Name: Preparación y ensayo de impedancia basada en biochips fluido con células RTgill-W1 para evaluación rápida de muestras de agua potable para la toxicidad (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Aprende a preparar biochips con células epiteliales de branquias de trucha arcoíris para evaluar la toxicidad del agua potable mediante sensores de impedancia portátiles. Este método permite detección rápida en campo.

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Este trabajo fue apoyado por el Comando de Investigación Médica y Material del Ejército de EE. UU. y por el programa de Investigación de Innovación en Pequeñas Empresas y Transferencia de Tecnología para Pequeñas Empresas; Contrato Nº W81XWH-13-C-0093. Nos gustaría agradecer a la Dra. Lucy Lee de la Universidad de Fraser por ser nuestra mentora de cultivo celular RTgill-W1, y al Dr. Niels Bols de la Universidad de Waterloo por el desarrollo de la línea de células RTgill-W1.

1. Preparación de la Prueba de Materiales NOTA: Con el fin de preparar los biochips para la prueba, varios matraces confluentes de células RTgill-W1 tiene que estar listo. Una buena estimación de la cantidad de frascos que se necesita es un confluente T175 matraz durante 16 biochips para ser sembradas. <ol><li> Realice los siguientes pasos en un armario de clase II biológica de seguridad (biohood) utilizando una técnica aséptica. Utilizar etanol al 70% para la desinfección del biohood y cualquier material colocado en la campana. <ol><li> Preparar sustrato fibronectina para los biochips fluídicos descongelando un vial 1 mg de fibronectina y diluir en 100 ml de estériles L 15-media para una concentración de 10 mg / ml. Congelar en alícuotas de 40 ml en tubos de 50 ml cónicos de polipropileno estériles a -20 ° C. Descongelar a temperatura ambiente varias horas antes de sembrar los biochips. Una vez descongelado, no volver a congelar. </li><li> Preparar medios de cultivo celular mediante la adición de 50 ml de suero bovino fetal, 5 ml de 200 mM de una sup L-alanil-L-glutaminacomplemento, y 5 ml de una solución de penicilina / estreptomicina (10.000 unidades de penicilina / ml y / ml 10 000 g de estreptomicina) stock a 500 ml de L 15-media. Esto dará lugar a 560 ml de medio de cultivo celular que contiene 9% de suero. Refrigerar. Nota: Este será el medio de cultivo celular completo que se utiliza para los frascos de cultivo y los biochips. </li></ol></li><li> Los viales en polvo Medios <ol><li> Preparar con anticipación viales de 0,1 copita de tapa a presión que contienen 60 mg ± 0,5% de polvo de L-15ex usando un dispensador de polvo automatizado. Etiquetar los viales con la fecha en que se dispensa el polvo y viales refrigerar (en cantidades de 50) en bolsas de plástico metalizadas pueden volver a cerrar; que contienen cada uno tres 1 g de gel de sílice paquetes de desecación. Nota: Los viales de L-15ex medios de comunicación en polvo se pueden hacer y se almacenan durante un máximo de 9 meses antes de la prueba. </li></ol></li><li> Hacer una solución de 100 ml de 20% de lejía por dilución de lejía de uso doméstico con agua desionizada (DI). Estiman que se necesitarán 5 ml de solución de cloro por cada biochip. </li><li> Hacer conjuntos de tubos biochip mediante la reducción de 27 mm secciones de tubo biocompatible autoclavable (2 secciones para cada biochip para ser sembradas) y colocar los dos extremos del tubo con accesorios Luer de policarbonato de deslizamiento. Coloque los conjuntos de tubos en una bolsa de autoclave y la autoclave durante 8 minutos a 134 ° C. También tapones autoclave biochip (2 por biochip) en una bolsa separada en la misma configuración. </li><li> agua DI autoclave durante 30 minutos at121 ° C. Nota: Esta agua será utilizada para el lavado biochips después de la siembra. Estiman que serán necesarios 10 ml por cada biochip. Nota: El volumen real de cada canal de biochip es de 2 ml, pero 5 ml de agua estéril se aclara a través de cada canal después de la eliminación de la solución de lejía. </li><li> Hacer conjuntos de tubos de inyección de la jeringa mediante la reducción de 27 mm secciones de tubo biocompatible y fijar accesorios de deslizamiento luer macho a ambos extremos de la tubería. Coloque los conjuntos de tubos en una bolsa de esterilización de papel sellado térmico y autoclave durante 8 minutos a 134 y# 176; C. </li></ol> 2. Procedimiento neumático biochip Siembra Nota: Realizar todos los procedimientos en los que los biochips o los medios de comunicación se maneja de una cabina de seguridad biológica clase II utilizando una técnica aséptica. <ol><li> Veinticuatro horas antes de la siembra programada, eliminar los biochips de envasado fabricante en el biohood y colocar en estuches de instrumentos de plástico esterilizados. </li><li> Esterilizar los biochips utilizando una solución de lejía al 20% de la siguiente Nota: Históricamente, este procedimiento de blanqueo ha impedido el crecimiento de hongos en los biochips durante el almacenamiento a largo plazo en el caso de que la esterilización por plasma de los biochips hecho por el fabricante no era eficaz. <ol><li> El uso de un 20 ml de jeringa estéril con una tubería de inyección de jeringa conjunto unido y trabajando en el biohood, inyectar 2 ml de la solución de cloro 20% en cada canal del biochip. Permitir a los biochips para sentarse durante 1 hora con la solución de cloro. </li><li> Después de una hora, asp vacíoiRate la solución de cloro de ambos canales a través de un conjunto de deslizamiento luer macho estéril conectada a la tubería de succión de vacío. Utilice uno de los conjuntos de tubos biochip como un drenaje que se enjuaguen los biochips. </li><li> Con una jeringa de 20 ml estéril conectada a un conjunto de inyección jeringa estéril, enjuague cada canal del chip con 5 ml de agua estéril, permitiendo que el exceso de agua se drene en un recipiente en el biohood. Entonces vacío aspirado fuera del agua como se acaba de describir para el blanqueo y coloque los biochips de nuevo en las cajas de los instrumentos de plástico y dejar en el biohood hasta sembrada con células al día siguiente. </li></ol></li><li> Sesenta minutos antes de la siembra de los biochips, inyectar 2 ml de la solución de fibronectina 10 mg / ml en cada canal del biochip. Dejar los biochips en el biohood de 60 min, y luego la aspiradora aspirado fuera de la fibronectina (como se describe en el paso 2.2.3) antes de la siembra el biochip con las células. Coloque dos secciones de los conjuntos de tubos estériles biochip (consultela sección 1.4) en los puertos de los biochips. </li><li> Trypsinize uno confluentes RTgill-W1 matraz T175 por cada 16 biochips utilizando procedimientos descritos en la descripción del producto de lámina de la American Type Culture Collection (ATCC) 16. <ol><li> Aspirar los medios de comunicación del matraz (s) confluente de células. </li><li> Enjuagar la capa de células con 15 ml de PBS y luego aspirar fuera. </li><li> Añadir 6 ml de tripsina / EDTA a la capa de células en cada matraz T175 y permiten a las células trypsinize de ~ 5 min. </li><li> Añadir 15 ml de medio de cultivo celular completo L-15 a cada matraz para detener la tripsinización. </li><li> Se combinan las suspensiones de células en un recipiente estéril desechable. Nota: El tamaño del envase puede variar de 150-500 ml, dependiendo de la cantidad de biochips se sembró. Estiman que se necesitarán 5 ml de suspensión celular por biochip. </li></ol></li><li> Retire ~ 1 ml de la suspensión celular y colocar en un tubo de microcentrífuga para el recuento. El uso de un microscopio de campo claro con un objecti 10Xve y un hemocitómetro, el recuento una alícuota de 10 l de las células y calcular el volumen de completa L-15 medios de cultivo celular necesaria para alcanzar una suspensión de células de 2,5 x 10 