Name: Todo el montaje La disección y de inmunofluorescencia del Adulto ratón cóclea (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: Aprende la disección de montaje completo de la cóclea adulta del ratón para preservar el órgano de Corti en tres vueltas intactas. Esta técnica permite visualizar células ciliadas y de soporte mediante inmunofluorescencia y microscopía confocal.

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Este trabajo fue financiado en parte por una subvención de la Oficina de Investigación Naval (N000141310569). El equipo del Centro Nacional de Recursos de Investigación de Recursos de Investigación en Salud (S10RR027716) de la Facultad de Medicina del Sur de Illinois contó con el apoyo del Centro Nacional de Recursos de Investigación de Salud ().

Declaración de Ética: Procedimientos que involucran sujetos animales han sido aprobados por el Cuidado de Animales institucional y el empleo en la Facultad de Medicina de la Universidad del Sur de Illinois. 1. Extracción de Huesos temporales <ol><li> Identificar los temporales en la base del cráneo del ratón 13 y raspar los nervios craneales utilizando fórceps patrón estándar. </li><li> Coloque fórceps patrón estándar en la punta de la cápsula ótica y con el pulgar de la mano opuesta presione hacia abajo en el canal semicircular posterior para desalojar la cóclea encapsulado. </li><li> Liberar la mitad inferior del hueso temporal del cráneo de forma manual con el pulgar y el dedo índice o usando 10,5 cm tijeras finas. </li></ol> 2. Post-fix temporales Huesos <ol><li> Coloque huesos temporales en 2 ml tubos de microcentrífuga que contiene 250 - 500 l 4% de paraformaldehído (PFA) diluido en solución salina tamponada con fosfato 10 mM (PBS) de pH 7,4 y incubcomió a temperatura ambiente durante 2-20 horas. NOTA: No se necesita una apertura de la tapa apical o inyección de PFA en la ronda o la ventana oval. Recomendar el uso libre, ultra-pura, microscopía electrónica (EM) de grado metanol PFA que se puede comprar en una concentración del 16% en viales de vidrio. Una vez que se abrió un vial y se diluyó 1: 4 en PBS, por lo que una solución al 4%, que puede ser utilizado para un máximo de 2 semanas cuando se almacena a 4 ° C (Algunos anticuerpos requieren la fijación a corto y otros pueden tolerar O / N (O / N) de fijación). </li></ol> 3. decalcify temporales Huesos <ol><li> Después de la fijación, retire PFA con una pipeta y reemplazar con 120 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), un poco más de 2 ml. Asegúrese de llenar todo el tubo de microcentrífuga de 2 ml para evitar las burbujas de aire cuando el tubo está cerrado. <ol><li> Si no descalcificación inmediatamente, vuelva PFA con pH 7,4 y almacenar muestras de PBS 10 mM a 4 o C. NOTA: Después de la fijación, huesos temporales se pueden almacenar durante variable asciende de tiempo antes de descalcificación en función de los antígenos que se examina. </li></ol></li><li> Colocar los tubos en extremo-extremo sobre los rotadores y giran a 4 rpm a temperatura ambiente. Cambie solución de EDTA al día usando una pipeta. Longitud de descalcificación depende de la edad de la muestra y la preferencia del científico que hace la disección. <ol><li> Incubar huesos temporales en EDTA usando las siguientes directrices para los tiempos de incubación: Para las muestras de día postnatal (P) 8 a P15: 2 - 4 horas; Para muestras P15 a P21: O / N; Para muestras P21 a P30: 2 O / N; Para muestras mayores de P30: 3 o más O / N. NOTA: Los tiempos de descalcificación están sujetas a la preferencia de los usuarios y se puede ampliar según sea necesario. Tiempo de descalcificación se puede reducir cambiando la solución de EDTA dos veces al día, alrededor de 8 horas de diferencia. Algunos laboratorios añadir 1% PFA a la solución de EDTA cuando descalcificación por más de 3 días para evitar la contaminación. </li></ol></li><li> Para determinar si la muestra se descalcificar adecuadamente, coloque huesos temporales ona de silicio impregnados de elastómero plato de disección y presione suavemente con fórceps en la cóclea en forma de caracol. Si el tejido es spongey, a continuación, la descalcificación es completa. </li><li> Una vez descalcificación, retire EDTA con una pipeta y añadir 500 -1000 l de 10 mM PBS pH 7,4. Almacene las muestras a 4 ° C hasta el momento de diseccionar. </li></ol> 4. Crear recubierto de elastómero de silicona Dish Disección <ol><li> Combinar la base y agente de curado de un kit encapsulante elastómero de silicona de acuerdo con las instrucciones del fabricante y mezclar bien. </li><li> Añadir aproximadamente 2-3 cucharadas de polvo de carbón hasta que la solución es de color negro y mezclar bien. NOTA: tinta líquida o carbón vegetal líquido no se mezclan con la solución y no se puede utilizar. Kits encapsulantes elastómero de silicona se pueden comprar en negro, lo que permite el paso 4.2 para ser omitido. </li><li> Vierta la solución en 60 mm de vidrio o placas de Petri de plástico, lo suficientemente satisfactorios para cubrir el fondo. Si bubbles están presentes, soplo de aire en la superficie. Deje reposar por lo menos 24 horas a temperatura ambiente para ajustar. NOTA: los platos impregnados de elastómero de silicona se puede utilizar en varias