Name: Inducción de un estado isoeléctrico cerebro para investigar el impacto de la actividad endógena sináptica neuronal en la excitabilidad En Vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: Aprende a inducir un estado isoeléctrico cerebral en ratas para estudiar propiedades neuronales intrínsecas sin entradas sinápticas. Esta técnica permite registrar actividad intracelular in vivo durante inactividad cerebral completa.

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Este trabajo fue apoyado por becas de la Fundación de Francia, el Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, la Universidad Pierre y Marie Curie y el programa &#39;Investissements d&#39;avenir &quot;ANR-10-IAIHU-06.

Todos los procedimientos se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices de la Unión Europea (Directiva 2010/63 / UE) y aprobado por el Comité Ético de Charles Darwin sobre la experimentación con animales. Se describe aquí el procedimiento que utilizamos habitualmente en nuestro laboratorio, sin embargo la mayoría de las medidas se pueden adaptar para satisfacer las necesidades específicas de cada uno. 1. Preparación quirúrgica Nota: Todos los puntos de incisión y de presión deben ser infiltrado en varias ocasiones con anestésico local (lidocaína o bupivacaína). El presente procedimiento es terminal, si se requiere una preparación aséptica varias modificaciones deben ser implementadas. <ol><li> Anestesiar una rata con pentobarbital sódico (40 mg / kg) y ketamina (50 mg / kg) en dos inyecciones intraperitoneales separadas localmente (IP). </li><li> Deje que el animal vaya bajo anestesia general y en repetidas ocasiones verificar que un plano quirúrgico de anestesia se alcanza (sin reacción a los pies pellizcos). Coloque la rata en una Feedback manta eléctrica e inserte una sonda rectal para mantener la temperatura del núcleo en torno al 37 ° C. </li><li> Colocar un catéter en la cavidad peritoneal para facilitar la inyección subsiguiente de agentes anestésicos y para evitar la perforación de órganos por pinchazos de aguja repetidos 30. <ol><li> Cortar el pelo sobre un pequeño (~ 2 - 3 mm) zona superior una región situada en el cuadrante inferior derecho o izquierdo del estómago. Nota: Crema depilatoria también se puede utilizar. </li><li> Hacer un 2 - 3 mm incisión en la piel con unas tijeras afiladas o un bisturí. Utilizando disección roma, eliminar las capas de grasa y músculo hasta que se observa la cavidad peritoneal. </li><li> Inserte aproximadamente 1 - 2 cm de un pequeño catéter en la cavidad y cerrar la herida con pegamento quirúrgico. (. Por ejemplo, 2 French - correspondiente a 0,043 mm de diámetro interior): Nota El diámetro y la longitud total del catéter deben ser mínimos para reducir los volúmenes muertos. tubos de poliuretano son los más adecuados. </li><li> Haga un lazo de sutura y tél catéter a la piel para asegurarlo en su lugar. </li></ol></li><li> Instalar un tubo traqueal para controlar la ventilación durante la respiración artificial. <ol><li> En cuanto a la etapa anterior, preparar el área de interés (1 - 2 cm sobre la tráquea justo por encima del manubrio), quitar el pelo y una incisión en la piel. </li><li> Blunt diseccionar las primeras capas de grasa y músculos, a continuación, pasar la glándula salivar a un lado y exponer la tráquea mediante la disección suavemente la última capa de músculos. </li><li> Retirar con cuidado los tejidos más de la tráquea y deslice un hilo por debajo de ella mediante pequeñas pinzas. Hacer un nudo de cirujano con el hilo pero no lo hacen apretado todavía. </li><li> Incisión en la tráquea de manera transversal entre dos anillos cartilaginosos. sangre hisopo en la tráquea en su caso. </li><li> Insertar un tubo traqueal con el diámetro apropiado y apretar el nudo del hilo para asegurar el tubo estacionario. Para una estabilidad adicional del hilo adicional se puede conectar en un punto del tubo de la tráquea superior. </li><li> Suture la herida cierre o bien utiliza grapas quirúrgicas. Evitar pegamento quirúrgico aquí si el tubo traqueal está destinado a ser reutilizado. </li></ol></li><li> Instalar el animal en un marco estereotáxico y vigilar atentamente las siguientes variables fisiológicas: ECoG, SpO 2, ETCO 2, la frecuencia cardíaca (a través de un electrocardiograma, ECG) y la temperatura interna. Vigilar y ajustar estas variables para mantener una profundidad adecuada de la anestesia y estado fisiológico. Específicamente, complementar la anestesia con una pequeña dosis (10 mg / kg) de pentobarbital sódico, si es necesario. </li><li> Aplicar pomada ocular en ambos ojos para evitar la desecación. Cortar el pelo en el cuero cabelludo, hacer una incisión longitudinal (~ 2 cm) y la resección de los tejidos conectivos que recubren el cráneo utilizando un bisturí o una cureta. </li><li> Hacer un pequeño craneotomía (~ 1,5 mm de diámetro) sobre la región de interés con un taladro dental. Nota: En este caso, el campo barril de la corteza somatosensorial primaria está dirigida (7 - 8 mm por delante de la línea interauricular, 4,5- 5,5 mm lateral a la línea media 31). Enjuagar varias veces para disipar el calor. </li><li> El uso de fórceps finos adicional para hacer suavemente un pequeño orificio en la duramadre. Reservar una región ~ 0,5 mm dentro de la trepanación craneana para colocar el electrodo ECoG (véase el paso siguiente). Permanentemente mantener la corteza húmedo con una solución de NaCl 0,9% (o fluido cerebro-espinal artificial). </li><li> Colocar