5 células / ml. Nota: Si se utiliza la suspensión de células para sembrar matraces para continuar con la cultura, este sería el momento para hacerlo. Ajustar la concentración de la suspensión de células usando completa medios de cultivo celular L-15. </li><li> El uso de un estériles de 20 ml syringeattached a un conjunto de tubería de inyección de jeringa estéril (ver sección 1.6), inyectar 2,5 ml de la suspensión celular en el puerto exterior de cada canal del biochip (es decir, los puertos que no tienen el tubo adjunto), permitiendo que algunos de la suspensión de células extra para fluir fuera de la tubería en un contenedor de residuos en el biohood. Nota: Esto asegurará que todo el canal y el tubo conectado se llena de la suspensión celular. <ol><li> Crear un bucle cerrado para cada canal de biochip mediante la inserción del extremo libre de la manguera con el Fitti luerng en los puertos exteriores para cada canal. </li><li> Limpie cualquier exceso de los medios de comunicación fuera de los circuitos cerrados con una toalla de papel humedecido con 70% de etanol y colocar los biochips de nuevo en la caja de plástico en un 20 ° C incubadora. Dé a cada biochip un número de identificación único. </li></ol></li><li> En los días 4 y 7, eliminar los biochips de la 20 ° C incubadora y reponer los medios de comunicación en todos los biochips con medios de cultivo celular completo L-15 de temperatura-equilibrada. Seguir el mismo procedimiento que en el paso 2.6, salvo el uso justo L-15 medios de cultivo celular en vez (sin suspensión de células). Coloque los biochips de nuevo en la incubadora de 20 ° C después de la alimentación el día 4. <ol><li> Después de la alimentación el día 7, retirar y desechar las mangueras de los chips e insertar los tapones de drenaje tratadas en autoclave en los biochips. </li><li> Coloque los biochips en una caja en un incubador a 6 ° hasta que se usaron para la prueba. Nota: Las fichas se pueden almacenar a temperaturas de refrigeración para un máximo de 9 meses y siguen siendo viables para i prueban los lectores ECIS. </li></ol></li></ol> 3. Prueba de ECIS con biochips <ol><li> Preparar sustancias químicas de prueba si se utiliza. (Ver Brennan, et al., 2012 7 para la preparación de productos químicos de ensayo). </li><li> Retire lector de ECIS y materiales de prueba a partir de la caja de transporte. Retirar un biochip preparado desde el 6 ° C incubadora. Coloque el biochip en una toalla de papel. Encender el lector de ECIS. </li><li> El uso de jeringas de 10 ml, dispensar 10 ml de agua de control en un 0,5 oz marcado frasco de plástico transparente de control y 10 ml de la muestra de ensayo en un 0,5 oz jarra de prueba clara plástica etiquetada. Nota: 1) Asegúrese de eliminar las burbujas para una medición precisa. 2) Las jeringas y frascos están codificados por color; azul para el control y el rojo para la prueba. </li><li> Retire los dos viales de medios de comunicación en polvo de las bolsas de papel de aluminio. Abre uno de los viales de comunicación en polvo (el uso de herramientas de usos múltiples, si es necesario) y verter todo el contenido de un vial en el frasco con agua de control, dejando caer todo el frasco ensolución también. Repita este procedimiento con la jarra de prueba. Tapar y agitar los frascos para asegurar que el polvo se disuelva. </li><li> Llenar cada uno de los colores jeringas de 10 ml con 9 ml de cualquiera de control (jeringa azul) o soluciones de respectivos viales de prueba (jeringa rojo). Eliminar las burbujas de aire de las jeringas. </li><li> Retire los tapones de los puertos de biochips y conectar el desagüe. </li><li> Coloque el biochip en la bandeja de plástico extraíble en el lector ECIS y cierre la tapa. </li><li> Adjuntar jeringas llenas a los puertos de biochips exteriores y conecte el émbolo de la jeringa. </li><li> En la pantalla principal, seleccione &quot;SIGUIENTE&quot; para iniciar la pre-prueba. Nota: El software lector comprobará impedancias. Si impedancias están dentro del rango establecido por el usuario (por lo general entre 1.000 y 3.000 ohmios) la pantalla se registrará &quot;Cartucho Passed&quot; como se indica en la figura 3, e instruir al usuario que seleccione &quot;Siguiente&quot; y el software pasará a la etapa 3.10). Si las impedancias no están dentro deel rango de ajuste debido a un biochip defectuoso o conexión defectuosa del biochip para el lector (por lo general debido a una mala alineación de los electrodos), a continuación, la pantalla se registrará &quot;Cartucho Error&quot; y el usuario tendrá la opción de &quot;Cancelar&quot; o &quot;Verificar&quot; la prueba. <ol><li> Seleccione &quot;Cancelar&quot; para volver al paso 3.9). Seleccione &quot;Verificar&quot; para continuar con el paso 3.10) después de recibir un mensaje de &quot;Cartucho Passed&quot; y seleccionar &quot;Siguiente&quot;. Nota: Es mejor tomar el biochip y visualmente inspeccione si tiene defectos o fugas si un &quot;cartucho falló&quot; mensaje es recibido antes de proceder a un nuevo biochip. </li></ol></li></ol><img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/53555/53555fig3.jpg" /> Figura 3:. ECIS lector de pantalla de un biochip con lecturas de la impedancia aceptables La captura de pantalla muestra las lecturas de impedancia en ohmios iniciales de cada uno de los 4 coNTROL electrodos (CE) y 4 electrodos de muestras de ensayo (SE) dentro del biochip de fluidos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53555/53555fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <ol start="10"><li> Cuando se le solicite por el lector, introducir información de la muestra usando un teclado en pantalla y luego seleccione &quot;Aceptar&quot; cuando haya terminado. Nota: El software lector de ECIS sellará automáticamente cada conjunto de datos con la fecha, hora y otra información introducida por el usuario; tales como el número biochip, y el tipo de producto químico y la concentración. Dos minutos de datos de impedancia se recoge del biochip insertado y un temporizador en la pantalla de cuenta regresiva del tiempo. </li><li> Después de dos minutos cuando se lo solicite instrucciones que aparecen en pantalla que parpadean dentro de un cuadro rojo, pulsar &quot;NEXT&quot;. Cuando se le pregunte por una caja verde parpadeante &quot;inyectar muestras ahora&quot;, inyectar el control y los medios de prueba desde las jeringas unidas simultáneamente en el biochip channels. Deje las jeringas en su lugar en los biochips cuando haya terminado. Nota: Los valores de impedancia serán recogidos una vez por minuto durante 60 minutos. Si el software lector de ECIS determina que el canal de tratamiento es estadísticamente diferente del canal de control en cualquier punto entre 10 y 60 minutos después del comienzo de la prueba, a continuación, la visualización en pantalla indicará que la muestra está &quot;contaminado&quot;. Si el tratamiento no es diferente de la del canal de control, a continuación, la pantalla indicará &quot;no hay contaminación detectado&quot; al final de la prueba de funcionamiento. </li><li> resultados de las pruebas de récords como contaminada o no contaminados para cada muestra. </li><li> Al final de la prueba de funcionamiento, retirar y desechar el biochip. Enjuague y seque al aire las jeringas, viales de ensayo y bandeja de plástico extraíble que albergaba el biochip durante las pruebas. Nota: El lector de ECIS tiene 4 GB de almacenamiento a bordo para el software operativo, los modelos de control y los archivos de prueba generados a partir de la ejecución de un ensayo. Esto permite varios THousand archivos de prueba para ser almacenados en el lector. Los archivos pueden ser recuperados con una unidad de salto USB y transferir a un ordenador para su posterior análisis con fines de investigación, si se desea. </li></ol>