ocasiones durante años. Sin embargo, no use etanol para la limpieza, ya que esto hará que el elastómero de silicona de roer. </li></ol> 5. Todo el montaje Disección de la cóclea (por P7 y muestras de edad avanzada) <ol><li> Separar la espira basal de vueltas medias / apicales <ol><li> Coloque un hueso temporal descalcificada en un plato de la disección con recubrimiento de elastómero de silicona rellena dos tercios de su capacidad con 10 mM de PBS pH 7,4 y el uso de un microscopio de disección estéreo para los siguientes pasos. </li><li> Sostenga el hueso temporal en la región vestibular con # 4 o # 5 pinzas de joyero recta y usando 5 mm tijeras de primavera Vannas-Tübingen, cortar el exceso de tejido cápsula ótica largo de los lados y por encima del ápice. </li><li> El uso de 2,5 mm tijeras de primavera Vannas, inserte una hoja en la ventana oval y hacer varios pequeños cortes a lo largo del ligamento espiral / lateralpared de la espira basal. </li><li> El uso de 5 mm tijeras de primavera Vannas-Tübingen, inserte una hoja en la región acaba de cortar y colocar la otra hoja en la parte externa del hueso temporal, medial a la ventana oval. Este corte separa la espira basal de giros medio y apical. </li></ol></li><li> La disección completa de la espira basal. <ol><li> El uso de 2,5 mm tijeras de primavera Vannas, cortar las fibras nerviosas del ganglio espiral que se conectan a la modiolo para liberar la tensión en la espira basal y corte por debajo de la espira basal de separar de los órganos vestibulares. </li><li> El uso de 2,5 mm tijeras de primavera Vannas, hacer una serie de pequeños cortes para retirar el ligamento espiral / pared lateral de ambos por encima y por debajo del órgano de Corti. Utilice # 4 o # 5 pinzas de joyero recta para guiar el tejido. Fijar las fibras nerviosas del ganglio espiral en el elastómero de silicona recubierto con plato de disección, pero no aferrarse a esta región como el tejido se rompa. </li><li> Durante los pasos anteriores, algunos de los Membran de Reissnere a menudo será eliminado. Si alguna sigue siendo, sujete la membrana de Reissner con pinzas # 4 o # 5 de joyero recta y alejarse del órgano de Corti. NOTA: La membrana tectorial rara vez es visible y por lo general flota lejos sin necesidad de un paso específico para su eliminación. </li><li> Finalmente hacer varios recortes para reducir el espesor de los axones del ganglio espiral, para hacer la vuelta lo más plano posible y utilizar # 4 o # 5 pinzas de joyero directamente a transferir la espira basal diseccionado, agarrando los axones restantes del ganglio espiral, a una placa de 48 pocillos (o cámara de diapositivas) que contiene ~ 500 l de 10 mM de PBS pH 7,4. </li></ol></li><li> Media separada y vueltas apical <ol><li> Coloque los dos tercios restantes de la cóclea, con el lado apical hacia abajo. </li><li> El uso de 2,5 mm tijeras de primavera Vannas, inserte una hoja en la escala media, donde el giro medio utilizado para conectarse a la espira basal, y hacer varios pequeños cortes a lo largo del ligamento espiral / de la pared lateral del XXe espira media. </li><li> El uso de 5 mm tijeras de primavera Vannas-Tübingen, inserte una hoja en la región acaba de cortar con el giro medio colocado en la parte superior de la hoja, y coloque la otra hoja en la parte exterior del laberinto óseo, en un ángulo de 90 ° de la punta apical. Esto separa la espira media de la vuelta apical. </li></ol></li><li> La disección completa de la espira media de una manera similar a la vuelta basal (consulte los pasos 5.2.2 al 5.2.4). </li><li> La disección completa de la vuelta apical. <ol><li> El uso de 2,5 mm tijeras de primavera Vannas, abra la tapa que cubre el turno apical. Disección completa de una manera similar a la espira basal (consulte los pasos 5.2.2 a 5.2.4). NOTA: disecado giros cocleares pueden almacenarse en 10 mM PBS pH 7,4 en una placa de 48 pocillos (o cámara de diapositivas) a 4 ° C durante varias semanas antes de la inmunotinción. Sin embargo PBS se evaporará y necesita ser repuesto periódicamente y almacenamiento de más de 2 - 3 semanas puede dar lugar a crecimiento bacteriano o fúngico en eltejido que puede disminuir la calidad de la imagen. Se recomienda el almacenamiento a largo plazo de las muestras como los temporales no seccionada. </li></ol></li></ol> 6. La inmunotinción con marcado con fluorescencia Anticuerpos <ol><li> Después de la disección, almacenar cada vez coclear en un pozo independiente en una placa de 48 pocillos (o diapositiva de cámara), sumergido en ~ 500 l de 10 mM PBS pH 7,4. Para cada uno de los siguientes pasos el giro coclear debe ser sumergido en un líquido, no flotante en la parte superior o pegada a un lado del pozo. NOTA: Al retirar el líquido de cada pocillo, es fácil perder los giros cocleares o encárgate de la punta de la pipeta. Cambio de soluciones con una punta de pipeta 200 l usando un alcance de la disección ayudará a prevenir esto. </li><li> Con una pipeta, retire PBS de cada pocillo y reemplazar con ~ 200 - 300 l por pocillo de bloquear / solución de permeabilización (1% Triton X-100, 1% de albúmina de suero bovino (BSA), y 10% de suero normal de cabra (NGS) diluido en PBS 10 mM pH 7,4). Incubar 1 hora a temperatura ambiente en un rotador 3D. NOTA: Si