Todo el montaje La disección y de inmunofluorescencia del Adulto ratón cóclea

Se presenta un método para aislar el órgano de Corti adultos como tres vueltas intactas cocleares (ápice, medio y de base). También demostramos un procedimiento de inmunotinción con anticuerpos marcados con fluorescencia. En conjunto, estas técnicas permiten el estudio de las células ciliadas, células de soporte, y otros tipos de células que se encuentra en la cóclea.

El objetivo general de este método de disección de montaje completo es aislar la región sensorial de la cóclea adulta calcificada como tres vueltas intactas: el ápice, el medio y la base. Este método de disección conserva la estructura tridimensional del órgano de Corti y permite la visualización de todas las células cuando se combina con inmunotinción y microscopía confocal para obtener imágenes en diferentes planos del eje Z. En comparación con los métodos de disección anteriores, utilizamos una estrategia diferente que genera tres vueltas cocleares que son más grandes y es menos probable que se pierdan o dañen en el proceso de inmunotinción.

La demostración visual de este método es fundamental ya que la disección es difícil de aprender. Debido a que el órgano de Corti es frágil, existe un pequeño margen de error al extirpar el ligamento espiral. Después de sacrificar al animal de acuerdo con los procedimientos aprobados y extraer el cerebro, comience por identificar los huesos temporales en la base del cráneo del ratón.

A continuación, raspe los nervios craneales con pinzas de patrón estándar. Coloque las pinzas en la punta de la cápsula ótica y use el pulgar de la mano opuesta para presionar hacia abajo el canal semicircular posterior para desalojar la cóclea encapsulada. Libere la mitad inferior del hueso temporal del cráneo, ya sea manualmente con el pulgar y el índice o con tijeras finas de 10,5 centímetros, y colóquelo en microscopía electrónica libre de metanol con paraformaldehído de grado 4% para fijar.

Después de la fijación, descalcifique los huesos temporales de acuerdo con las instrucciones de la parte escrita del protocolo. Para determinar si la muestra está adecuadamente descalcificada, coloque los huesos temporales en una placa de disección recubierta de elastómero de silicona y presione suavemente las pinzas sobre la cóclea en forma de caracol. Si el tejido es esponjoso, entonces la descalcificación es completa.

Agregue PBS a la placa de disección y, luego, mientras trabaja bajo un microscopio de disección estereoscópico, use las pinzas número cuatro o cinco para sujetar el hueso temporal en la región vestibular y cinco tijeras de resorte de Vannas-Tubingen de cinco mililitros para cortar el exceso de tejido de la cápsula ótica a lo largo de los lados y por encima del ápice. Con unas tijeras de resorte Vannas de 2,5 mililitros, inserte una hoja en la ventana ovalada y haga varios cortes pequeños a lo largo del ligamento espiral del giro basal. Ahora, inserte una hoja de las tijeras de resorte Vannas-Tubingen de cinco mililitros en la región recién cortada y coloque la otra hoja en el exterior del hueso temporal, medial a la ventana ovalada.

Este corte separa el giro basal de los giros medio y apical. A continuación, para completar la disección del giro basal, use las tijeras de resorte de 2,5 mililitros para cortar las fibras nerviosas del ganglio espiral que se conectan al modiolo para liberar la tensión en el giro basal. Corte por debajo del giro basal para separarlo de los órganos vestibulares.

Utilice pinzas para guiar el tejido y sujetar las fibras ganglionares en espiral a la placa recubierta de silicona y elastómero. Haz una serie de pequeños cortes para extirpar el ligamento espiral tanto por encima como por debajo del órgano de Corti. Con las fibras ganglionares en espiral fijadas a la placa recubierta de elastómero de silicona, use las pinzas para eliminar cualquier resto de membrana de Reissner del órgano de Corti.

Haz varios cortes para reducir el grosor de los axones ganglionares espirales. A continuación, agarre los axones restantes del ganglio espiral con pinzas y transfiera el giro basal disecado a una placa de 48 pocillos que contiene aproximadamente 500 microlitros de PBS. Ahora separe las vueltas media y apical colocando primero los dos tercios restantes de la cóclea con el lado apical hacia abajo.

A continuación, inserte una hoja de las tijeras de 2,5 mililitros en la escala media, donde la vuelta central estaba conectada previamente a la vuelta basal, y haga varios cortes a lo largo del ligamento espiral de la vuelta central. Con las tijeras de cinco mililitros, inserte una hoja en la región de corte, con la vuelta central colocada en la parte superior de la hoja. Coloque la otra hoja en el exterior del laberinto óseo, en un ángulo de 90 grados con respecto a la punta apical.

Este corte separa el giro central del giro apical. A continuación, complete la disección del giro central eliminando el ligamento espiral del órgano de Corti. Transfiera el giro diseccionado a una placa de 48 pocillos, como antes.

Ahora, use unas tijeras de resorte Vannas de 2,5 mililitros para abrir la tapa que cubre el giro apical y repita el procedimiento para eliminar el ligamento espiral del giro apical del órgano de Corti. Transfiera el giro diseccionado a una placa de 48 pocillos, como antes. Para comenzar el procedimiento de inmunotinción, primero aspire PBS de cada pocillo, luego reemplácelo con 200 a 300 microlitros de solución de bloqueo e incube durante una hora a temperatura ambiente en un rotador 3D.