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Las opiniones, interpretaciones, conclusiones y recomendaciones son de los autores y no están necesariamente respaldadas por el Ejército de los EE. UU. Las citas de organizaciones comerciales o nombres comerciales en este informe no constituyen un respaldo o aprobación oficial del Departamento del Ejército de los productos o servicios de estas organizaciones. Los autores Linda M. Brennan y Mark W. Widder, ambos del Centro de Investigación de Salud Ambiental del Ejército de EE. UU., Declaran que no tienen intereses financieros en competencia. Michael Mayo, Michael McAleer y Alex Greis son empleados de Nanohmics que produce los biochips e instrumentos desechables utilizados en este artículo.10251980

La tecnología ECIS tuvo un buen desempeño en un entorno de laboratorio y fue capaz de detectar posibles contaminantes del agua en concentraciones que son relevantes para la salud humana. La portabilidad y el embalaje de la tecnología hace que sea propicio para el uso en el campo. Los pasos críticos en el protocolo para el éxito de la tecnología son los siguientes: 1) Mantener condiciones asépticas durante el cultivo, la siembra, y la alimentación de los biochips, 2) Mantener los biochips sembradas en condiciones refrigeradas hasta que esté listo para la prueba ya que las células RTgill-W1 no sobrevivir mucho tiempo una vez que se someten a temperaturas por encima de 25 ° C, 3) pesar con precisión la L-15ex en los viales de los medios en polvo y medir con precisión las muestras de agua para evitar la producción de falsos positivos, que pueden ser causados ​​por un cambio en la osmolalidad de los medios de comunicación en lugar de la toxicidad de la muestra, 4) Siga las instrucciones del usuario en la pantalla ECIS para ejecutar las pruebas. El software en el lector alertará al usuario si un biochip es inaceptable para las pruebas (en base a las lecturas iniciales de impedancia) cuando el biochip se inserta primero en el lector. Si los niveles de impedancia son inaceptables para la prueba, el software no permitirá que el usuario para proceder con la prueba hasta que se utiliza un nuevo biochip. Las razones para las lecturas de impedancia inaceptables son por lo general debido a una ligera falta de alineación de los electrodos biochip con los pasadores lector ECIS o fugas de fluido a lo largo de uno de los bordes de encolado del biochip. Hay algunos límites a esta tecnología debido a que el sensor de ECIS sólo se ha probado con agua potable y no con las aguas superficiales. Las células RTgill-W1 que se encuentran en el biochip no pueden tolerar la congelación o las temperaturas muy por encima de 25 ° C durante períodos prolongados de tiempo (período de tiempo puede ser de horas o días dependiendo de la temperatura. Los biochips funcionan mejor en un rango de temperatura de refrigeración de 7 temperatura ambiente. Ellos están listos para su uso inmediato, sin embargo, justo después de haber sido removed de una cámara frigorífica. contenedores portátiles de almacenamiento en frío son utilizados actualmente por personal del Ejército en el campo de los suministros sensibles a la temperatura. Estos mismos contenedores se pueden utilizar para el transporte biochip cabeza de serie. Otro límite para esta tecnología es que a pesar de que es un sensor de toxicidad de banda ancha, no responden bien, en todo caso, a los compuestos inhibidores de la colinesterasa, tales como algunos pesticidas. Para llenar este vacío capacidad, el sensor ECIS está diseñado para ser utilizado conjuntamente con un ensayo de prueba rápida de pesticidas disponibles en el comercio cuando el análisis de muestras de agua con el fin de proporcionar al usuario una gama más amplia de pruebas de toxicidad. El kit es un ensayo enzimático rápido diseñado para detectar pesticidas organofosforados y carbamatos dentro de 30 min. El sensor de ECIS complementa el wqas-PM (Sistema de Análisis de la Calidad del Agua - Medicina Preventiva) Sistema de prueba de agua en el campo, utilizado actualmente por personal de medicina preventiva para detectar militares, Arsenic, plomo, o cianuro en una muestra de agua potable. Aunque el sensor ECIS no va a identificar lo que es el contaminante, se indicará si ciertos metales o compuestos orgánicos están presentes, lo que indica que el agua puede no ser adecuado para el consumo humano. Los resultados de la prueba ECIS están disponibles dentro de una hora. Las muestras de agua a continuación, pueden ser enviados para su posterior análisis para la identificación del contaminante, si se obtiene un resultado positivo de la prueba. Como se describió anteriormente, el lector ECIS está diseñado para ser parte de un sistema que incluye un kit de ACE enzimática separado con el fin de cubrir un amplio espectro de detección de contaminantes. Ambos de estos lectores están siendo empaquetados en una caja resistente para transporte de campo para uso en campo por los soldados.