cualquier anticuerpo primario utilizado fue hecha en un huésped de cabra, entonces será necesario un anticuerpo secundario de cabra anti-NGS y NO se debe utilizar para cualquiera de los pasos. Suero de caballo normal puede ser utilizado como un reemplazo para NGS. </li><li> Eliminar la solución de bloqueo / permeabilización utilizando una pipeta y reemplazar con ~ 100 l por pocillo de solución de anticuerpo primario (0,1% Triton X-100, 1% de BSA, y 5% NGS diluidos en PBS 10 mM pH 7,4). El factor de dilución para cada anticuerpo primario varía. Incubar O / N (mínimo 14 horas) a 4 ° C en un rotador 3D. NOTA: Si se utiliza más de un anticuerpo primario, todas se pueden combinar en la misma solución para la incubación, sólo asegúrese de que cada anticuerpo primario tiene un host diferente. </li><li> Retire solución de anticuerpo primario utilizando una pipeta y realizar 3 lavados de 10 mM de PBS pH 7,4 a ~ 500 l por pocillo. Cada lavado incuba un mínimo de 5 minutos a temperatura ambiente en un rotador 3D. </li><li> Retire última PBS lavado usando una pipeta y reemplazar con ~ 100 l por pocillo de una solución de anticuerpo secundario (0,1% Triton X-100, 1% de BSA, y el 5% NGS diluidos en PBS 10 mM pH 7,4). El factor de dilución para cada fluorescentemente etiquetado anticuerpo secundario es generalmente de 1: 500 o 1: 1000. Coloque la placa de 48 pocillos en un cuadro negro para proteger fluorescente etiquetados anticuerpos secundarios de la luz. Incubar 2-3 horas a temperatura ambiente en un rotador 3D. NOTA: Si se necesita más de un anticuerpo secundario, que se pueden combinar en la misma solución para la incubación. Asegúrese de que no hay posibilidad de etiquetado cruz (ej., El uso de anticuerpos secundarios de cabra anti-conejo y pollo anti-cabra) </li><li> Retire solución de anticuerpo secundario con una pipeta y realizar 3 lavados de 10 mM de PBS pH 7,4 a ~ 500 l por pocillo. Incubar cada lavado durante un mínimo de 5 min a RT en un rotador 3D. Mantenga placa de 48 pocillos en un cuadro negro para protegerlo de la luz. </li><li> Retire último lavado PBS utilizando una pipeta y reemplazar con ~ 100 l por pocillo de CEOShst 33342 (diluido 1: 2000 en PBS 10 mM pH 7,4) para etiquetar los núcleos. Incubar 15 - 20 min a TA en un rotador 3D. Mantenga placa de 48 pocillos en un cuadro negro para protegerlo de la luz. No incubar más de 20 min. </li><li> Retire la solución Hoechst utilizando una pipeta y realizar 3 lavados de 10 mM de PBS pH 7,4 a ~ 500 l por pocillo. Incubar cada lavado durante un mínimo de 5 min a RT en un rotador 3D. Mantenga placa de 48 pocillos en un cuadro negro para protegerlo de la luz. </li><li> Todos los pasos se pueden extender, excepto la incubación Hoechst, por varias horas si es necesario. Para detener la reacción en cualquier momento, simplemente sumergir las muestras en ~ 500 ul de PBS 10 mM pH 7,4 y almacenar la placa 48 -bien (o diapositiva de cámara) a 4 ° C hasta que esté listo para reanudar las horas de protocolo o de 1 - 2 días después . </li></ol> 7. Monte Coclear Activa Diapositivas <ol><li> Etiquetar los portaobjetos con información pertinente acerca de la muestra y los anticuerpos utilizados. </li><li> Pipeta ~ 50 l de los medios de montaje en cada diapositiva y tener cuidadopara evitar burbujas. Centrifugar el tubo que contiene el medio de montaje para eliminar las burbujas. </li><li> Usando # 4 o # 5 pinzas de joyero recta, sujete los axones del ganglio espiral para transferir suavemente una vuelta coclear de la placa de 48 pocillos a la diapositiva y el lugar en los medios de montaje. Monte una vuelta coclear por diapositiva para evitar exposición a la luz y fotoblanqueo durante el proceso de obtención de imágenes. </li><li> Utilice un microscopio de disección estéreo para asegurar que a su vez coclear no se dobla, tuerce, o cerca de una burbuja de aire. Si se produce alguna de estas condiciones, fórceps uso # 4 o # 5 de joyero directamente a reposicionar el turno coclear. </li><li> Coloque un extremo de un cubreobjetos sobre el portaobjetos y suelte suavemente para dejar caer el cubreobjetos. </li><li> Utilice un microscopio de disección estéreo para asegurarse de que la vuelta coclear no se dobla, tuerce, o cerca de una burbuja de aire. Si se produce alguna de estas condiciones, mueva suavemente el cubreobjetos de ida y vuelta para volver a colocar el turno coclear. </li><li> Colocar los portaobjetosen una carpeta de diapositivas para que queden planos. Deje de montaje cura medios O / N a temperatura ambiente (mantener en la oscuridad) </li><li> Cubreobjetos sello con esmalte transparente de uñas y almacenar a temperatura ambiente o -20 ° C hasta el fotografiado. Las diapositivas se pueden almacenar en una carpeta de diapositivas o caja de portaobjetos. NOTA: Las diapositivas se pueden almacenar a largo plazo a -20 ° C o -80 ° C y la fluorescencia se mantendrá durante varios meses. </li><li> Diapositivas de imágenes utilizando un microscopio confocal con la longitud de onda apropiada basada en los anticuerpos secundarios utilizados durante el procedimiento de inmunotinción. Ajustes de brillo y contraste se pueden realizar utilizando el software de imagen proporcionada por el vendedor confocal. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

