Name: ADN electroporación, aislamiento e Imagen de miofibras (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 52 s
Description: Aprende a realizar electroporación de ADN, aislamiento e imagen de miofibras en ratón para estudiar la función y localización de proteínas fluorescentes en fibras musculares maduras sin necesidad de generar animales transgénicos.

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Esta obra fue financiada por los Institutos Nacionales de Salud subvenciones NS047726, NS072027 y AR052646.

Los métodos de este estudio se realizaron en ética de acuerdo con la Escuela Feinberg de la Universidad Northwestern de Medicina Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión (IACUC) directrices aprobadas. Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento. 1. Procedimiento experimental in vivo electroporación del Flexor digitorum brevis (FDB) Muscle Bundle de Ratón <ol><li> Plásmidos de diseño para la expresión in vivo usando un promotor conocido para expresar en células de mamífero (por ejemplo, citomegalovirus, CMV) o en el músculo (por ejemplo, Músculo creatina quinasa, MCK) 6,7. Plásmidos más grandes pueden expresar en los niveles inferiores. El promotor CMV se ha utilizado ampliamente 6,7. </li><li> Purificar plásmidos de E. coli utilizando endotoxinas condiciones libres por las instrucciones del fabricante. Disolver el plásmido en, tampón TE libre de endotoxina estéril a 2-5 mg de plásmido / l. </li><li> Diluir y alícuota del plásmido a un concentration de 20 g de ADN en 10 l de endotoxina estéril libre de TE (2 g / l) tampón por inyección en un tubo de microcentrífuga estéril. Preparar una alícuota por inyección. </li><li> Diluir el stock de hialuronidasa a 1x estéril con salina tamponada con fosfato sin calcio y magnesio (PBS - / -) dando una concentración final de 8 unidades. Alícuota de 10 l de hialuronidasa diluida por inyección en un tubo de microcentrífuga estéril. </li><li> Anestesiar el ratón usando 2,5% isoflurano hasta sedado y no responde a la cola o pellizco del dedo del pie. Colocar el animal en posición supina sobre una almohadilla térmica o una mesa de calentamiento para mantener la temperatura corporal normal. </li><li> Limpiar la almohadilla de la pata del ratón con una aplicación alternada de un lavado de povidona yodada y alcohol tres veces usando una técnica de preparación se origina en el sitio de la aguja y se irradia hacia el exterior. Esta técnica mantiene el sitio de la aguja en una condición aséptica, minimizando introducción patógeno. </li><li> Inyectar la almohadilla plantar del XXe ratón con 10 l de la solución de hialuronidasa 1x (2 mg / ml = 8 unidades) entre la piel y el músculo usando una jeringa de 1 ml estéril. La hialuronidasa digiere componentes de la matriz extracelular para permitir la entrada más eficiente de plásmido en miofibras. Introduzca en la base del talón y hacer avanzar la aguja hacia los dedos de los pies. Suelte lentamente el líquido que se retrae la aguja. El sitio de la inyección bajo la piel se expandirá y comenzar a girar rosa. </li><li> Repita los pasos 1,6 y 1,7 en el pie contralateral. </li><li> Desconecte la anestesia y colocar el ratón de nuevo en la jaula. Deje que el ratón para recuperarse totalmente de la anestesia. </li><li> Espere 2 horas. </li><li> Repita los procedimientos de esterilización anestesiar y pies, pasos 1.5 y 1.6. </li><li> Inyectar el ADN de plásmido se diluyó en la almohadilla de la pata de la misma manera como la hialuronidasa. Asegúrese de que el volumen máximo es de 20 l o menos. Para expresión dual plásmido inyectar 20 g de cada plásmido con un volumen máximo de 20 y# 181; l o menos. </li><li> Repetir la inyección de plásmido en la almohadilla de la pata contralateral o usar el pie contralateral para inyecciones de control. </li><li> Al pie que fue inyectado inicialmente, levantar