El objetivo general fue desarrollar un método para la siembra de células, el almacenamiento y la prueba de biochips de fluidos en el biosensor ECIS. El objetivo para el desarrollo de este biosensor era para satisfacer las especificaciones del Ejército de EE.UU. para un dispositivo portátil de campo que podría detectar la posible contaminación de los suministros de agua potable que se utiliza por los soldados. Los requisitos para el sensor de toxicidad fueron que podría detectar un amplio espectro de compuestos industriales tóxicos rápidamente (dentro de una hora) a concentraciones relevantes para la salud humana, que el dispositivo sea de campo portátil, y los componentes biológicos tendría una vida útil de al menos nueve meses. Refrigeración, pero no helada, de los componentes perecederos era aceptable. Históricamente, las tecnologías de campo portátiles de análisis de agua con un componente biológico para ellos (tales como anticuerpos, enzimas o ácidos nucleicos) han sido específico del analito 1-3. La desventaja de estos tipos de biosensores es que van a ONLy detectar un tipo de producto químico a la vez. Se necesitan sensores múltiples si se sospecha de que más de un producto químico está presente. Si un sensor específico no está en el repertorio de evaluación, los contaminantes químicos en el agua podrían fácilmente no se detectan. sensores de toxicidad de base amplia, por el contrario, tienen el potencial para llenar esta brecha tecnológica. Estos por lo general tienen un componente celular a ellos 4-8. Las ventajas de los biosensores de toxicidad son de amplia base que pueden detectar la presencia de una amplia variedad de contaminantes químicos, incluidas las mezclas y las incógnitas, en un período relativamente corto de tiempo 5,9,10. El concepto de usar la medición de la impedancia eléctrica de monocapas de células como una posible toxicidad sensor, que también se conoce como eléctrico de pila de sustrato de impedancia de detección (IEM), fue descrito por primera vez por Giaever y Keese 11. Durante las últimas dos décadas se ha demostrado que es un indicador sensible de VIAB célulaility y la citotoxicidad. Básicamente, la monocapa de células que se adhiere a los electrodos en los biochips se expone a alta frecuencia y baja tensión y la señal de corriente alterna amperaje. La monocapa confluente de células impide el flujo de electrones. Cuando se ve comprometida la integridad de la monocapa celular (como cuando se introduce una sustancia química tóxica), el sensor ECIS registra un cambio en la impedancia eléctrica 11-14. La figura 1 ilustra el principio de ECIS en relación con la monocapa de células en el biochip . <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53555/53555fig1.jpg" /> Figura 1:.. Principio de ECIS Ilustración de una monocapa de células en un biochip con lector de ECIS simplificado esquema eléctrico <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53555/53555fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> 12. Estas células no eran prácticos para el uso en el campo, sin embargo, debido a que requiere cambios frecuentes de medios de comunicación, tenía una vida útil limitada, y se requiere un ambiente artificial de CO2 y una temperatura de 37 ° C de incubación. Se descubrió que una línea celular disponible en el mercado derivado de las células epiteliales de la trucha arco iris de enmalle (células RTgill 1 W-) podría ponerse a prueba a una temperatura ambiente de CO ambiente 2, formado una monocapa confluente en los biochips, podría ser almacenado a temperaturas de refrigeración, y tenido una respuesta rápida (1 hora o menos) a un amplio espectro de productos químicos en concentraciones relevantes para la salud humana 12. Aplicaciones de las células RTgill-W1 en toxicología, así como en investigación básica, son revisados ​​por Lee et al. 15 Los métodos para la siembra, el almacenamiento y la prueba de biochips de fluidos que contienenmonocapas de células RTgill-W1 en biochips de fluidos en un biosensor ECIS se describen aquí. Los biochips de fluidos se pueden almacenar durante un máximo de 9 meses en un estado refrigerado y pueden ser enviados en un contenedor de almacenamiento en frío, para la prueba de supplies.The de agua potable que acompañan a los lectores ECIS, o unidades de prueba, se envían por separado. Los biochips tienen dos componentes a ellos; una capa de policarbonato superior con dos canales de fluido separados, y una capa inferior electrónica que contiene cuatro electrodos por canal para detección de impedancia. Hay 10 electrodos de trabajo por la almohadilla; cada electrodo es de 250 micras de diámetro. Los biochips reunidos tienen conexiones de electrodo de oro para adquirir lecturas de impedancia cuando se inserta en la unidad de prueba ECIS. Cada uno de los dos canales en forma de U de fluidos cerrados llevará a cabo 2 ml de la suspensión celular RTgill-W1. La figura 2 muestra un biochip fluídico en el lector ECIS con una ampliación de una células confluentes en un único electrodo de detección. Figura 2:.. Biochip neumático en ECIS lector área ampliada muestra una monocapa confluente de células RTgill-W1 en un único electrodo de detección <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53555/53555fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Life Technologies, Inc. www.lifetechnologies.com</td><td>16000-085</td><td>Store @ -20 &deg;C. Descongele @ temperatura ambiente antes de usar. Ingrediente para medios completos de cultivo celular L-15 (10%).</td></tr><tr><td>Fibronectina, plasma bovino</td><td>EMD Millipore Corp.&nbsp; &nbsp; www.emdmillipore.com&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>341631-1 mg</td><td>Almacenar @ -20 &deg;C. Descongelar @ temperatura ambiente antes de usar. Mezcle con medios L-15 para una concentración de 10 &#956; g/ml y congelar @ -20 &deg; C en alícuotas. Uso como sustrato para biochips.</td></tr><tr><td>Medios L-15 sin L-glutamina</td><td>Lonza&nbsp; www.lonzabioscience.com</td><td>12-700F</td><td>Medios basales para cultivo celular y alimentación de biochips. Almacenar a 6 &deg;C.</td></tr><tr><td>L-15ex medios en polvo con rojo fenol</td><td>US Biological&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; www.usbio.net</td> medios <td>L1501</td><td>se pesan en alícuotas de 60 mg en viales de 0,1 dram y se almacenan a 6 & grados; C en bolsas de aluminio con paquetes desecantes. Vida útil de nueve meses. Mezclado con 10 ml de muestra de agua para pruebas en biochips.</td></tr><tr><td>PBS, sin Ca2+ o Mg2+</td><td>Lonza&nbsp; www.lonzabioscience.com</td><td>17-516F</td><td>Almacene a temperatura ambiente. Se utiliza para enjuagar medios cuando se tripsinizan matraces de cultivo celular. &nbsp;</td></tr><tr><td>Tripsina, EDTA</td><td>Lonza&nbsp; www.lonzabioscience.com</td><td>CC-5012</td><td>Almacene @ -20 &deg;C. Descongele a temperatura ambiente y úselo para tripsinizar matraces de cultivo celular.</td></tr><tr><td>Matraces de cultivo T175</td><td>Fisher Scientific www.fishersci.com</td><td>12-565-30</td><td>Se utiliza para el cultivo de células RTgill-W1.</td></tr><tr><td>Lejía</td><td>Chlorox&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; </td><td></td> www.chlorox.com <td>Diluido al 20% con millique o agua destilada para la limpieza de chips ECIS. Cualquier lejía doméstica es aceptable.