<html> Hay varios pasos críticos para el éxito de la disección de todo el montaje y la inmunotinción. Sin embargo antes de que cualquiera de estos métodos se llevan a cabo, se requiere la fijación adecuada del tejido coclear. Recomendamos el uso de metanol libre, ultra-pura, EM grado PFA. PFA hecha de polvo puede tener trazas de metanol y un pH inestable que disminuye la calidad de inmunofluorescencia. Otros grupos también han demostrado que las disecciones similares son posibles utilizando fijadores que no contienen for...

La cóclea en forma de espiral del oído interno, contenida dentro del hueso temporal, alberga el órgano de Corti, el órgano final sensorial auditiva en mamíferos. La cóclea está tonotópicamente organizado y comúnmente dividido en apical, media y basal turnos correspondientes a diferentes regiones de frecuencia con detección de sonido de alta frecuencia en la base y detección de baja frecuencia en el vértice 1. Las células ciliadas, las células mechanosensory del órgano de Corti, corren a lo largo de la cóclea, que es de aproximadamente 6 mm de largo en ratones 2,3. Estas células convierten la energía mecánica de las ondas de sonido, que se transmiten a través del laberinto membranoso lleno de líquido, en señales neurales que son procesados ​​por las estructuras auditivas centrales. La técnica descrita aquí proporciona un método para preparar preparaciones completas de órgano de Corti después de la calcificación de la cóclea es completa (para las muestras que van desde una semana de edad hasta la edad adulta). También presentamos un método para immunostacaniza todo ello montado tejido coclear. Preparaciones completas cocleares son cruciales para la visualización de todas las células del cabello y que rodea las células de apoyo en sus disposiciones espaciales naturales y permiten el análisis en tres dimensiones con el uso de la microscopía confocal. Drs. Hans Engstrom y Harlow Ades describen originalmente montar todo un método de disección coclear en 1966. Se detallan a una técnica para fijar rápidamente y diseccionar cochleae calcificado sumergido en líquido de una variedad de mamíferos, conservando intactas segmentos cortos del órgano de Corti para el análisis microscópico 4. La disección de un sin fijar, cóclea rata calcificada también se ha ilustrado en un video instructivo 5. Drs. Barbara Bohne y Gary Harding de la Universidad de Washington hicieron varias modificaciones importantes a este método. En su versión del método de montaje en toda coclear, el hueso temporal fue descalcificada, incrustado en plástico y cinco medias vueltas o diez cuartos de vueltas fueron disecciónted 6,7. Dr. Charles Liberman y sus colegas de Eaton Peabody laboratorios, Massachusetts ojo y Ear Infirmary, modificaron esta técnica por lo que no se requiere que la incrustación de plástico 8. Además modificación de la técnica se produjo en el laboratorio del Dr. Jian Zuo en el Hospital de Investigación Infantil St. Jude 9-12 que informó al método de disección que aquí se presenta. Utilizamos una estrategia diferente para acceder al órgano de Corti que Bohne y Liberman, que permite el aislamiento de apical completa, media y vueltas basales. Así, el tejido diseccionado es más grande y menos probabilidades de ser perdido o dañado durante el proceso de disección o de inmunotinción. Además, el método actual facilita la medición de la distancia desde la punta apical o basal gancho para identificar una región de frecuencia. Aunque muchos laboratorios realizan inmunotinción del tejido coclear, no está claro dónde se originó este método. Como resultado de ello hay varias recetas para el bloqueo de buffers y tampones de incubación de anticuerpos que pueden afectar el desempeño de los anticuerpos primarios individuales. A continuación, presentamos un método para inmunotinción con anticuerpos marcados con fluorescencia que es aplicable a los anticuerpos más comúnmente utilizados en el campo auditivo. La forma compleja de la cóclea, delicada estructura del órgano de Corti, y encajamiento ósea proporcionan un desafío para el análisis histológico y bioquímico. Una variedad de técnicas se utilizan actualmente en el campo de audición para superar estas características difíciles y visualizar las células dentro del órgano de Corti, cada técnica con sus propias ventajas y desventajas. El protocolo que aquí se presenta permite la disección para el conjunto de montaje de la cóclea del ratón adulto y, con una ligera modificación, potencialmente se puede utilizar para examinar las estructuras críticas dentro de las cócleas de una variedad de otros organismos modelo utilizados en el campo.