la piel lejos del músculo subrayando con unas pinzas finas y colocar una aguja de 27 G a través de las bolas de la piel cerca de los dedos de los pies en una posición perpendicular a la línea de sanar-dedo del pie. Tome un segundo G aguja estéril 27 y colocarla horizontalmente a través de la piel en el talón. Coloque agujas paralelas entre sí ~ 1 cm de separación. </li><li> El uso de pinzas de cocodrilo, electrodos de fijación a las agujas paralelas asegurándose de que las agujas no entren en contacto entre sí. El uso de la plastilina puede asegurar las abrazaderas en su lugar. </li><li> Conectar los electrodos a un estimulador eléctrico. </li><li> Electroporar el músculo mediante la aplicación de 20 pulsos, 20 ms de duración / cada uno, a 1 Hz, a 100 V / cm. Los dedos de los pies pueden contraerse con la estimulación. </li><li> Repita el procedimiento de estimulación en el pie contralateral si es necesario. </li><li>Retire las agujas. Limpie la almohadilla plantar con matorrales povidona yodada. </li><li> Apague la anestesia. Devuelva el ratón a la jaula de la recuperación y la actividad monitor. Si se llevó a cabo el procedimiento como se esperaba, el animal debe recuperar la deambulación normal dentro de 30 minutos y muestran ninguna diferencia en la deambulación o la actividad a nivel de comportamiento pre-inyección. Por lo tanto, no se necesitan analgésicos después del procedimiento. Después de la recuperación, devuelva el animal para el vivero. Nota: Expresión de proteínas se puede ensayar ya a los 48 horas después de la electroporación. Sin embargo, para permitir la recuperación más completa después de la electroporación, se prefiere el aislamiento y estudio de las miofibras 7 - 14 días después de la electroporación 10. La expresión puede ensayarse tanto tiempo como 4 semanas después de la electroporación. </li></ol> 2. Procedimiento Experimental para el aislamiento de los (FDB) Fibras Flexor Brevis <ol><li> Colagenasa deshielo. Para cada paquete FDB preparar dos pozos en una placa de cultivo tisular de 12 pocillos. En un pozo añadir 1 ml de pre-calentado Eagles Modificado de Dulbecco los medios de comunicación más albúmina de suero bovino (DMEM + BSA) y en el otro bien añadir 1 ml de solución de Ringer pre-calentado. Además, añadir frescas 10 ml de solución Ringers 1x a los 35 mm plato Sylgard. </li><li> Sacrificio del animal a través de CO 2 o la inhalación de gases anestésicos, seguido por dislocación cervical u otro método para asegurar la muerte. </li><li> Retire las patas traseras por encima de la articulación del tobillo usando una hoja de afeitar limpia y sumergir en solución 1x timbres en los 35 mm plato Sylgard. </li><li> Pin un pie apretado, único hacia arriba, hacia el plato Sylgard con 30 agujas G a través de cada una de las puntas de los pies y 5 en el tobillo. </li><li> Comenzando en el tobillo, cortar la piel hacia arriba el lado del pie a lo largo de la línea del cabello hacia los dedos, con cuidado de no cortar el músculo debajo de la piel. Repetir en el otro lado del pie. </li><li> Sosteniendo la piel en la base del tobillo con unas pinzas finas, cortar la piel a través del talón. </li><li> El levantamiento de la pielbatir con unas pinzas, señalar sus tijeras hacia la piel para no nick del músculo. Cortar el tejido conectivo subyacente, eliminando de forma eficaz la piel. </li><li> Para quitar el haz muscular FDB cortó el tendón grande en el talón para liberar el tendón del hueso. Sosteniendo el tendón con una pinza, diseccionar el paquete FDB del tendón grande blanco retirando cuidadosamente cualquier tejido conectivo unido a la FDB con unas tijeras. Si se realiza correctamente el paquete levantará fácilmente fuera de los tendones subyacentes revelan tendones blancas brillantes que llevan a los dígitos individuales. Cortar la FDB en los tendones cercanos a los dedos de