</td></tr><tr><td>Alcohol etílico</td><td></td><td></td> al 70% <td>Para desinfectar las superficies de la biocampana y cualquier material que se coloque en la biocapucha.</td></tr><tr><td>Celdas branquiales de trucha arco iris (RTgill-W1)&nbsp;</td><td>Colección de Cultivo de Tejidos de Tipo Americano&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; www.atcc.org</td><td>CRL-2523</td><td>Células cultivadas y utilizadas para biosensores (biochips de siembra).</td></tr><tr><td>Suplemento GlutaMAX-1, 200 mM</td><td>Lonza&nbsp; www.lonzabioscience.com</td><td>35050-061</td><td>Conservar a temperatura ambiente. Ingrediente para medios completos de cultivo celular L-15 (1%).</td></tr><tr><td>Penn/Strep Stock 10K/10K</td><td>Lonza&nbsp; www.lonzabioscience.com</td><td>17-602E</td><td>Store @ -20 &deg;C. Descongele @ temperatura ambiente antes de usar. Ingrediente para medios completos de cultivo celular L-15 (1%).</td></tr><tr><td>Tubería BPT de piscifactoría</td><td>U.S. Plastic Corp.&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; www.usplastic.com</td><td>57317</td><td>Corte en tramos de 27 mm y esterilizado en autoclave. Se utiliza para sembrar biochips con células y como un circuito cerrado entre cambios de medios.</td></tr><tr><td>Accesorios luer de policarbonato para conjuntos de tubos de Pharmed</td><td>Value Plastics&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>MTLS210-9</td><td>Asegurado a cada extremo de la tubería de piscifactoría cortada para su inserción en bichips.</td></tr><tr><td>Jeringas de 20 ml, punta deslizante</td><td>VWR Scientific&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; us.vwr.com</td><td>BD302831</td><td>Se utiliza para la inyección de suspensión celular para la siembra de chips ECIS, así como para la alimentación de chips.</td></tr><tr><td>Microviales de polipropileno con tapa a presión de 0.1 dram</td><td>Botellas, frascos y tubos, Inc.&nbsp; &nbsp; www.bottlesjarsandtubes.com</td><td>30600</td><td>Se utiliza para almacenar alícuotas de 60 mg de medios en polvo L-15ex.</td></tr><tr><td>Biochips ECIS fluidos Lexan de 60 milésimas de pulgada</td><td>Nanohmics, Inc.&nbsp; &nbsp; &nbsp; </td><td></td> www.nanohmics.com <td>Hecho a medida por Nanohmics, Inc. Las células RTgill-W1 se inyectarán en los biochips y los chips sembrados se colocarán en el lector ECIS para su prueba.</td></tr><tr><td>Caja de instrumentos de plástico esterilizable en autoclave 17 1/2" x 7 3/4" x 2 3/8"</td> <td>Medi-Dose EPS&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; medidose.com</td><td>IB701</td><td>Se utiliza para almacenar lo siguiente: tapones esterilizados en autoclave, biochips que se han limpiado, biochips con semillas.</td></tr><tr><td>Bolsas de esterilización de papel termoselladas, 7 y frac12; &rdquo; x 13"</td><td>CardinalHealth&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; www.cardinalhealth.com</td><td>90713</td><td>Se utiliza para el autoclave de tubos, accesorios y tapones.</td></tr><tr><td>Dosificador de polvo automatizado Quantos</td><td>Mettler Toledo&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; www.mt.com</td><td>QB5</td><td>Dispensación automatizada de 60 mg de alícuotas de L-15ex en polvo en viales de 0,1 dram.</td></tr><tr><td>Lector ECIS</td><td>Nanohmics, Inc.&nbsp; &nbsp; &nbsp; </td><td></td> www.nanohmics.com <td>Hecho a medida por Nanohmics, Inc. El biochip sembrado se inserta en el lector para realizar pruebas de toxicidad del agua.</td></tr><tr><td>3 x 5 bolsas resellables de polipropileno metalizado de 2,5 milésimas de pulgada</td><td>Uline&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; www.uline.com</td><td>S-16893</td><td>Embalaje y almacenamiento tanto para biochips sembrados como para viales de medios L-15ex en polvo.</td></tr><tr><td>Leatherman squirt ps4</td><td>Amazon&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; </td><td></td> www.Amazon.com <td>Se utiliza para abrir viales de medios en polvo.</td></tr><tr><td>1 g de paquetes de desecante de gel de sílice&nbsp;</td><td>Uline&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; www.uline.com</td><td>S-3902</td><td>Coloque en bolsas de polipropileno con viales de medios en polvo L-15ex para evitar que el polvo acumule humedad.</td></tr><tr><td>Frascos estériles de 250 o 500 ml de Nalgene</td><td>Fisher Scientific www.fishersci.com</td><td>09-740-25C o E</td><td>Suspensiones celulares Hold para la siembra de chips ECIS en biohood.</td></tr><tr><td>Tapones para biochips</td><td>Nanohmics, Inc.&nbsp; &nbsp; &nbsp; </td><td></td> www.nanohmics.com <td>Hecho a medida por Nanohmics, Inc. Se utiliza para sellar puertos en biochips antes de almacenarlos a 6 °C.</td></tr><tr><td>Desagües para biochips ECIS</td><td>Nanohmics, Inc.&nbsp; &nbsp; &nbsp; </td><td></td> www.nanohmics.com <td>Hecho a medida por Nanohmics, Inc. Colocado en 2 puertos internos en biochips antes de la inserción en el lector ECIS. Permite que el exceso de medios drene de los canales durante las inyecciones de prueba.</td></tr><tr><td>Hemocitómetro</td><td>Fisher Scientific www.fishersci.com</td><td>S17040</td><td>Necesario para contar células antes de ajustar la suspensión celular para su inyección en biochips.</td></tr><tr><td>Microscopio de campo claro con objetivo 10X</td><td>Leitz Labovert</td><td></td><td>Cualquier microscopio de campo claro es aceptable.</td></tr><tr>Cabina de <td></td><td></td><td>seguridad biológica de clase II</td><td>Cualquier cabina de seguridad biológica de clase II en la que se pueda realizar el cultivo celular en condiciones estériles es aceptable.</td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga, 0,6 ml</td><td>Fisher Scientific www.fishersci.com</td><td>02-681-311</td><td>Contiene 1 ml de suspensión celular antes del recuento de células.</td></tr><tr><td>Jeringas rojas deslizantes de 10 cc</td><td>Productos de procedimiento, Inc.&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; www.procedureproducts.com</td><td>S/49S 30-R</td><td>Extrae 9 ml de muestra de agua de prueba y se utiliza para inyectar la muestra en el biochip.</td></tr><tr><td>Jeringas azules deslizantes de 10 cc</td><td>Procedure Products, Inc.&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; www.procedureproducts.com</td><td>S/49S 30-B</td><td>Extrae 9 ml de muestra de agua de control y se utiliza para inyectar la muestra en el biochip.</td></tr><tr><td>&frac12; oz. frasco transparente de plástico PET con tapas blancas forradas acanaladas Botella</td><td>SKS & Embalaje, Inc.&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; www.sks-bottle.com</td><td>0605-30</td><td>Viales de muestra utilizados para mezclar L-15ex polvo y 10 ml de muestra de agua para análisis.</td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga de polipropileno cónico estéril de 50 ml</td><td>Fisher Scientific&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; www.fishersci.com</td><td>12-565-269</td><td>Se utiliza para contener 40 ml de alícuotas de 10 &#956; g/ml de fibronectina a -20 °C.</td></tr><tr><td>Prueba de detección de inhibidores de acetilcolinesterasa NIDS ACE</td><td>ANP Technologies, Inc. www.anptinc.com</td><td>Sensor ACE-400</td><td>diseñado para la detección rápida de pesticidas en el agua potable</td></tr></tbody></table>