<table><tbody><tr><td>Pinzas de patrón estándar</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-12</td><td>se puede comprar a otros proveedores</td></tr><tr><td>Tijeras finas de 10,5 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>14060-11</td><td>se puede comprar a otros proveedores</td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga de 2 ml MidSci</td><td></td><td>AVSS2000</td><td>se puede comprar a otros proveedores</td></tr><tr><td>16% de formaldehído, sin metanol, ultra puro, EM grade</td><td>Polysciences</td><td>18814</td><td>TÓXICO -- use guantes y no se puede desechar en el fregadero. Se puede comprar a otros proveedores.</td></tr><tr><td>PBS pH 7.4&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P3813-10PAK</td><td>se puede comprar de otros proveedores</td></tr><tr><td>EDTA</td><td></td><td>Fisher BP118-500</td><td>se puede comprar de otros proveedores</td></tr><tr><td>rotador de tubo de extremo a extremo</td><td>Fisher</td><td>05-450-127</td><td>se puede comprar de otros proveedores Placa de</td></tr><tr><td>Petri de 60 mm</td><td>Fisher</td><td>50-202-037</td><td>se puede comprar de otros proveedores</td></tr><tr><td>Kit de encapsulante de silicona Dow Corning Sylgard 184</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td><td></td></tr><tr><td>carbón activado</td><td>Fisher</td><td>AC134372500</td><td>se puede comprar de otros proveedores</td></tr><tr><td>microscopio de disección estereoscópica</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000</td><td>se puede comprar de otros proveedores</td></tr><tr><td>Pinzas de joyero Dumont #4</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>11241-30</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas de joyero Dumont #5 Herramientas de</td><td>ciencia fina</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de resorte Vannas de 2,5 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>15001-08</td><td>curvo&nbsp;</td></tr><tr><td>Tijeras de resorte Vannas-Tubingen de 5 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>15003-08</td><td>placas rectas</td></tr><tr><td>de 48 pocillos</td><td>Fisher</td><td>08-772-52</td><td>se puede comprar a otros proveedores</td></tr><tr><td>portaobjetos de cámara de 8 pocillos</td><td>Fisher</td><td>1256518</td><td>se puede comprar a otros proveedores</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100-500</td><td>se puede comprar a otros proveedores</td></tr><tr><td>BSA, fracción V</td><td>Fisher</td><td>BP1605</td><td>se puede comprar de otros proveedores</td></tr><tr><td>NGS</td><td>Vector labs</td><td>S-1000</td><td>se puede comprar de otros proveedores</td></tr><tr><td>NHS</td><td>Vector labs</td><td>S-2000</td><td>se puede comprar de otros proveedores</td></tr><tr><td>3D rotator</td><td>Midsci</td><td>R3D-710</td><td>se puede comprar de otros proveedores</td></tr><tr><td>Western blot incub box XL</td><td>Licor</td><td>929-97401</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H3570</td><td>se puede comprar a otros proveedores</td></tr><tr><td>Medios de montaje antidecoloración de oro prolongado</td><td>Life Technologies</td><td>P36930</td><td>se puede comprar a otros proveedores, pero los medios de montaje varían en su capacidad para proteger contra el fotoblanqueo</td></tr><tr><td>Superfrost Plus Slides</td><td>Fisher</td><td>12-550-15</td><td>se puede comprar de otros</td></tr><tr><td>proveedorescubreobjetos 22 x 22 x 1</td><td>Fisher</td><td>12-548-B</td><td>se puede comprar a otros proveedores</td></tr><tr><td>esmalte de uñas</td><td>transparente Farmacia</td><td></td> local <td>se puede comprar a otros proveedores Carpeta de</td></tr><tr><td>cartón para diapositivas</td><td>Fisher</td><td>12-587-10</td><td>se puede comprar a otros proveedores</td></tr><tr><td>Caja de plástico para diapositivas</td><td>Fisher</td><td>03-448-10</td><td>se puede comprar a otros proveedores</td></tr></tbody></table>

todo el montaje la disección y de inmunofluorescencia del adulto ratón cóclea

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

El órgano de Corti, alojado en la cóclea del oído interno, contiene células ciliadas mecanosensoriales y células de soporte circundantes que están organizadas en forma de espiral y tienen un gradiente tonotópico para la detección del sonido. La cóclea del ratón mide aproximadamente 6 mm de largo y, a menudo, se divide en tres vueltas (ápice, medio y base) para su análisis. Para investigar la pérdida celular, la división celular o la expresión génica en mosaico, es útil la preparación de todo el montaje o la superficie de la cóclea. Este método de disección permite la visualización de todas las células dentro del órgano de Corti cuando se combina con inmunotinción y microscopía confocal para obtener imágenes de células en diferentes planos del eje z. También se pueden obtener múltiples secciones transversales ópticas a partir de estas imágenes de pila z. Además, el método de disección de montaje completo se puede utilizar para la microscopía electrónica de barrido, aunque se necesita un método de fijación diferente. Aquí, presentamos un método para aislar el órgano de Corti como tres vueltas cocleares intactas (ápice, medio y base). Este método se puede utilizar para ratones desde la semana de edad hasta la edad adulta y difiere de la técnica utilizada para muestras neonatales en las que la calcificación de la cóclea es incompleta. Se puede utilizar una versión ligeramente modificada para la disección de la cóclea de rata. También demostramos un procedimiento para la inmunotinción con anticuerpos marcados con fluorescencia.