una impedancia baja (~ 60 kW) electrodo de plata (el electrodo de ECoG) en la duramadre, evitando la región cortical no cubierto por las meninges, y colocar el electrodo de referencia en un músculo del cuero cabelludo en el otro lado de la cabeza. </li><li> En esta etapa (30 min después de la inyección de pentobarbital última de sodio), mantener la anestesia mediante inyecciones repetidas de pentobarbital sódico (10-15 mg / kg / h) o fentanilo (3-6 mg / kg / h) a través del catéter IP. La primera tendrá como resultado una lenta oscilatoria,, patrón de ECoG similar al sueño mientras que el segundo se traducirá en una vigilia similar, el perfil cortical desincronizado. </li><li> Ajuste el v artificialsistema ENTILACIÓN modo que la frecuencia respiratoria y el volumen son similares a las de la respiración espontánea de la rata (rango normal 70-115 respiración / min 32). A continuación, conecte la ventilación mecánica al tubo traqueal y verificar la inflación caja torácica adecuada (en ambos lados). Si no, ajuste la posición de la tubería de ventilación en el eje traqueal. Si es necesario, aspirar la secreción presente en la tráquea con un catéter conectado a una jeringa o una bomba de vacío. </li><li> Si todas las variables fisiológicas 32-35 y ECoG 29,36 patrones reflejan un plano quirúrgico estable de la anestesia, hacer una inyección intramuscular de trietioduro de galamina en cada pierna para paralizar la rata, 40 mg / kg para la primera inyección y luego 20 mg / kg , cada 2 horas 19,29,36,50. </li></ol> 2. registros intracelulares <ol><li> Tirar de una micropipeta de vidrio (en punto de microelectrodos) con una punta de ~ 0,2 micras como su resistencia varía entrn 50 y 80 mO una vez llenos de 2 M de acetato de potasio (KAC). </li><li> Coloque la pipeta en un soporte específico con una plata / plata-cloruro de alambre (Ag / AgCl) para conectar la solución de la pipeta a un amplificador intracelular (a través de una etapa de la cabeza). El soporte debe estar unido a un micromanipulador. Colocar un electrodo de referencia Ag / AgCl sobre los músculos del cuello de la rata. </li><li> Introducir lentamente la pipeta en el cerebro hasta la región de interés y verificar su resistencia mediante la supervisión de las caídas de tensión en respuesta a medidas actuales. Utilice el zumbido (o zap) botón del amplificador para limpiar la pipeta si es necesario. </li><li> Use hisopos de algodón o triángulos de absorción sintéticos para secar la craneotomía (tenga cuidado de no tocar la ECoG o electrodos intracelulares) antes de cubrirla con elastómero de silicona o 4% de agarosa para reducir los movimientos del cerebro. </li><li> Bajar la pipeta de 1 - 2 micras pasos hasta que su resistencia aumenta cuando se acerca a una célula. A continuación, utilice la función de zumbido del amplificador al Penetradel te en la neurona. </li></ol> 3. inducir el estado isoeléctrico <ol><li> Realizar el protocolo experimental apropiado (por ejemplo, corrientes respuestas a disparar inyecta de forma intracelular, las relaciones corriente-tensión, las respuestas de los estímulos sensoriales) en esta etapa mientras se controla simultáneamente el potencial de membrana de la neurona, la ECoG y las variables fisiológicas. </li><li> Asegúrese de que el electrodo intracelular es estable en la célula mediante el análisis de la estabilidad tanto del potencial de membrana y la acción de posibles propiedades a lo largo de la sesión de grabación. Si no es así, no se vaya al siguiente paso y esperar hasta que la grabación se estabiliza de nuevo o buscar otra neurona. </li><li> Inyectar una dosis alta, pero infra-letal de pentobarbital sódico (~ 90 mg / kg, puede ser tan bajo como 35 mg / kg de la condición inicial pentobarbital y hasta 155 mg / kg de la condición inicial de fentanilo) a través de la línea IP. Nota: Dentro de 15 - 20 min intracelular y la wa ECoGveforms deben reducir la velocidad con silencios eléctricos intermitentes para alcanzar transitoriamente el llamado &quot;estallido de la supresión&quot; perfil 37,38, que colapsa progresivamente a un estado isoeléctrico completa. Se espera que el ritmo cardiaco se ralentiza significativamente a la baja (por ~ 10 - 20%) pero la SpO 2 y CO 2 ef debe permanecer relativamente constante. </li><li> Si no se alcanza el estado isoeléctrico, inyectar una pequeña cantidad de pentobarbital sódico (~ 10% de la dosis paso 3.1). Espere 15 minutos antes de añadir más anestesia si todavía no se alcanza el estado isoeléctrico. </li><li> Repita el protocolo experimental para comparar el impacto de la dinámica de la red de propiedades de integración de la neurona registrada. Nota: Después del cese de las inyecciones anestésicas, la actividad eléctrica del cerebro debe recuperarse por completo dentro de 3 a 4 horas. </li><li> Al final del experimento, inyectar una dosis letal de pentobarbital de sodio (200 mg / kg, IP) para la eutanasia la rata. </li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Se describe aquí un nuevo método para suprimir in vivo la actividad eléctrica cerebral espontánea, tanto en los niveles celulares de la red y. Este procedimiento conduce a un estado del cerebro extrema, conocida como estado de coma isoeléctrico 41. Desde un punto de vista clínico, una inactividad tales electrocerebral es la anomalía más grave que se puede ver en el EEG. Se asocia sobre todo con un coma irreversible, con todos los pacientes, ya sea que mueren o continuas en un estado vegetativo persis...