preparación y ensayo de impedancia basada en biochips fluido con células rtgill-w1 para evaluación rápida de muestras de agua potable para la toxicidad

Preparation and Testing of Impedance-based Fluidic Biochips with RTgill-W1 Cells for Rapid Evaluation of Drinking Water Samples for Toxicity

Este manuscrito describe cómo preparar biochips fluídicos con células epiteliales branquiales de trucha arco iris (RTgill-W1) para su uso en un sensor portátil de toxicidad del agua de campo. Se forma una monocapa de células RTgill-W1 en los electrodos de detección encerrados dentro de los biochips. A continuación, los biochips se utilizan para realizar pruebas en un dispositivo portátil de detección de impedancia de sustrato eléctrico (ECIS) diseñado para pruebas rápidas de toxicidad del agua potable. El manuscrito describe además cómo realizar una prueba de toxicidad utilizando los biochips preparados. Una muestra de agua de control y la muestra de agua de prueba se mezclan con medios en polvo previamente medidos y se inyectan en canales separados del biochip. Las lecturas de impedancia de los electrodos de detección en cada uno de los canales del biochip se miden y comparan mediante un programa de software estadístico automatizado. La pantalla del instrumento ECIS indicará "Contaminación detectada" o "No se detectó contaminación" dentro de una hora después de la inyección de la muestra. Las ventajas son la facilidad de uso y la rápida respuesta a un amplio espectro de productos químicos orgánicos e inorgánicos en concentraciones que son relevantes para los problemas de salud humana, así como la estabilidad a largo plazo de los biochips almacenados en un estado listo para las pruebas. Las limitaciones son el requisito de almacenamiento en frío de los biochips y la sensibilidad limitada a los plaguicidas inhibidores de la colinesterasa. Las aplicaciones de este detector de toxicidad son para pruebas rápidas portátiles de suministros de agua potable por parte del personal de Medicina Preventiva del Ejército o para su uso en instalaciones municipales de tratamiento de agua.

La tecnología ECIS se describe en el presente documento se sometió a pruebas en la Agencia de Protección Ambiental de Estados Unidos (USEPA) patrocinada Testing Programa de Tecnología y Evaluación (TTEP). Se seleccionaron trece productos químicos para probar como representantes de un amplio espectro de compuestos industriales tóxicos que podrían ser posibles contaminantes del agua potable. Durante las pruebas, 9 de los 13 fueron detectados por ECIS dentro de una hora a concentraciones que son relevantes para la salud humana 8. La Tabla 1 muestra los resultados de este ensayo contaminante. La figura 4 es representativo de lo que es un &quot;contaminado&quot; resultado será similar en la pantalla lector de ECIS. En su mayor parte, las impedancias celulares disminuyeron para las muestras contaminadas, en comparación con los controles. En ocasiones, ciertos compuestos pueden causar un aumento en la impedancia. También se resumen en la Tabla 1 </strong&gt; es el análisis de agua limpia. Cuarenta muestras de agua limpia se llevaron a cabo y no se detectó contaminación en ninguna de las muestras (véase la Figura 5) para una captura de pantalla representativa de &quot;No hay contaminación detectado&quot;. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53555/53555fig4.jpg" /> Figura 4: ECIS lector de pantalla de un &quot;contaminado&quot; Muestra de agua Un ejemplo de gráficos normalizados de impedancia y los resultados de una muestra de agua que estaba contaminada.. Las líneas azules representan impedancias normalizadas de cada uno de los electrodos de control; líneas rojas representan las impedancias normalizadas de cada uno de los electrodos de la muestra de prueba. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53555/53555fig4large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/53555/53555fig5.jpg" /> Figura 5: ECIS lector de pantalla de un &quot;no hay contaminación detectado&quot; Muestra de agua Un ejemplo de gráficos normalizados de impedancia y los resultados de una muestra de agua que no estaba contaminada.. Las líneas azules representan impedancias normalizadas de cada uno de los electrodos de control; líneas rojas representan las impedancias normalizadas de cada uno de los electrodos de la muestra de prueba. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53555/53555fig5large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Categoría </td><td> contaminante </td><td colspan="3"> Concentración ensayada (mg / L) 1 </td><td colspan="2"> Detectado ≤1 hora n = 4/4 virutas </td></tr><tr><td rowspan="8"> Los pesticidas </td><td> aldicarb </td><td colspan="3"> 0.17 </td><td colspan="2"> no </td></tr><tr><td> Arsen<html> ic (arsenito de sodio) </td><td colspan="3"> 4.5 </td><td colspan="2"> sí </td></tr><tr><td> Azida (azida de sodio) </td><td colspan="3"> 46.7 </td><td colspan="2"> sí </td></tr><tr><td> fenamifos </td><td colspan="3"> 0.56 </td><td colspan="2"> no </td></tr><tr><td> metamidofos </td><td colspan="3"> 1.4 </td><td colspan="2"> no </td></tr><tr><td> El metil paratión </td><td colspan="3"> 33.6 </td><td colspan="2"> sí </td></tr><tr><td> Paraquat (dicloruro de) </td><td colspan="3"> 4.6 </td><td colspan="2"> no </td></tr><tr><td> Pentaclorofenato (sodio) </td><td colspan="3"> 71.9 </td><td colspan="2"> sí </td></tr><tr><td rowspan="5"> Productos químicos industriales </td><td> Amoníaco </td><td colspan="3"> 924 </td><td colspan="2"> sí </td></tr><tr><td> Copper (sulfato de cobre II) </td><td colspan="3"> 103 </td><td colspan="2"> sí </td></tr><tr><td> El cianuro (sodio) </td>3 &quot;&gt; 14 </td><td colspan="2"> sí </td></tr><tr><td> Mercurio (cloruro) </td><td colspan="3"> 24.7 </td><td colspan="2"> sí </td></tr><tr><td> tolueno </td><td colspan="3"> 444 </td><td colspan="2"> sí </td></tr><tr><td> El agua limpia 2 </td><td> ninguna </td><td colspan="3"> N / A </td><td colspan="2"> no </td></tr><tr><td colspan="7"> 1 concentraciones ensayadas son los mismos que en el manuscrito por Widder, et al. (2014). </td></tr><tr><td colspan="7"> 2 40 muestras de agua limpia se llevaron a cabo sin contaminación. </td></tr></tbody></table> Tabla 1: Los contaminantes en muestras de agua detectado por ECIS.

Este manuscrito describe cómo preparar biochips fluídicos con células epiteliales branquiales de trucha arco iris para su uso en un sensor de impedancia de sustrato de celda eléctrica portátil de campo. También se describe el protocolo para realizar una prueba rápida de toxicidad del agua potable con el sensor.

Preparación y ensayo de impedancia basada en biochips fluido con células RTgill-W1 para evaluación rápida de muestras de agua potable para la toxicidad

This manuscript describes how to prepare fluidic biochips with Rainbow trout gill epithelial (RTgill-W1) cells for use in a field portable water toxicity ...