Se presenta un método para aislar el órgano de Corti como tres vueltas intactas cocleares (ápice, medio y base) a partir de tejido coclear que está calcificada, con escalones de disección clave presentados en la Figura 1. Durante la primera semana postnatal del desarrollo, la calcificación de la cóclea del ratón es incompleta y un método de disección más simple puede ser utilizado 13. Utilizando el método de disección neonatal todo el montaje ...

Se presenta un método para aislar el órgano de Corti adultos como tres vueltas intactas cocleares (ápice, medio y de base). También demostramos un procedimiento de inmunotinción con anticuerpos marcados con fluorescencia. En conjunto, estas técnicas permiten el estudio de las células ciliadas, células de soporte, y otros tipos de células que se encuentra en la cóclea.

Todo el montaje La disección y de inmunofluorescencia del Adulto ratón cóclea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

El objetivo general de este método de disección en preparación completa es aislar la región sensorial de la cóclea adulta calcificada en tres vueltas intactas: el ápice, la parte media y la base. Este método de disección preserva la estructura tridimensional del órgano de Corti y permite la visualización de todas las células cuando se combina con inmunotinción y microscopía confocal para obtener imágenes en diferentes planos a lo largo del eje Z. En comparación con métodos de disección previos, utilizamos una estrategia diferente que genera tres vueltas cocleares más grandes y menos propensas a perderse o dañarse durante el proceso de inmunotinción.La demostración visual de este método es fundamental, ya que la disección es difícil de aprender. Dado que el órgano de Corti es frágil, existe un pequeño margen de error al retirar el ligamento espiral. Tras sacrificar el animal según los procedimientos aprobados y extraer el cerebro, comience por identificar los huesos temporales en la base del cráneo del ratón.Luego retire los nervios craneales utilizando fórceps de patrón estándar. Coloque el fórceps en la punta de la cápsula ótica y use el pulgar de la mano opuesta para presionar hacia abajo sobre el conducto semicircular posterior y desalojar la cóclea encapsulada. Separe la mitad inferior del hueso temporal del cráneo ya sea manualmente con el pulgar y el dedo índice o utilizando tijeras finas de 10,5 centímetros, y colóquelo en paraformaldehído al 4% grado para microscopía electrónica libre de metanol para fijarlo.Después de la fijación, descalcifique los huesos temporales según las instrucciones de la parte escrita del protocolo. Para determinar si la muestra está adecuadamente descalcificada, coloque los huesos temporales sobre un recipiente para disección recubierto con elastómero de silicona y presione suavemente con unas pinzas sobre la cóclea con forma de caracol. Si el tejido está esponjoso, la descalcificación está completa.Añada PBS al platillo de disección y, mientras trabaja bajo un microscopio estereoscópico de disección, use pinzas número cuatro o número cinco para sostener el hueso temporal en la región vestibular y tijeras de resorte Vannas-Tubingen de cinco mililitros para cortar el tejido excedente de la cápsula ótica a los lados y por encima del ápice. Usando tijeras de resorte Vannas de 2,5 mililitros, inserte una hoja en la ventana oval y realice varios cortes pequeños a lo largo del ligamento espiral del giro basal. A continuación, inserte una hoja de las tijeras de resorte Vannas-Tubingen de cinco mililitros en la región recién cortada y coloque la otra hoja en el exterior del hueso temporal, medial a la ventana oval.Este corte separa el giro basal de los giros medio y apical. A continuación, para completar la disección del giro basal, use las tijeras de resorte de 2,5 mililitros para cortar las fibras nerviosas del ganglio espiral que se conectan con el modiolo, con el fin de liberar la tensión en el giro basal. Corte por debajo del giro basal para separarlo de los órganos vestibulares.Use pinzas para guiar el tejido y sujetar las fibras del ganglio espiral al recipiente recubierto con elastómero de silicona. Realice una serie de pequeños cortes para eliminar el ligamento espiral desde arriba y desde abajo del órgano de Corti. Con las fibras del ganglio espiral sujetas al recipiente recubierto con elastómero de silicona, use las pinzas para eliminar cualquier resto de la membrana de Reissner del órgano de Corti.Realice varios cortes para reducir el grosor de los axones del ganglio espiral. Luego, sujete los axones restantes del ganglio espiral con pinzas y transfiera la espira basal disecada a una placa de 48 pocillos que contenga aproximadamente 500 microlitros de PBS. A continuación, separe las espiras media y apical colocando primero los dos tercios restantes de la cóclea con el lado apical hacia abajo.Luego, inserte una hoja de las tijeras de 2,5 mililitros en la escala media, donde anteriormente el giro medio estaba conectado al giro basal, y realice varios cortes a lo largo del ligamento espiral del giro medio. Utilizando las tijeras de cinco mililitros, inserte una hoja en la región cortada, colocando el giro medio encima de la hoja. Coloque la otra hoja en la parte externa del laberinto óseo, formando un ángulo de 90 grados respecto al ápice.Este corte separa la vuelta media de la vuelta apical. A continuación, finalice la disección de la vuelta media retirando el ligamento espiral del órgano de Corti. Transfiera la vuelta diseccionada a una placa de 48 pocillos, como antes.Ahora, utilice tijeras de resorte Vannas de 2,5 mililitros para abrir la tapa que cubre el giro apical y repita el procedimiento para eliminar el ligamento espiral del giro apical del órgano de Corti. Transfiera el giro diseccionado a una