los pies liberar el paquete desde el pie. </li><li> Coloque todo el paquete muscular en el pozo que contiene DMEM + BSA. </li><li> Repita con el pie contralateral. </li><li> Una vez que todos los músculos de FDB son aisladas, añadir 100 l de colagenasa a cada pocillo que contiene DMEM + BSA y el músculo. </li><li> Compruebe el éxito de la electroporación en un microscopio fluorescente invertido antes de la digestión. Si properl hechoy, arriba de 90% de eficiencia de transfección se puede lograr. </li><li> Incubar la placa en una humidificado, 37 ° C incubadora a 10% de CO 2 durante aproximadamente 1 hr. El tiempo de incubación puede variar dependiendo del modelo de la enfermedad y el fondo y el lote de colagenasa. </li><li> Después de 1 hora, transferir cuidadosamente el paquete FDB a la solución de Ringer único pozo que contiene. </li><li> Se tritura el paquete FDB en el pozo con la solución de Ringers utilizando una pipeta de 1 ml. Cortar el extremo de la punta de pipeta con una hoja de afeitar limpia de tal manera que el haz puede pasar fácilmente a través de la punta de pipeta. Se tritura suavemente el músculo (~ 15 veces) permitiendo que el haz pase a arriba y hacia abajo en paralelo a la punta. Fibras intactas se caerán en la solución de Ringer. Cuando las fibras no caen fácilmente el paquete, colocar el músculo de nuevo en solución de colagenasa. </li><li> Placa las fibras aisladas en el plato ~ 500 l por placa. </li><li> Permitir que el músculo para digerir en el pozo durante 15 min. </li><li> Repita los pasos 2.15a 2.17 hasta que el paquete disminuye de tamaño y la mayoría de las fibras se disocia del haz (por lo general un total de 2.3 veces). Una vez disociado el músculo pasa fácilmente a través de una punta de pipeta de 1 ml. </li><li> Deje que las fibras se adhieren al plato durante un mínimo de 15 min. Solución de Ringer fresco puede ser añadido a la placa para diluir la colagenasa residual o cambiado en función de las limitaciones de tiempo. Nota: Las fibras están ahora listos para la imagen. </li></ol> 3. Procedimiento experimental para la visualización de daño de la membrana inducida por láser utilizando microscopía confocal <ol><li> Fibras de carga inmediatamente antes de la obtención de imágenes con 300 l de 2,5 M FM 1-43 del FM 4-64 colorante en solución de Ringer. Generalmente, las fibras de la imagen 15 min a 2 hr después del aislamiento. Sin embargo, las fibras se pueden visualizar hasta después de aislamiento 24 horas. </li><li> Colocar el plato de fondo de cristal en un microscopio confocal equipado con un láser UV y un objetivo 60X / 63X. </li><li> Localiza una fibra. Asegúrese de que la fibra se une firmementeal plato tocando la base del microscopio. Excluir fibras que fueron dañados en el proceso de disociación. Fibras dañadas pueden contener vesículas de membrana, los altos niveles de captación de tinte FM, rizo o doblar intensamente. </li><li> Para inducir daño de la membrana sobre la fibra, posicionar el sarcolema en el centro de la ventana de imagen con un claro campo de núcleos. Concéntrese en el sarcolema utilizando el canal de colorante FM tal que el sarcolema es extremadamente agudo. </li><li> Coloque la cruz ROI en el sarcolema utilizando el canal de FM 4-64. </li><li> Irradiar un punto de 1 píxel en una potencia del 80% durante 3 s (~ 350 nm x 350 nm área). Colorante FM entrará en la celda en el sitio de la lesión. Potencia y el tiempo se pueden ajustar para aumentar o disminuir el área de insulto. </li><li> Capturar imágenes de la fibra antes del daño, en el momento del daño, cada 2 seg post-daño, entonces cada 10 seg durante un máximo de 5 min. Timing se puede ajustar dependiendo de la necesidad. Las imágenes individuales se pueden convertir en películas a intervalos en Imagen J. </li><li> Repita los pasos3.3 a 3.7 en un máximo de 3 fibras por plato. </li></ol>