El objetivo general de este procedimiento es demostrar cómo utilizar un biosensor para evaluar la toxicidad de muestras de agua potable. Esto se logra creando biocips que contienen una monocapa de células de branquias de trucha arcoíris y luego utilizando estos biocips como parte de un biosensor basado en impedancia. Este procedimiento proporciona un método para detectar rápidamente la toxicidad química en suministros de agua potable a niveles relevantes para la salud humana.Las principales ventajas de esta técnica son que los biochips pueden utilizarse en condiciones de campo, pueden almacenarse en frío hasta nueve meses sin necesidad de cuidados ni mantenimiento de las células, y que se encuentran en estado listo para su uso y pueden emplearse en cualquier momento tras su retirada de la refrigeración. Este procedimiento será demostrado por Jordan McNairn, un estudiante universitario de nuestro laboratorio. El día anterior a la siembra celular, retire los biochips de su empaque y colóquelos en estuches de instrumentos plásticos esterilizados.Conecte uno de los ensamblajes de tubo a la jeringa y aspire una solución de lejía al 20 % en una jeringa de 20 mililitros. Inyecte dos mililitros de la solución en cada canal del biochip. Una vez finalizado, deje reposar los biochips durante una hora con la solución de lejía.Después de una hora, utilice una jeringa estéril de un mililitro equipada con una conexión luer macho acoplada a una línea de vacío para aspirar la solución de lejía de ambos canales. Después de aspirar la lejía del biochip, conecte un ensamblaje estéril de tubo con conexiones luer macho en cada extremo al biochip para usarlo como drenaje durante el lavado de los biochips. A continuación, aspire agua estéril en una jeringa de 20 mililitros y pase cinco mililitros de agua por cada canal del chip.Aspire el agua al vacío como antes. Y coloque los biochips nuevamente en los estuches de plástico. Deje los biochips en la cabina de seguridad biológica hasta el día siguiente.Una hora antes de sembrar las biochips, inyecte dos mililitros de una solución de fibronectina de 10 microgramos por mililitro en cada canal de la biochip. Incube las biochips en la cabina de seguridad biológica durante 60 minutos y luego aspire al vacío la solución de fibronectina. Finalmente, coloque dos ensamblajes estériles de tubos para biochips en los puertos de las biochips y déjelas apartadas hasta que las células estén listas para la siembra.Retire un matraz T-175 confluyente que contenga células epiteliales de branquias de trucha arcoíris del incubador y colóquelo en la campana de seguridad biológica. Un matraz T-175 confluyente podrá sembrar aproximadamente 16 biochips. Aspire el medio de las células.Lávelos con PBS y aspire el PBS. A continuación, agregue seis mililitros de solución de tripsina-EDTA a la capa celular. Incube el matraz a temperatura ambiente durante aproximadamente cinco minutos.Luego, agregue 15 mililitros de medio de cultivo celular L-15 completo a cada matraz para desactivar la tripsina. Tome una pequeña alícuota de la suspensión celular y utilice un hemocitómetro para medir la concentración de las células. Observe las células utilizando un microscopio de campo brillante equipado con un objetivo de 10x.A continuación, calcule la concentración actual de células y ajuste la suspensión celular a una concentración de un cuarto de millón de células por mililitro. Luego, utilice una jeringa estéril de 20 mililitros para inyectar 2,5 mililitros de la suspensión celular en el puerto externo de cada canal del biochip. Permita que la suspensión celular sobrante fluya fuera de los tubos hacia un recipiente de desecho.Luego, cree un bucle cerrado para cada canal del biochip insertando el extremo libre de la manguera con una conexión luer en el puerto externo de cada canal. A continuación, humedezca una toalla de papel con etanol al 70% y úsela para limpiar cualquier medio en exceso de los bucles cerrados. Después, coloque los biochips nuevamente en una caja de plástico.Los días cuatro y siete, retire los biochips del incubador y cambie el medio en los biochips por medio de cultivo celular L-15 completo equilibrado en temperatura. Después del cambio de medio del día siete, retire y deseche las mangueras de los chips e inserte los tapones de drenaje autoclavados en los biochips.Coloque los biochips en una caja dentro de un incubador a seis grados Celsius hasta que se utilicen para las pruebas. Saque el lector de pruebas ECIS y los suministros del estuche de transporte y encienda el lector. Además, retire uno de los biochips preparados del incubador a seis grados Celsius y colóquelo sobre una toalla de papel.Utilizando una jeringa de 10 mililitros, distribuya 10 mililitros de agua de control en un frasco de plástico transparente de 0,5 onzas marcado. Asegúrese de eliminar las burbujas para obtener una medición precisa. Luego, utilice una jeringa separada y distribuya 10 mililitros de la muestra de prueba en un frasco de plástico transparente de 0,5 onzas para la prueba.A continuación, retire dos viales de medio en polvo. Abra uno de los viales de medio en polvo y vierta todo su contenido en el frasco con el agua de control, dejando caer también todo el vial en la solución. Repita este procedimiento con el frasco de ensayo.Luego, tape y agite los frascos para asegurar que el polvo se disuelva completamente. Llene la jeringa azul de 10 mililitros con nueve mililitros de la solución control. Y la jeringa roja de 10 mililitros con nueve mililitros de la solución de ensayo de sus viales respectivos.Elimine cualquier burbuja de aire existente en las jeringas. A continuación, retire los tapones de los puertos del biochip y conecte el drenaje. Coloque el biochip en la bandeja de plástico extraíble del lector ECIS, cierre la tapa y luego conecte las jeringas llenas a los puertos externos del biochip.Finalmente, coloque los émbolos de la jeringa. Desde la pantalla principal del lector, seleccione Siguiente para iniciar la prueba previa. El software verificará entonces las impedancias iniciales.Si las impedancias están dentro del rango, la pantalla registrará "Cartucho aprobado" e indicará al usuario que seleccione Siguiente. A continuación, introduzca la información de la muestra utilizando un teclado virtual y luego seleccione Aceptar cuando termine. En este momento, se recopilarán dos minutos de datos de impedancia del biochip insertado, y un temporizador en pantalla mostrará el tiempo restante.Después de dos minutos, presione Siguiente. Cuando aparezca un cuadro verde parpadeante que indique "Inyectar muestras ahora", inyecte simultáneamente el medio control y el medio de prueba desde las jeringas conectadas hacia los canales del biochip. Deje las jeringas colocadas en los biochips al finalizar.Si el software lector de ECIS determina que el canal de tratamiento es estadísticamente diferente del canal de control en cualquier momento durante la prueba, la pantalla indicará que la muestra está contaminada. De lo contrario, indicará que no se detectó contaminación al final del período de monitoreo. Registre los resultados de la prueba como "Contaminada" o "No contaminada" para cada muestra.Al finalizar la prueba, retire y deseche el biochip. Enjuague y seque al aire las jeringas, los viales de prueba y la bandeja de plástico extraíble que alojó el biochip durante las pruebas. Se seleccionaron 13 sustancias químicas, mostradas aquí, para su evaluación como representantes de un amplio espectro de compuestos industriales tóxicos que podrían ser posibles contaminantes del agua potable.Durante la prueba, nueve de los 13 fueron detectados mediante el sensor de impedancia eléctrica en sustrato celular dentro de una hora, a concentraciones relevantes para la salud humana. Aquí se muestran los resultados típicos que se observarían tras una prueba de sensor de impedancia eléctrica en sustrato celular. Las muestras contaminadas terminan con niveles de impedancia significativamente más bajos en comparación con las muestras de control de agua limpia.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar un biochip con una monocapa de células epiteliales de branquias de trucha arcoíris y posteriormente utilizar ese biochip en una prueba de toxicidad basada en impedancia para evaluar la toxicidad del agua potable. Al realizar este procedimiento, es importante recordar trabajar de forma aséptica durante la preparación de los biochips y mantener los biochips refrigerados hasta su uso. Cada biochip solo puede utilizarse una vez y luego debe desecharse.Una vez dominada, la preparación del biochip puede realizarse en aproximadamente 10 minutos. Esta es una estimación, ya que los chips se preparan por lotes. La prueba de impedancia de la muestra, incluida la preparación de la muestra, lleva aproximadamente una hora y 10 minutos si se realiza correctamente.Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la química analítica, sobre una muestra que haya producido un resultado contaminado, con el fin de identificar la sustancia o sustancias químicas sospechosas. El desarrollo de esta técnica allana el camino para que los investigadores interesados en la detección de toxicidad en el agua utilicen tecnología basada en células epiteliales branquiales de trucha arcoíris y en la detección de impedancia. Esperamos que encuentren útiles estas técnicas y anticipamos con interés futuras innovaciones que estas nuevas capacidades puedan ayudar a facilitar.Gracias y que tenga un excelente día.