placa de 48 pocillos, como antes. Para comenzar el procedimiento de inmunotinción, primero aspire el PBS de cada pocillo y luego sustitúyalo con 200 a 300 microlitros de solución bloqueante e incube durante una hora a temperatura ambiente en un rotador 3D.Una vez finalizado el tiempo de incubación, retire la solución bloqueante y sustitúyala por 100 microlitros de anticuerpo primario, diluido adecuadamente en solución portadora. Incube durante toda la noche a cuatro grados Celsius en un rotador 3D. Al día siguiente, retire la solución de anticuerpo primario y lave cada pocillo con 500 microlitros de PBS durante al menos cinco minutos cada vez, a temperatura ambiente.Repita el lavado dos veces. Después del último lavado, aspire el PBS y tenga cuidado de no aspirar el tejido disecado en la punta de la pipeta. Reemplace con 100 microlitros por pozo de anticuerpo secundario marcado con fluorescencia diluido en solución portadora.Coloque la placa de 48 pocillos en una caja negra para protegerla de la luz y colóquela en el rotador 3D para incubar durante dos o tres horas a temperatura ambiente. Tras la incubación, aspire la solución de anticuerpo secundario y lave tres veces con PBS como antes. Después de eliminar el último lavado, agregue 100 microlitros de Hoechst para etiquetar los núcleos.Proteger de la luz e incubar de 15 a 20 minutos a temperatura ambiente en un rotador 3D. Finalmente, eliminar la solución de Hoechst y lavar tres veces con PBS como antes. Después de etiquetar cada portaobjetos, pipetear 50 microlitros de medio de montaje sobre cada portaobjetos.Luego, utilizando fórceps rectos de joyero número cuatro o número cinco, sujete los axones del ganglio espiral y transfiera suavemente una espira coclear desde la placa de 48 pocillos al medio de montaje. Utilice el microscopio para asegurarse de que la espira diseccionada no esté doblada ni torcida. Coloque un extremo de una lámina de cubierta sobre un portaobjetos y suéltela suavemente para permitir que la lámina de cubierta caiga.Utilice un microscopio estereoscópico de disección para asegurarse de que la espiral coclear no esté cerca de una burbuja de aire. Si esto ocurre, mueva suavemente la cubierta hacia adelante y hacia atrás para reposicionar la espiral coclear. Repita el procedimiento para las demás espirales cocleares.Monte una vuelta coclear por portaobjetos para evitar la exposición a la luz y el fotoblanqueo durante el proceso de imagen. Coloque los portaobjetos en una carpeta para portaobjetos de manera que queden planos. Protéjalos de la luz y permita que el medio de montaje cure durante la noche a temperatura ambiente.Al día siguiente, selle los cubreobjetos con esmalte transparente y almacénelos a temperatura ambiente o 20 grados Celsius hasta su adquisición de imagen. Esta imagen de corte confocal muestra el giro medio coclear aislado de un ratón p15. Se superpusieron imágenes de 420X para reconstruir todo el giro medio.Las células pilosas, marcadas con un anticuerpo primario de conejo anti-miosina VIIa y un anticuerpo secundario conjugado con Alexa 647, aparecen magenta. Las células de sostén, marcadas con un anticuerpo primario de cabra anti-SOX2 y un anticuerpo secundario conjugado con Alexa 568, aparecen verdes. Los núcleos aparecen azules debido a la tinción con Hoechst.La barra de escala representa 100 micrones. Esta imagen muestra una sección transversal óptica del giro medio aislado de un ratón de seis semanas de edad en el plano X, Z. Nuevamente, las células pilosas están marcadas con un fluoróforo magenta y las células de sostén con un fluoróforo que aparece verde.Este es un aumento mayor de la imagen anterior, con las líneas de mira eliminadas. La barra de escala representa 20 micrones. Las siguientes cuatro imágenes muestran algunos de los problemas que pueden ocurrir durante la disección en preparación de montaje completo, o al montar giros cocleares sobre portaobjetos.Aquí, en el lado izquierdo de la imagen, el tejido coclear fue cortado junto a la última fila de células ciliadas externas, lo que provocó que muchas de estas células quedaran montadas en ángulos variables. En esta imagen, una sección del órgano de Corti en el lado izquierdo ha sido eliminada. Hay un orificio perforado en la región de las células ciliadas externas en el centro de la imagen.Aquí el órgano de Corti está plegado en varios lugares. Una vez dominada, la técnica de disección en preparación completa puede completarse en 20 a 30 minutos. Durante la realización de este procedimiento, es importante evitar colocar la pinza sobre el órgano de Corti y evitar tirar o agarrar el ligamento espiral.Cierre en cambio la pinza y sujete las fibras del ganglio espiral al recipiente recubierto con elastómero de silicona. Las muestras de ratones de entre una y tres semanas de edad son más tolerantes y útiles para aprender el método de disección. Además, las muestras con daño en las células ciliadas son más difíciles de disecar, siendo especialmente frágiles y delicados los tejidos expuestos a ruido.Tras este procedimiento de disección, se pueden realizar otros métodos, como la microscopía electrónica de barrido. Sin embargo, se necesita un fijador diferente. Además, hemos realizado ligeras modificaciones a este protocolo para la disección de tejido coclear de rata, y en el futuro esperamos modificarlo aún más para la disección de la cóclea de chinchilla, jerbo y cobaya.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Un procedimiento simple de vibratome seccionar el órgano de Corti, seguido por microscopía confocal de inmunohistoquímica y se describe. Este procedimiento permite una mejor conservación de la citoarquitectura fino del órgano de Corti de mamíferos, y por lo tanto permite la cuantificación exacta de los tipos de células.