En la ausencia de estímulos ambientales o tareas de comportamiento, el &quot;reposo&quot; cerebro genera un flujo continuo de la actividad eléctrica que se puede grabar desde el cuero cabelludo, como las ondas electroencefalográficas (EEG). La correlación intracelular de esta actividad cerebral endógeno se caracteriza por fluctuaciones de la tensión de la membrana de fondo (también conocidos como &quot;ruido sináptica&quot;), que se componen de una combinación de los potenciales sinápticos excitatorios e inhibitorios que reflejan la actividad en curso de redes aferentes 1,2. Esta actividad espontánea varía en frecuencia y amplitud con los diferentes estados de vigilancia. Dilucidar el impacto de la actividad de red en la excitabilidad y capacidad de respuesta de las neuronas individuales es uno de los principales retos de la neurociencia 3,4. Muchos estudios experimentales y computacionales han explorado el impacto funcional de la actividad sináptica en curso sobre el propertie integradoras de las neuronas. Sin embargo, el papel de los diferentes parámetros neuronales afectadas por el ruido de fondo sináptica sigue siendo difícil de alcanzar. Por ejemplo, el nivel medio de despolarización de la membrana se ha encontrado de manera positiva o negativamente 5,6 7-9 correlacionada con la capacidad de las entradas sensoriales para disparar los potenciales de acción. Además, mientras que algunas investigaciones sugieren que las fluctuaciones del potencial de membrana, lo que resulta de una corriente que varía continuamente de entradas sinápticas aferentes, afectan en gran medida la capacidad de respuesta de las neuronas individuales mediante la modulación de la ganancia de su relación de entrada-salida 3,10-13, otros indican que cambios en la conductancia de entrada de la membrana mediada por la inhibición de maniobras son suficientes para modular la ganancia neuronal, independientemente de la magnitud de las fluctuaciones de membrana 14,15. Por último, estudios recientes realizados en animales despiertos hicieron hincapié en cómo el procesamiento de la información sensorial en una sola neurona depende de manera crítica de la situación de la vigilancia de unand la corriente 16,17 demanda de comportamiento. Una estrategia sencilla para elucidar el papel funcional de un proceso determinado en un sistema altamente interconectada es determinar cómo su ausencia altera específicamente el funcionamiento del sistema. Este método se ha utilizado ampliamente en la investigación en neurociencias, por ejemplo utilizando las lesiones experimentales o inactivación de diferentes áreas del cerebro 18-21, o el bloqueo farmacológico de los canales iónicos específicos 22,23. En particular, se ha aplicado in vivo para dar a conocer cómo las dinámicas de conectividad de red y funcionales afectan cómputo sola célula 24-27. Sin embargo, hasta la fecha manipulaciones locales destinados a bloquear la activación de las neuronas y / o perturbar sus propiedades biofísicas básicas pueden ser parcialmente efectivos y están limitadas a un volumen relativamente pequeño del cerebro 28. Para superar estas limitaciones, hemos desarrollado un nuevo enfoque experimental in vivo enla rata para comparar las propiedades electrofisiológicas de las neuronas individuales registradas en un estado cerebro dado, es decir, incrustados en una red dinámica particular, a los obtenidos después de la supresión completa de la totalidad del cerebro actividad sináptica 29. En las condiciones de control, dos dinámicas distintas corticales se podrían generar. electrocorticográfica patrones de sueño-como (ECOG) fueron inducidas por la inyección de dosis moderadas de pentobarbital sódico. Alternativamente, las ondas de ECoG rápidos de pequeña amplitud comparable a la actividad cortical subyacente el estado de vigilia (patrón de vigilia-like) podrían ser producidos por la inyección de fentanilo. Posteriormente, mientras se mantiene la misma ECoG y registro intracelular, un silenciamiento completo de la actividad eléctrica cerebral endógeno se obtuvo por inyección sistémica de una alta dosis de pentobarbital de sodio, que se caracteriza por ECoG isoeléctrico y actividades intracelulares. Debido a que la inducción de un estado de coma tan extremo podría tener potencialmente fatal CONSECUENTEces sobre las funciones biológicas, una atención cuidadosa y constante de las variables fisiológicas era esencial. Por lo tanto, nosotros seguimos meticulosamente la frecuencia de latido del corazón, la concentración de CO 2-final de la espiración (ETCO 2), la saturación de O 2 (SpO2) y la temperatura central de la rata largo de los experimentos. Evaluamos propiedades de las neuronas individuales durante estos diferentes estados utilizando microelectrodos afilados, que son particularmente adecuados para grabaciones largas y estables in vivo. El procedimiento descrito aquí, se puede combinar con otros métodos electrofisiológicos y de imagen y podría extenderse a otros modelos animales.