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En este video, demostramos el proceso de monitoreo en tiempo real de eventos celulares, incluida la proliferación de células adherentes, a través de un ensayo de impedancia celular. Aquí, las celdas adherentes actúan como aislantes, restringiendo el flujo de corriente entre los electrodos y aumentando la impedancia.

Análisis basado en impedancia celular para la monitorización de procesos celulares en tiempo real

En este artículo se presenta un chip de microfluidos para el análisis de células individuales. Permite la cuantificación de las proteínas intracelulares, enzimas, cofactores, y segundos mensajeros por medio de ensayos fluorescentes o inmunoensayos.

Un chip de microfluidos para el análisis químico versátil de células individuales

Se adaptó un protocolo para detectar la actividad endocrina en extractos orgánicos de muestras de agua, incluidos los efluentes de aguas residuales tratadas y el agua superficial (receptora), utilizando bioensayos de transactivación in vitro disponibles comercialmente para detener la división ("congelar y descongelar").

La detección de la actividad endocrina en Uso de Agua comercialmente disponibles<em&gt; In Vitro</em&gt; Transactivación bioensayos

Una plataforma de biosensores de microfluídica fue diseñada y fabricado utilizando la tecnología de fotoresistencia de película seca de bajo costo para la cuantificación rápida y sensible de diversos analitos. Este sistema de uso único permite la lectura electroquímica de sobre-chip-inmovilizado análisis enzima-ligado mediante la técnica de stop-flow.

Seca de la película basada en la fotoresistencia el Biosensor electroquímico de microfluidos plataforma: Fabricación de dispositivo, preparación del análisis de la en-viruta y el funcionamiento del sistema

Este protocolo describe una estrategia general para regenerar comerciales microelectrodos de oro vestidas para un analizador de célula libre de etiqueta para ahorro en los alta ejecución costos ofmicrochip-ensayos. El proceso de regeneración incluye la digestión de la tripsina, enjuague con agua y etanol y un paso de giro, que permite el uso repetido de los microchips.

Regeneración de microelectrodos de oro vestidas para un analizador en tiempo real de la célula

Esta publicación describe la fabricación de un dispositivo de órgano-en-viruta con electrodos integrados para la cuantificación directa de la resistencia eléctrica transendothelial (TEER). Para la validación, la barrera blood - brain fue imitada dentro de este dispositivo de microfluidos y supervisaron su función de barrera. Los métodos presentados para electrodo integración y cuantificación de TEER directa son generalmente aplicables.

Fabricación y validación de un sistema de órganos-en-viruta con electrodos integrados directamente cuantificar Transendothelial resistencia eléctrica

El microfluídico digital basado en electrohumección es una técnica que utiliza un cambio impulsado por voltaje en el ángulo de contacto aparente de una gota de volumen de microlitros para facilitar su manipulación. La combinación de esto con perlas magnéticas funcionalizadas permite la integración de múltiples operaciones de unidades de laboratorio para la preparación de muestras y la identificación de patógenos utilizando el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA).

Plataforma de microfluídico digital basada en electrohumección para el ensayo automatizado de inmunoabsorbentes ligados a enzimas

Presentamos un sistema microfluídico para estudios de alto rendimiento en maquinaria de vida compleja, que consta de 1500 unidades de cultivo, una gama de bombas peristálticas mejoradas y un módulo de mezcla in situ. El chip microfluídico permite el análisis de las condiciones microambientales altamente complejas y dinámicas in vivo.

Generación de condiciones ambientales dinámicas utilizando un dispositivo microfluídico de alto rendimiento

Describimos un enfoque para detectar y capturar subpoblaciones celulares invasivas en tiempo real. El diseño experimental utiliza el análisis celular en tiempo real mediante el monitoreo de los cambios en la impedancia eléctrica de las células. Se pueden capturar células invasivas de cáncer, inmunes, endoteliales o estromales en tejidos complejos y se puede evaluar el impacto de los cocultivos.

Detección y captura en tiempo real de subpoblaciones celulares invasivas a partir de cocultivos

El siguiente estudio evalúa el perfil toxicológico de un marco metal-orgánico seleccionado utilizando la detección eléctrica de impedancia de sustrato de celda (ECIS), una técnica de detección de alto rendimiento en tiempo real.

Detección eléctrica de sustratos de células para la evaluación en tiempo real de perfiles toxicológicos de estructuras metal-orgánicas

Nuestro protocolo detallado describe la creación y el uso del modelo avanzado de intestino en chip, que simula la mucosa intestinal humana con estructuras 3D y varios tipos de células, lo que permite un análisis en profundidad de las respuestas inmunitarias y las funciones celulares en respuesta a la colonización microbiana.

Modelo inmunocompetente de intestino en chip para analizar las respuestas inmunitarias de la mucosa intestinal

Aprende a preparar biochips con células epiteliales de branquias de trucha arcoíris para evaluar la toxicidad del agua potable mediante sensores de impedancia portátiles. Este método permite detección rápida en campo.

Preparación y ensayo de impedancia basada en biochips fluido con células RTgill-W1 para evaluación rápida de muestras de agua potable para la toxicidad (Video) | JoVE Journal

Preparación y ensayo de impedancia basada en biochips fluido con células RTgill-W1 para evaluación rápida de muestras de agua potable para la toxicidad

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