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<li>Cai, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MG53+nucleates+assembly+of+cell+membrane+repair+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">MG53 nucleates assembly of cell membrane repair machinery.</a> Nat Cell Biol. 11, 56-64 (2009).</li>
<li>Marg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sarcolemmal+repair+is+a+slow+process+and+includes+EHD2%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Sarcolemmal repair is a slow process and includes EHD2.</a> Traffic. 13, 1286-1294 (2012).</li>
<li>Bansal, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+membrane+repair+in+dysferlin-deficient+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy.</a> Nature. 423, 168-172 (2003).</li>
<li>Defour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysferlin+regulates+cell+membrane+repair+by+facilitating+injury-triggered+acid+sphingomyelinase+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Dysferlin regulates cell membrane repair by facilitating injury-triggered acid sphingomyelinase secretion.</a> Cell Death Dis. 5, e1306(2014).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés.

El uso de electroporación para estudiar las proteínas etiquetadas con fluorescencia in vivo es ideal para el estudio de los músculos debido a la ausencia de modelos de líneas celulares adecuadas que reproducen fielmente toda la estructura celular del músculo. Este protocolo describe la utilización de la electroporación y la microscopía confocal de alta resolución para proporcionar imágenes detalladas de la localización de proteínas y la translocación después de la herida láser. Este método puede adaptarse para ...

