Preparación y ensayo de impedancia basada en biochips fluido con células RTgill-W1 para evaluación rápida de muestras de agua potable para la toxicidad

El objetivo general de este procedimiento es demostrar cómo utilizar un biosensor para evaluar la toxicidad de las muestras de agua potable. Esto se logra mediante la creación de biochips que contienen una monocapa de células branquiales de trucha arco iris y luego las usa como parte de un biosensor basado en impedencia. Este procedimiento proporciona una forma de detectar rápidamente la toxicidad química en los suministros de agua potable a niveles que son relevantes para la salud humana.

Las principales ventajas de esta técnica son que los biochips se pueden utilizar en condiciones de campo, se pueden almacenar en frío hasta nueve meses sin ningún cuidado o mantenimiento de las células, y que están en un estado listo para las pruebas y se pueden utilizar en cualquier momento después de retirarlos de la refrigeración. La demostración de este procedimiento estará a cargo de Jordan McNairn, un estudiante de pregrado de nuestro laboratorio. El día antes de la siembra de células, retire los biochips de su empaque y colóquelos en estuches de instrumentos de plástico esterilizados.

Conecte uno de los conjuntos de tubos a la jeringa y extraiga una solución de lejía al 20% en una jeringa de 20 mililitros. Inyecte dos mililitros de la solución en cada canal del biochip. Cuando termines, deja reposar los biochips durante una hora con la solución de lejía.

Después de una hora, use una jeringa estéril de un mililitro equipada con un conjunto de luer deslizante macho conectado a una línea de vacío para aspirar la solución de lejía desde ambos canales. Después de aspirar la lejía del biochip, conecte un conjunto de tubos estériles con luers deslizantes macho en cada extremo al biochip para usarlo como drenaje mientras enjuaga los biochips. Luego, extraiga agua estéril en una jeringa de 20 mililitros y enjuague cada canal del chip con cinco mililitros de agua.

Aspire el agua al vacío como antes. Y vuelva a colocar los biochips en los estuches de plástico de los instrumentos. Deje los biochips en la campana de bioseguridad hasta el día siguiente.

Una hora antes de sembrar los biochips, inyecte dos mililitros de una solución de fibronectina de 10 microgramos por mililitro en cada canal del biochip. Incubar los biochips en la campana de bioseguridad durante 60 minutos y, a continuación, aspirar al vacío la solución de fibronectina. Por último, coloque dos conjuntos de tubos de biochip estériles en los puertos de los biochips y deje los biochips a un lado hasta que las células estén listas para la siembra.

Retire de la incubadora un matraz T-175 confluente que contenga células epiteliales branquiales de trucha arco iris y colóquelo en la campana de bioseguridad. Un matraz T-175 confluente será capaz de sembrar aproximadamente 16 biochips. Aspire los medios de las células.

Enjuáguelos con PBS y aspire el PBS. Y luego agregue seis mililitros de solución de tripsina-EDTA a la capa celular. Incubar el matraz a temperatura ambiente durante unos cinco minutos.

A continuación, se añaden 15 mililitros de medio de cultivo celular L-15 completo a cada matraz, para desactivar la tripsina. Tome una pequeña alícuota de la suspensión celular y use un hemocitómetro para medir la concentración de las células. Vea las células utilizando un microscopio de campo claro equipado con un objetivo 10x.

Luego, calcule la concentración celular actual y ajuste la suspensión celular a una concentración de un cuarto de millón de células por mililitro. A continuación, utilice una jeringa estéril de 20 mililitros para inyectar 2,5 mililitros de la suspensión celular en el puerto exterior de cada canal del biochip. Permita que la suspensión de celda adicional fluya fuera del tubo hacia un contenedor de desechos.

A continuación, cree un bucle cerrado para cada canal de biochip insertando el extremo libre de la manguera con un accesorio luer en el puerto exterior de cada canal. A continuación, humedezca una toalla de papel con etanol al 70% y utilícela para limpiar el exceso de medios de los bucles cerrados. Luego, vuelva a colocar los biochips en una caja de plástico.

En los días cuatro y siete, retire los biochips de la incubadora. Y cambie los medios en los biochips con medios de cultivo celular L-15 completos con temperatura equilibrada. Después del séptimo día de alimentación, retire y deseche las mangueras de los chips e inserte los tapones de drenaje del autoclave en los biochips.

Coloque los biochips en una caja en una incubadora de seis grados centígrados hasta que se utilicen para las pruebas. Retire el lector de pruebas ECIS y los consumibles del estuche de transporte y, a continuación, encienda el lector. Además, saque uno de los biochips preparados de la incubadora a seis grados centígrados y colóquelo sobre una toalla de papel.

