Establecimiento de editados-Genoma Humano pluripotentes Líneas de Células Madre: De Focalización de Aislamiento

El objetivo general de este procedimiento es la ingeniería genética de células madre pluripotentes humanas utilizando tecnología moderna de edición del genoma. Aunque este procedimiento puede proporcionar información sobre la biología de las células madre, también se puede aplicar para facilitar el modelado de enfermedades humanas en un entorno genéticamente definido. Por lo general, los individuos nuevos en este método necesitarán practicar el aislamiento de colonias antes de volverse competentes.

La demostración visual de este método es esencial, ya que la identificación y la selección de colonias pueden ser difíciles. Comience cultivando células madre pluripotentes humanas en medios hESC en una placa de seis pocillos que contenga mitomicina C, fibroblastos embrionarios de ratón inactivados o células alimentadoras MEF cultivadas en gelatina. Cada día después del recubrimiento, hasta que las hPSC alcancen el 50% de confluencia, use una pipeta de vidrio y aspire para eliminar todo el volumen de medios.

Reemplácelo con tres mililitros de medio hESC tibio por pocillo. Un día antes de la dirección, retire el medio hESC y agregue un medio hESC nuevo precalentado suplementado con 10 micromolares Y-27632. Además, prepare una o dos placas de seis pocillos de celdas alimentadoras de MEF resistentes a los medicamentos de ratones DR4.

El día de la focalización, prepare las soluciones de transvección pipeteando cinco microgramos de plásmido de expresión de nucleasa de dedo de zinc 1 y 2, plásmido de expresión TALON 1 y 2, o 15 microgramos del plásmido codificante CRISPR cas9 px330 en un tubo de un punto cinco mililitros. Agregue 30 microgramos del plásmido donante reparado, seguido de suficiente solución salina tamponada con fosfato 1x para llevar el volumen a 300 microlitros. Inspeccione las células bajo un microscopio para garantizar un 50% de confluencia.

A continuación, utilice una pipeta de vidrio y aspire para eliminar los medios de la placa de hPFC, luego lave las celdas con 2 mililitros de PBS 1x tibio. Después de aspirar el PBS, agregue cero coma cinco milímetros de solución de tripsina-EDTA al 0,25% directamente sobre las células. Coloque en la incubadora de cultivo de tejidos durante aproximadamente 10 minutos, o hasta que la capa del alimentador comience a levantarse de la placa.

Después de la incubación, agregue dos mililitros de medios de lavado ES tibios a cada pocillo para detener la reacción de tripsina. Recoja las celdas de cada pocillo, asegurándose de que las celdas del alimentador se desprendan como una lámina. Pipetear el contenido de cada pocillo en un solo tubo cónico de 50 mililitros, combinando todos los pocillos y triturar las células con una pipeta serológica de 10 mililitros.

Agregue medios de lavado ES para llevar la suspensión celular a 40 mililitros. Espere uno o dos minutos para permitir que los trozos grandes del alimentador se asienten en el fondo del tubo, luego retire el sobrenadante, usando una pipeta serológica, y deposite en un tubo cónico nuevo de 50 mililitros. Después de centrifugar la suspensión celular durante cinco minutos a 190 veces g, aspire el sobrenadante sin alterar la paleta celular.

Resuspender las células en 500 microlitros de 1x pbs. Combine las células resuspendidas con la solución de transección de plasma preparada anteriormente. Pipetear las células y la mezcla de transfección en una cubeta de electroporación de cuatro milímetros y colocarla en hielo durante tres a cinco minutos.

Ajuste los parámetros para el programa exponencial en el sistema de electroporación a 250 voltios, 500 microfaradios, resistencia infinita y tamaño de cubeta de cuatro milímetros. Electropore las celdas y luego vuelva a colocar la cubeta en hielo durante tres minutos. Resuspender las células electroporadas en 18 mililitros de medio hESC caliente, suplementado con 10 micromolares de Y-27632.

Inspeccione los MEFs DR4 bajo un microscopio. Coloque tres mililitros de la suspensión de una sola célula en cada pocillo de una placa de seis pocillos que contenga celdas alimentadoras DR4 y devuélvalas a la incubadora. En el tercer día después del recubrimiento, reemplace los medios en los medios hESC de las celdas sin Y-27632.