<table><tbody><tr><td>Pentobarbital Sódico</td><td>Centravet</td><td>Pentobarbital</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina 500</td><td>Merial</td><td>Imalg&egrave; ne 500</td><td></td></tr><tr><td>Fentanilo&nbsp;</td><td>Janssen-Cilag</td><td>Fentanilo</td><td></td></tr><tr><td>Xilocaína</td><td>Centravet</td><td>Xylovet</td> Trietiduro de gallamina <td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>G8134</td><td></td></tr><tr><td>Amplificador ECoG</td><td>A-M Systems</td><td>Amplificador de CA, modelo 1700</td><td></td></tr><tr><td>Amplificador intracelular</td><td>Molecular Devices</td><td>Axoclamp 900A Interfaz</td><td></td></tr> de <tr><td>adquisición de datos</td><td>Cambridge Electronic Design</td><td>Potencia CED 1401-3&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>software de análisis de datos</td><td>Cambridge Electronic Design</td><td>Spike2 versión 7</td><td></td></tr><tr><td>micromanipulador</td><td>Scientifica</td><td>IVM-3000</td><td></td></tr><tr><td>Extractor capilar</td><td>Narishige</td><td>PE-2</td><td></td></tr><tr><td>Capilares de vidrio de borosilicato</td><td>Harvard Apparatus</td><td>GC150F-10</td><td></td></tr><tr><td>Alambre de plata 0,125 mm (registro intracelular)</td><td>WPI</td><td>AGT0525</td><td></td></tr><tr><td>Referencia Ag-AgCl</td><td>Phymep</td><td>E242</td><td></td></tr><tr><td>Alambre de plata 0,25 mm (grabación ECoG)</td><td>WPI</td><td>AGT1025</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de respiración artificial</td><td>Minerve</td><td>Alpha Lab</td><td></td></tr><tr><td>Monitorización de parámetros fisiológicos</td><td>Digicare</td><td>LifeWindow Lite</td><td></td></tr><tr><td>Manta calefactora</td><td>Harvard Apparatus</td><td>507215</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico</td><td>Leica</td><td>M80</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras</td><td>FST</td><td>15005-08</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas Dumont #5</td><td>FST</td><td>11295-10</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas Dumont #5SF</td><td>FST</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>IP Catéter de poliuretano - 0,43x0,69 mm&nbsp; &nbsp;</td><td>Instech</td><td>BTPU-027</td><td></td></tr><tr><td>Elastómero de silicona</td><td>WPI</td><td>KWIK-CAST</td><td></td></tr><tr><td>Taladro dental</td><td>NSK</td><td>Y1001151 y P496</td><td></td></tr><tr><td>Pegamento quirúrgico</td><td>3M</td><td>vetbond</td><td></td></tr></tbody></table>

