dedos. Y en el tobillo, prepare cada pie de la siguiente manera.

Primero, corta la piel. Comienza en el tobillo y corta a lo largo de la línea del cabello hasta los dedos de los pies. Tenga cuidado de no rasguños los músculos debajo de la piel.

A continuación, agarra la piel en la base del tobillo y corta el talón. A continuación, levante el colgajo de piel con pinzas y apunte las tijeras hacia la piel, no hacia el músculo, y corte con cuidado el tejido conectivo para eliminar la piel. Ahora, para extirpar el músculo FDB, comience cortando el tendón grande en el talón para liberarlo del hueso.

A continuación, diseccione el haz de FDB del tendón blanco grande. Retire con cuidado el tejido conectivo adherido en este proceso. Una vez completado, levante el haz de los tendones subyacentes para revelar los tendones blancos brillantes que conducen a los dedos.

El paquete debe levantarse fácilmente. A continuación, libere el haz del pie cortando el tendón blanco cerca de los dedos. Transfiera el haz muscular al pocillo de DMEM más BSA y repita el proceso con el otro pie antes de continuar.

Ahora es posible comprobar el éxito de la electroporación, que se trata en el protocolo de texto. Realice esta comprobación diagnóstica en un microscopio fluorescente invertido. Si tiene éxito, la eficiencia de la transfección puede ser de hasta el 90%Después de que se hayan aislado todos los paquetes de FDB, agregue 100 microlitros de solución de colagenasa a cada uno.

Incube bien la placa en una incubadora humidificada a 37 grados centígrados con una atmósfera de 10% de dióxido de carbono durante aproximadamente una hora. Esto variará entre los modelos de enfermedad y también depende de la eficiencia de las enzimas. Una vez completada la incubación, transfiera con cuidado los paquetes de FDB a la solución de timbre.

A continuación, los pozos tritratan los haces con una pipeta de un mililitro con un orificio ensanchado, lo hacen suavemente unas 15 veces durante la iteración, observan que las fibras intactas caen en la solución. Si esto no ocurre, entonces la incubación en colagenasa debe extenderse. Atención adecuada a la digestión.

El tiempo y la fuerza de la valoración son críticos en este procedimiento. La digestión excesiva, la fragmentación de las fibras y el daño sarco leal pueden producir, lo que lleva a una preparación muscular subóptima. Ahora recoja las fibras aisladas en la solución y transfiera hasta medio mililitro de solución a la placa de cultivo.

Continúe dejando que los músculos se digieran durante otros 15 minutos. A continuación, repita la tación y vuelva a recoger las fibras aisladas si es necesario. Espere otros 15 minutos y repita el proceso por tercera vez.

Después de dejar que las fibras se adhieran a la placa durante al menos 15 minutos, diluya la colagenasa residual con timbres frescos o cambie la solución por completo. Las fibras ahora están listas para obtener imágenes de plásmidos. El ADN que codifica para la proteína marcada con fluorescencia se transfectó en el haz muscular FDB.

El promotor CMV es muy adecuado para este propósito. Se pudo observar fluorescencia en varias fibras miométricas aisladas, siete días después de la electroporación. A continuación, se digierió el músculo FDB y se aislaron las fibras miométricas en este proceso.

Puede producirse un daño a las fibras mio como lo indica la flecha blanca. Las flechas negras muestran el parloteo en la membrana del sarcolema. Dichas fibras fueron retiradas del experimento.

Las fibras miométricas no lesionadas se visualizaron utilizando DIC fm. El colorante número 4 64 estaba presente, con fluorescencia mínima de FM 4 64 en la membrana de miofibras antes de la lesión. La visualización de las fibras miométricas cargadas con FM por microscopía confocal reveló un mayor detalle.

La miofibra centrada está desprovista de núcleos. Dichos núcleos pueden influir en el análisis del colorante FM y deben evitarse para inducir daño a la membrana. Coloque la cruz ROI en el sarcoma FM D positivo, comience el protocolo de ablación de membrana una vez dominado.

Esta técnica se puede completar en aproximadamente dos horas. Y al intentar este procedimiento, es importante recordar que el tiempo de digestión está influenciado por la actividad de la colagenasa, los antecedentes genéticos y el tipo de modelo de enfermedad.