Con una jeringa de 10 mililitros, dispense 10 mililitros de agua de control en un frasco de control de plástico transparente de 0.5 onzas etiquetado. Asegúrese de eliminar las burbujas para obtener una medición precisa. Luego, use una jeringa separada y dispense 10 mililitros de la muestra de prueba en un frasco de prueba de plástico transparente de 0.5 onzas.

A continuación, retire dos viales de medios en polvo. Abra uno de los viales de medios en polvo y vierta todo el contenido de un vial en el frasco con el agua de control, dejando caer también todo el vial en la solución. Repita este procedimiento con el frasco de prueba.

Luego, tape y agite los frascos para asegurarse de que el polvo se disuelva por completo. Llene la jeringa azul de 10 mililitros con nueve mililitros de la solución de control. Y la jeringa roja de 10 mililitros con nueve mililitros de la solución de prueba de sus respectivos viales.

Retire las burbujas de aire existentes de las jeringas. A continuación, retire los tapones de los puertos del biochip y conecte el drenaje. Coloque el biochip en la bandeja de plástico extraíble del lector ECIS, cierre la tapa y, a continuación, conecte las jeringas llenas a los puertos exteriores del biochip.

Finalmente, coloque los émbolos de la jeringa. En la pantalla principal del lector, seleccione Siguiente para iniciar la prueba previa. A continuación, el software comprobará las impedancias iniciales.

Si las impedancias están dentro del rango, la pantalla registrará "Cartucho pasado" e indicará al usuario que seleccione Siguiente. A continuación, escriba la información de ejemplo mediante un teclado en pantalla y, a continuación, seleccione Aceptar cuando haya terminado. En este punto, se recopilarán dos minutos de datos de impedancia del biochip insertado y un temporizador en pantalla contará el tiempo.

Después de dos minutos, presione Siguiente. Cuando se le indique un cuadro verde intermitente para inyectar muestras ahora", inyecte los medios de control y prueba de las jeringas conectadas simultáneamente en los canales del biochip. Deje las jeringas en su lugar en los biochips cuando termine.

Si el software del lector ECIS determina que el canal de tratamiento es estadísticamente diferente del canal de control en cualquier punto durante la prueba, la visualización en pantalla indicará que la muestra está contaminada. De lo contrario, indicará que no se detecta contaminación al final del período de monitoreo. Registre los resultados de las pruebas como Contaminados "o No contaminados" para cada muestra.

Al final de la prueba, retire y deseche el biochip. Enjuague y seque al aire las jeringas, los viales de prueba y la bandeja de plástico extraíble que albergaba el biochip durante las pruebas. Se seleccionaron 13 productos químicos, que se muestran aquí, para las pruebas como representantes de un amplio espectro de compuestos industriales tóxicos que podrían ser posibles contaminantes del agua potable.

Durante las pruebas, nueve de los 13 fueron detectados por la detección de impedancia del sustrato de la celda eléctrica en una hora, en concentraciones que son relevantes para la salud humana. Aquí se muestran las salidas típicas que se verían después de una prueba de detección de impedancia de sustrato de celda eléctrica. Las muestras contaminadas terminan con niveles de impedancia significativamente más bajos, en comparación con las muestras de agua limpia de control.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo preparar un biochip con una monocapa de células epiteliales branquiales de trucha arco iris y posteriormente usar ese biochip en una prueba de toxicidad basada en impedancia para la evaluación de la toxicidad del agua potable. Al intentar este procedimiento, es importante recordar trabajar de forma aséptica en la preparación de los biochips, y también mantener los biochips refrigerados hasta que se utilicen. Cada biochip solo se puede usar una vez y luego debe desecharse.

Una vez dominado, la preparación del biochip se puede realizar en unos 10 minutos. Se trata de una estimación, ya que las patatas fritas se preparan en lotes. La prueba de impedancia de la muestra, incluida la preparación de la muestra, tarda aproximadamente una hora y 10 minutos si se realiza correctamente.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la química analítica, en una muestra que produjo un resultado contaminado, con el fin de identificar el producto químico o productos químicos sospechosos. El desarrollo de esta técnica allana el camino para que los investigadores interesados en la detección de toxicidad del agua utilicen la tecnología que utiliza células epiteliales branquiales de trucha arco iris y detección de impedancia. Esperamos que las técnicas le resulten útiles y esperamos con interés las futuras innovaciones que estas nuevas capacidades puedan ayudar a facilitar.

Gracias y que tengas un gran día.