Miofibras individuales son células sincitiales grandes, altamente organizados. Hay unos cuantos modelos de cultivo celular de los músculos; Sin embargo, estos modelos tienen como principal limitación que no diferencian plenamente en miofibras maduras. Por ejemplo, las líneas celulares C2C12 y L6 se derivan de ratones y ratas, respectivamente a 1-4. En condiciones de privación de suero, las células mononucleares &quot;-mioblastos como&quot; dejan la proliferación, se someten a la retirada del ciclo celular, y entran en el programa miogénica formando células multinucleadas con sarcómeros, conocidos como miotubos. Con las condiciones de cultivo prolongados, miotubos pueden exhibir propiedades contráctiles y &quot;contracción&quot; en la cultura. Líneas celulares humanas han también ahora han establecido 5. Además de estas líneas de células inmortalizadas, mioblastos mononucleares se pueden aislar a partir de músculo y en las condiciones similares de privación de suero formará miotubos. Estas líneas celulares y cultivos de mioblastos primarios son altamente utilizarful, ya que pueden ser transfectadas con plásmidos o transducidas con virus y se usaron para estudiar los procesos biológicos celulares básicas. Sin embargo, estas células, incluso cuando inducida para formar miotubos, carecen de muchas de las características sobresalientes de organización músculo maduro. Específicamente, miotubos son mucho menores que las miofibras maduras individuales y carecen de la forma normal de miofibras. Críticamente, miotubos carecen transversales (T-) túbulos, la red membranosa necesaria para una eficiente Ca 2 + en libertad en todo el sarcoplasma. Un método alternativo para mioblastos primarios o líneas de células miogénicas implica el uso de miofibras maduras. La transgénesis se puede emplear para establecer la expresión de proteínas etiquetadas, pero este método es costoso y consume tiempo. In vivo electroporación de músculo de ratón se ha convertido en un método preferido por su velocidad y fiabilidad 6-10. Los métodos para la electroporación in vivo y el aislamiento eficiente de miofibras hahe sido optimizado para el músculo flexor corto de los dedos 6 ratón (FDB). Los métodos se pueden completar fácilmente y son mínimamente invasivo para inducir la expresión in vivo a partir de plásmidos. Este enfoque está ahora combinada con métodos de imagen de alta resolución de imagen, incluyendo después de la interrupción del laser del 6,7 sarcolema. La combinación de colorantes y expresión de proteínas marcadas con fluorescencia fluorescentes puede ser usado para monitorear los procesos biológicos celulares en miofibras maduras.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11995-073</td><td>Medios de disección Dilución: 50 ml +100 g BSA</td></tr><tr><td>Colgenasa, Tipo II</td><td>Life Technologies</td><td>17101-015</td><td>Digestión de fibra Dilución: 160 mg / 4 ml DMEM (stock 40 mg/ml alícuota)</td></tr><tr><td>Platos Falcon de 12 pocillos</td><td>Fisher Scientific</td><td>877229</td><td>Solución de anillos de digestión</td></tr><tr><td>de</td><td></td><td></td> <td>fibraDigestión de fibra e imagen dilución: 146 mM NaCl 5 mM&nbsp; &nbsp; KCl 2 mM&nbsp; &nbsp; CaCl2 1 mM&nbsp; &nbsp; MCl2 10 mM HEPES pH7.4 en H2O</td></tr><tr><td>1 ml Pipetas</td><td>Axygen</td><td>T-1000-C-R</td><td></td></tr><tr><td>Cuchillas de afeitar</td> de digestión <td>Personna</td><td>94-120-71</td><td>Digestion</td></tr><tr><td>Precision Glide 30 G</td><td>aguja BD Biosciences</td><td>305128</td><td>Disection</td></tr><tr><td>1x PBS (-/-)</td><td>Life Technologies</td><td>14190-250</td><td>Disección</td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-366-794</td> Pinza de <td>disección</td></tr><tr><td></td><td>FST de Dumont</td><td>#5/45</td><td></td></tr><tr><td>Pinza</td> de disección <td>Roboz</td><td>RS-4913</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de</td> disección <td>World Precision Instruments</td><td>500260</td><td>Disección</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td>Medios de disección Dilución: 100 mg/50 ml DMEM</td></tr><tr><td>Falcon Platos de 60 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>08772B</td><td>Disección: se utiliza para sostener el</td></tr> estimulador de <tr><td>electroporación</td><td>de</td><td></td><td></td> arcilla</tr> sylgard<tr><td>&nbsp;</td><td>Hierba</td><td>s88x</td><td>Pinzas de electroporación</td></tr><tr><td></td><td>Radio Shack</td><td>270-356</td><td>Electroporación</td></tr><tr><td>Triadine</td><td>Aplicare</td><td>82-220</td><td>Electroporación</td></tr><tr><td>Precision Glide 27 G aguja</td><td>BD Biosciences</td><td>305136</td><td>Simulador de Electroporación</td></tr><tr><td></td><td>Grass</td><td>SIU-V</td><td>Electroporación</td></tr><tr><td>Gauze</td><td>Covidien</td><td>2146</td><td>electroporación</td></tr><tr><td>Hialuronidasa</td><td>Sigma</td><td>H4272</td><td>Inyección Dilución: Agregue 160 ul PBS (1x) a 40 &micro; l 5</td></tr><tr><td>jeringas de insulina U-100 de 1 cc de stock (28G1/2)&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>329420</td><td>Inyección</td></tr><tr><td>Tubos Eppendorf Fisher</td><td>Scientific</td><td>02-682-550</td><td>Inyección</td></tr><tr><td>35 mm fondo de vidrio Plato de micropocillo</td><td>MaTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>Microscopía</td></tr><tr><td>FM 4-64</td><td>Life Technologies</td><td>T-13320</td><td>Microscopía Dilución: Final 2.5 ug/ml</td></tr><tr><td>FM 1-43</td><td>Life Technologies</td><td>T-35356</td><td>Microscopía Dilución: Final 2.5 ug/ml</td></tr><tr><td>Plásmido Libre de Endotoxinas Maxi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td>Purificación de Plásmidos</td></tr></tbody></table>