Vibratome seccionamiento para la Preservación de Mejora de la citoarquitectura del órgano de Corti mamíferos

Los cilios primarios influyen en varias vías de señalización. La cóclea de mamíferos es ideal para examinar la señalización de la polaridad de las células planas (PCP). La disfunción de los cilios afecta el crecimiento coclear, el patrón celular y la orientación de las células ciliadas, lecturas de PCP. Nuestro objetivo es analizar la señalización de PCP en la cóclea de ratón mediante análisis fenotípico, inmunohistoquímica y microscopía electrónica de barrido.

Evaluación de planar-Cell-polaridad fenotipos en ciliopatía ratón mutante cóclea

El objetivo de este protocolo es un método eficaz para decellularize y descalcificar cócleas de ratón para utilización como andamios para aplicaciones de ingeniería de tejidos.

Un protocolo para Decellularizing ratón cócleas para ingeniería de tejidos del oído interno

Este manuscrito describe un protocolo experimental para evaluar las características morfológicas y el estado funcional de las sinapsis de cinta en ratones normales. El modelo actual también es adecuado para modelos de sinaptopatía coclear inducidas por ruido y relacionados con la edad. También se discuten los resultados correlativos de estudios anteriores del ratón.

Evaluación morfológica y funcional de sinapsis de cinta en regiones de frecuencia específica de la Cóclea de Ratones

Este artículo presenta un método de preparación de superficie coclear modificado que requiere descalcificación y uso de un adhesivo celular y tisular para adherir las piezas de epitelía coclear a 10 mm de resbalones de cubierta redonda para inmunohistoquímica en cocleares de ratón adultos.

Preparación de la superficie coclear en el ratón adulto

En este estudio, presentamos un método de la proyección de imagen en tiempo real usando microscopia confocal para observar las células que se mueven hacia el tejido dañado por la incubación ex vivo con el epitelio coclear que contiene el órgano de Corti.

In vitro Time-lapse live-cell imaging para explorar la migración celular hacia el órgano de Corti

Se presenta un protocolo para el procesamiento de cócleas de jerbos adultos jóvenes y ancianos mediante el inmunoetiquetado de las estructuras sinápticas aferentes y las células ciliadas, el apagado de la autofluorescencia en el tejido envejecido, la disección y estimación de la longitud de las cócleas y la cuantificación de las sinapsis en pilas de imágenes obtenidas con imágenes confocales.

Sinapsis de cinta de inmunoetiquetado y conteo en cócleas de jerbos jóvenes y ancianos

Aquí, presentamos un protocolo para un modelo de ratón de pérdida auditiva inducida por ruido (NIHL). Para inducir el NIHL, desarrollamos un dispositivo nuevo y sencillo que utiliza plástico corrugado, una jaula trampa para ratas y un altavoz. Se emplearon imágenes de inmunofluorescencia y respuesta auditiva del tronco encefálico para evaluar la función auditiva y el daño de las células ciliadas externas, respectivamente.

Condiciones experimentales modificadas para la pérdida de audición inducida por ruido en ratones y evaluación de la función auditiva y el daño de las células ciliadas externas

Se desarrolló un microscopio de hoja de luz para obtener imágenes y digitalizar toda la cóclea.

Obtención de imágenes de la cóclea envejecida con microscopía de fluorescencia de lámina de luz

La estría vascular es vital para la generación de potencial endococlear. Aquí, presentamos la disección de la estría vascular del ratón adulto para la secuenciación de un solo núcleo o inmunotinción.

Disección de estrías vasculares de ratón adulto para secuenciación de un solo núcleo o inmunotinción

Este protocolo, destinado a usuarios novatos de tejido del oído interno de ratón, detalla exhaustivamente los pasos para procesar los oídos internos de ratón en diferentes etapas de desarrollo para la inmunotinción de secciones.

Criosección e inmunotinción de tejido del oído interno de ratón: desde la etapa embrionaria hasta la adulta

Aprende la disección de montaje completo de la cóclea adulta del ratón para preservar el órgano de Corti en tres vueltas intactas. Esta técnica permite visualizar células ciliadas y de soporte mediante inmunofluorescencia y microscopía confocal.

Todo el montaje La disección y de inmunofluorescencia del Adulto ratón cóclea

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