Al cuarto día, reemplace los medios no suplementados por medios que contengan el antibiótico de selección adecuado. En este caso se utiliza puromicina. El día antes de la recolección de colonias, prepare una placa de 12 pocillos de celdas alimentadoras de MEF para cada colonia que se va a recoger.

El día 12 después de la siembra, examine la placa bajo un microscopio de disección. Identifique colonias de 800 a 1.200 micras de diámetro que estén listas para ser recogidas. Asegúrese de que esas colonias no contengan células que comiencen a diferenciarse, como la que se muestra aquí.

Además, asegúrese de que las células estén expresando GFP. El día de la recolección, inspeccione los MEF bajo el microscopio para asegurarse de que estén sanos. Retire todos los medios de las placas de las celdas del alimentador MEF y reemplácelos con un mililitro de medio hESC.

Además, cambie el medio hESC en las placas hPSC de seis pocillos que se van a seleccionar. A continuación, extraiga pipetas de vidrio para recoger colonias. Para recoger colonias, primero coloque la placa hPFC en la platina del microscopio de disección en la campana de cultivo de tejidos, ensamble el dispositivo de recolección colocando el extremo de la pipeta de vidrio en el bulbo de succión.

Identifique la colonia que se va a recoger y coloque la punta de la pipeta de vidrio extraída sobre la colonia. Luego, comprima el bulbo del dispositivo de recolección para extirpar suavemente y cortar una colonia individual en 10 a 20 piezas del mismo tamaño. A continuación, introduzca los trozos de colonia extirpados en la pipeta soltando la pera.

Trate de tomar la menor cantidad de medios posible mientras transfiere. Comprima el bulbo para transferir la colonia ahora rota directamente a un pocillo de una placa de celda alimentadora MEF de 12 pocillos. Etiquete cada pocillo para permitir la identificación única de los clones derivados de una sola célula.

Cambie la pipeta de vidrio y repita el procedimiento para la siguiente colonia. Regrese las placas a la incubadora y muévalas suavemente para dispersar las células en el pocillo. Al día siguiente, retire todo el volumen de los medios y reemplácelos por un punto cinco mililitros de medios hESC calientes.

Repita durante 10 a 12 días hasta que las células estén 50% confluentes. Después de 10 a 12 días, inspeccione las hESC bajo el endoscopio. Elija una o dos colonias de cada pocillo y transfiéralas a las nuevas placas de celdas alimentadoras de MEF de 12 pocillos para generar una placa réplica.

Extraiga el ADN de las colonias restantes en cada pocillo de las placas originales para su genotipado por PCR o Southern blot. Weber: Tres células madre embrionarias humanas se dirigieron al locus AAVS1 utilizando nucleasas específicas del sitio y una plantilla de reparación para introducir un reportero EFFP y un casete de resistencia a la puromicina. Estas imágenes representativas muestran colonias editadas con nucleasas de dedos de zinc, TALEN y CRISPR/Cas9.

Estos resultados representativos del genotipado de PCR muestran clones dirigidos no dirigidos, heterocigotos y homocigotos que utilizan nucleasas de dedos de zinc, TALEN y CRISPR/Cas9 junto con un control de tipo salvaje. Esta tabla muestra las integraciones verificadas por PCR en el locus AAVS1 para cada nucleasa específica del sitio en este experimento, en comparación con las integraciones individuales adecuadas verificadas por Southern Blot en experimentos anteriores. CRISPR-Cas9 produjo los clones más correctamente dirigidos, mientras que la plataforma TALEN tuvo los clones más homocigóricamente dirigidos.

Una vez dominada, esta técnica requiere entre tres y cinco horas de tiempo de práctica, y puede obtener células editadas dentro de aproximadamente tres semanas después de comenzar los experimentos. Es muy importante con esta técnica trabajar de forma segura y utilizar una técnica estéril en todo momento. Después de la manipulación genética, se puede ver cómo afecta a otros tipos de células mediante el uso de la diferenciación de células madre en otros tipos de células, como las neuronas.

El desarrollo de este protocolo allanó el camino para que los investigadores utilizaran la edición del genoma en células madre pluripotentes humanas para establecer modelos de enfermedad in vitro. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo editar el genoma en células madre pluripotentes humanas.