adn electroporación, aislamiento e imagen de miofibras

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

El músculo maduro tiene una estructura única que es susceptible a la obtención de imágenes de células vivas. En este trabajo describimos el protocolo experimental para la expresión de proteínas marcadas con fluorescencia en el músculo flexor corto de los dedos (FDB). Las condiciones se han optimizado para proporcionar un gran número de miofibras de alta calidad que expresan el plásmido electroporado al tiempo que se minimiza el daño muscular. El método emplea etiquetas fluorescentes en varias proteínas. La combinación de este método de expresión con la microscopía confocal de alta resolución permite la obtención de imágenes de células vivas, incluidas las imágenes después del daño inducido por láser. Los tintes fluorescentes combinados con imágenes de proteínas marcadas con fluorescencia proporcionan información sobre la estructura básica del músculo y su respuesta a los estímulos.

La electroporación es una técnica mínimamente invasiva que introduce de manera eficiente plásmido de ADN purificado en el flexor digitorum brevis (FDB) haz muscular (Figura 1A). Siete días después de la transfección con fluorescencia de proteínas marcadas se visualizaron en miofibras aisladas (Figura 1B). Fibras aisladas se sembraron a continuación, y se prepararon para formación de imágenes en un microscopio confocal. Las fibras pueden ser sometidos a l...

Este protocolo utiliza la electroporación para introducir y expresar proteínas marcadas con fluorescencia en fibras musculares de ratón. Después de la recuperación después de la electroporación, las fibras se aíslan. A continuación, se obtienen imágenes de las fibras individuales mediante microscopía confocal de alta resolución para visualizar la estructura muscular.

ADN electroporación, aislamiento e Imagen de miofibras

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...

El objetivo general de este procedimiento es aislar fibras miológicas del flexor digitorum brevis de ratones, para que posteriormente la sarcolema pueda ser dañada mediante una lesión con láser. La principal ventaja de esta técnica es que permite estudiar la función y la localización de proteínas en fibras miológicas maduras sin necesidad de generar ratones transgénicos. Este método puede adaptarse para probar agentes farmacéuticos y otros métodos de lesión celular.Comience descongelando la solución de colagenasa. A continuación, prepare dos pocillos de una placa de 12 pocillos. Para cada fibra que se vaya a aislar en uno de los pocillos, agregue un mililitro de DMEM precalentado más BSA y cargue el otro pocillo con un mililitro de Ringer 1x precalentado.Prepare también un platillo de cigarro de 35 milímetros con 10 mililitros de ringer fresco al uno por ciento. Después de retirar los pies del animal transfectado, clave un pie con la planta hacia arriba en el platillo de cigarro mediante agujas de calibre 30 a través de la punta de cada uno de los cinco dedos y en el tobillo. Prepare cada pie como sigue.Primero, corte la piel. Comience en el tobillo y corte a lo largo de la línea d

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Se describen los procedimientos detallados para la transfección eficiente de ADN plásmido en las fibras de los músculos del pie de ratones vivos utilizando electroporación y la visualización posterior de la expresión de proteínas mediante microscopía de fluorescencia.

La transfección de ADN de músculos esqueléticos de mamíferos con En Vivo La electroporación

Este video muestra el aislamiento de miofibras individuales del músculo extensor largo de los dedos murino (EDL) recolectado. Las miofibras aisladas se pueden cultivar para estudiar la actividad de las células madre musculares asociadas a las miofibras.

Aislamiento de miofibras: una técnica para obtener miofibras individuales a partir de músculo extensor largo de los dedos (EDL) de ratón

Aislamiento y cultivo de fibras musculares es el estándar de...