inducción de un estado isoeléctrico cerebro para investigar el impacto de la actividad endógena sináptica neuronal en la excitabilidad<em&gt; en vivo</em

Induction of an Isoelectric Brain State to Investigate the Impact of Endogenous Synaptic Activity on Neuronal Excitability In Vivo

La información de proceso manera neuronas depende tanto de sus propiedades intrínsecas de membrana y en la dinámica de la red sináptica aferente. En particular la actividad de red generado endógenamente, que varía fuertemente en función del estado de vigilancia, modula significativamente la computación neuronal. Para investigar cómo las diferentes dinámicas cerebrales espontáneas impactan propiedades de integración neuronas individuales &#39;, hemos desarrollado una nueva estrategia experimental en la rata que consiste en la supresión in vivo toda la actividad cerebral por medio de una inyección sistémica de una alta dosis de pentobarbital sódico. actividades corticales, controlados continuamente por electrocorticograma combinado (ECoG) y registros intracelulares se ralentizan progresivamente hacia abajo, lo que lleva a un perfil isoeléctrico estable. Este estado cerebro extrema, poniendo la rata en un estado de coma profundo, se controló cuidadosamente mediante la medición de las constantes fisiológicas del animal a lo largo de los experimentos. r intracelularecordings nos ha permitido caracterizar y comparar las propiedades de integración de la misma neurona integrado en la dinámica cortical fisiológicamente relevantes, tales como las encontradas en el ciclo de sueño-vigilia, y cuando el cerebro estaba totalmente en silencio.

Inducir y mantener un estado cerebral isoeléctrico es un delicado procedimiento experimental in vivo. Se ha demostrado ser una herramienta poderosa para estudiar directamente el impacto de la actividad de la red cortical en la excitabilidad neuronal y función de transferencia 29. La Figura 1 muestra el control de múltiples parámetros, incluyendo ECoG y las constantes vitales, de estado fisiológico del animal antes (Figura 1A ) y despu...

Este procedimiento se realiza de larga duración in vivo registros intracelulares de las neuronas individuales durante los estados cerebrales fisiológicamente relevantes y después de la abolición total de las actividades eléctricas en curso, lo que resulta en un estado cerebral isoeléctrico. Las constantes fisiológicas del animal son monitoreados cuidadosamente durante la transición a la condición comatosa artificial.

Inducción de un estado isoeléctrico cerebro para investigar el impacto de la actividad endógena sináptica neuronal en la excitabilidad<em&gt; En Vivo</em

The way neurons process information depends both on their intrinsic membrane properties and on the dynamics of the afferent synaptic network. In ...

El objetivo general de este protocolo es inducir un estado general de inactividad cerebral in vivo para estudiar las propiedades integradas de neuronas individuales en ausencia de entradas sinápticas. El método que presentamos aquí puede ayudar a responder preguntas clave en neurofisiología, como evaluar el impacto de la actividad de la red sobre el cálculo celular individual o estudiar la respuesta de las neuronas en estados de coma. La principal ventaja de esta técnica es que las propiedades neuronales pueden estudiarse de forma aislada de la red, en una preparación intacta in vivo.Para comenzar este procedimiento, coloque una rata completamente anestesiada sobre una manta térmica. Introduzca una sonda rectal en el animal para mantener la temperatura corporal central alrededor de 37 grados Celsius. Para colocar un catéter en la cavidad peritoneal y facilitar la posterior inyección de agentes anestésicos, primero retire el vello de una pequeña zona en el cuadrante inferior derecho o izquierdo del abdomen utilizando una crema depilatoria.Después de inyectar el anestésico local, esterilice el sitio quirúrgico y realice una incisión de dos a tres milímetros en la piel con tijeras afi

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Inducción de un estado isoeléctrico cerebro para investigar el impacto de la actividad endógena sináptica neuronal en la excitabilidad En Vivo (Video) | JoVE Journal

Inducción de un estado isoeléctrico cerebro para investigar el impacto de la actividad endógena sináptica neuronal en la excitabilidad

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