Una vez transcurrido el tiempo de incubación, retirar la solución de bloqueo y sustituirla por 100 microlitros de anticuerpo primario, diluido adecuadamente en solución portadora. Incubar durante la noche a cuatro grados centígrados en un rotador 3D. Al día siguiente, retire la solución de anticuerpos primarios y lave cada pocillo con 500 microlitros de PBS durante al menos cinco minutos cada vez, a temperatura ambiente.

Repite el lavado dos veces. Después del último lavado, aspire el PBS y tenga cuidado de no aspirar el giro disecado en la punta de la pipeta. Reemplácelo con 100 microlitros por pocillo de anticuerpo secundario marcado con fluorescencia diluido en solución portadora.

Coloque la placa de 48 pocillos en una caja negra para protegerla de la luz y colóquela en el rotador 3D para incubar durante dos o tres horas a temperatura ambiente. Después de la incubación, aspire la solución de anticuerpos secundarios y lave tres veces con PBS como antes. Después de eliminar el último lavado, agregue 100 microlitros de Hoechst para etiquetar los núcleos.

Proteger de la luz e incubar durante 15 a 20 minutos a temperatura ambiente en un rotador 3D. Por último, retire la solución de Hoechst y lave tres veces con PBS como antes. Después de etiquetar cada portaobjetos, pipetee 50 microlitros de medios de montaje en cada portaobjetos.

A continuación, con las pinzas de joyero rectas número cuatro o número cinco, agarre los axones del ganglio espiral y transfiera suavemente una vuelta coclear desde la placa de 48 pocillos hasta el medio de montaje. Use el microscopio para asegurarse de que el giro diseccionado no esté doblado ni retorcido. Coloque un extremo de un cubreobjetos en un portaobjetos y suéltelo suavemente para dejar caer el cubreobjetos.

Utilice un microscopio de disección estereoscópica para asegurarse de que el giro coclear no esté ubicado cerca de una burbuja de aire. Si esto ocurre, mueva suavemente el cubreobjetos hacia adelante y hacia atrás para reposicionar el giro coclear. Repita el procedimiento para las otras vueltas cocleares.

Monte un giro coclear por portaobjetos para evitar la exposición a la luz y el fotoblanqueo durante el proceso de obtención de imágenes. Coloque las diapositivas en una carpeta de diapositivas de modo que queden planas. Proteja de la luz y deje que el medio de montaje se cure durante la noche a temperatura ambiente.

Al día siguiente, selle los cubrecubiertas con esmalte de uñas transparente y guárdelos a temperatura ambiente o 20 grados centígrados hasta que se obtengan las imágenes. Esta imagen de corte confocal muestra el giro medio coclear aislado de un ratón p15. Se superpusieron imágenes de 420X para reconstruir todo el giro central.

Las células ciliadas, marcadas con un anticuerpo primario anti-miosina VIIa de conejo y un anticuerpo secundario conjugado Alexa 647, tienen un aspecto magenta. Las células de soporte, marcadas con un anticuerpo primario anti-SOX2 de cabra y un anticuerpo secundario conjugado Alexa 568, aparecen en verde. Los núcleos aparecen azules debido a la tinción de Hoechst.

La barra de escala representa 100 micras. Esta imagen muestra una sección transversal óptica de la curva central aislada de un ratón de seis semanas en el plano X, Z. Una vez más, las células ciliadas están marcadas con un fluoróforo magenta y las células de soporte con un fluoróforo que parece verde.

Se trata de una mayor ampliación de la imagen anterior, con la eliminación de los puntos de mira. La barra de escala representa 20 micras. Las siguientes cuatro imágenes muestran algunos de los problemas que pueden ocurrir durante la disección de toda la montura o cuando se montan espiras cocleares en portaobjetos.

Aquí, en el lado izquierdo de la imagen, el tejido coclear se cortó junto a la última fila de células ciliadas externas, lo que provocó que muchas de estas células se montaran en ángulos variados. En esta imagen, una sección del órgano de Corti en el lado izquierdo ha sido cortada. Hay un agujero perforado en la región externa de las células ciliadas en el centro de la imagen.

Aquí el órgano de Corti está plegado en varios lugares. Una vez dominado, toda la técnica de disección de la montura se puede completar en 20 a 30 minutos. Al realizar este procedimiento, es importante evitar colocar las pinzas en el órgano de Corti y evitar tirar o agarrar el ligamento espiral.

En su lugar, cierre las pinzas y sujete las fibras ganglionares en espiral a la placa recubierta de elastómero de silicona. Las muestras de ratones de una a tres semanas de edad son más tolerantes y útiles para aprender el método de disección. Además, las muestras con daño en las células ciliadas son más difíciles de diseccionar, y el tejido expuesto al ruido es especialmente difícil y frágil.

Después de este procedimiento de disección, se pueden realizar otros métodos, como la microscopía electrónica de barrido. Sin embargo, se necesita un fijador diferente. Además, hemos realizado ligeras modificaciones a este protocolo para la disección de tejido coclear de rata y, en el futuro, esperamos modificarlo aún más para la disección de cóclea de chinchilla, jerbo y conejillo de indias.