Aislamiento y cultivo de fibras individuales y sus células satélite del músculo esquelético adulto

El pez cebra es un sistema emergente para modelar enfermedades humanas del músculo esquelético. Se describe un método rápido y eficaz para aislar las miofibrillas del músculo esquelético de pez cebra embrionario y larval. Este método proporciona una preparación de alta densidad miofibra adecuada para el estudio de la morfología sola fibra muscular esquelética, localización subcelular de proteínas, y la fisiología muscular.

Análisis de embriones y larvas de pez cebra esqueléticas miofibras de Preparativos disociadas

Describimos una nueva técnica experimental que llamamos mínimamente invasiva del músculo incrustación (MIME), que se basa en la evidencia que el tejido muscular esquelético contiene células viables miógenas que pueden facilitar la miogénesis mediada por células de donantes cuando están implantados en un músculo de host.

Mínimamente invasiva músculo incrustación (MIME) - una nueva técnica Experimental para facilitar la miogénesis mediada por células de donantes

Diferenciación del músculo esquelético es un proceso altamente dinámico, que particularmente se basa en posición nuclear. Aquí, describimos un método para seguir los movimientos de los núcleos de proyección de imagen de vivo de la célula durante la diferenciación y myotube formación de mioblastos y se realiza una caracterización cuantitativa de la dinámica de los núcleos de extracción de información de seguimiento automático.

Explotando en la proyección de imagen a los núcleos de la pista durante la fusión y diferenciación de mioblastos

Aquí se presenta un protocolo para evaluar las propiedades contráctiles de los miofibriles musculares estriados con resolución nano-Newton. El protocolo emplea una configuración con una sonda de fuerza óptica basada en interferometría. Esta configuración genera datos con una alta relación señal-ruido y permite la evaluación de la cinética contráctil de myofibrils.

Aislamiento de myofibrils de biopsias de músculo esquelético y determinación de la función contráctil con un transductor de fuerza de resolución Nano-Newton

Aquí, proponemos un método para obtener eficientemente fibras musculares individuales en etapas de desarrollo postnatal tempranas a partir del modelo de ratón lamin 8-11 mutante homocigoto, un modelo muy severo para la distrofia muscular de Emery-Dreifuss (EDMD).

Aislamiento de miofiber único y cultura de un modelo murino de distrofia muscular de Emery-Dreifuss en el desarrollo post-Natal temprano

En este protocolo se describe un método de cultivo y análisis funcional in vitro para células madre musculares, que conserva la mayoría de sus interacciones con su nicho endógeno.

Ensayo único de cultivo de Myofiber para la evaluación de la funcionalidad de las células madre musculares adultas ex vivo

Describimos un protocolo para obtener fibras disociadas enzimáticamente de diferentes longitudes y tipos a partir de seis músculos de ratones adultos: tres de ellos ya descritos (flexor corto de los dedos, extensor largo de los dedos, sóleo) y tres de ellos disociados con éxito por primera vez (extensor largo del dedo gordo, peroneo largo, peroneo largo de los dedos cuartos).

Fibras musculares esqueléticas cortas, intermedias y largas intactas obtenidas por disociación enzimática de seis músculos de las extremidades posteriores de ratones: más allá del flexor corto de los dedos

Este protocolo describe el aislamiento de fibras musculares individuales intactas del sóleo oxidativo y el establecimiento de cultivos de mioblast altamente purificados derivados de estas fibras. El procedimiento optimizado proporciona de forma fiable aproximadamente 300–500 miofibras intactas por ratón, permitiendo análisis moleculares y celulares posteriores.

Ensayo de aislamiento de fibra única para la evaluación del comportamiento oxidativo de miofibras

Aprende a realizar electroporación de ADN, aislamiento e imagen de miofibras en ratón para estudiar la función y localización de proteínas fluorescentes en fibras musculares maduras sin necesidad de generar animales transgénicos.

ADN electroporación, aislamiento e Imagen de miofibras

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