La migración de células T CD4 obtener imágenes intersticial en la dermis inflamadas

El objetivo general de este protocolo de imagen es visualizar la dinámica de las células T positivas para CD4 en la piel inflamada. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la inmunología, como, ¿cuáles son los mecanismos que subyacen a la motilidad y función de las células inmunitarias en tejidos inflamados? La principal ventaja de esta técnica es que proporciona una manera mínimamente invasiva de estudiar el comportamiento dinámico de las células T CD4 in situ.

La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos para preparar la oreja para la obtención de imágenes son difíciles de aprender, y es necesario un posicionamiento adecuado de la oreja para capturar imágenes de alta calidad. Soy Alison Gaylo, estudiante de posgrado, y realizaré la demostración de este protocolo. Comience aspirando 300 microlitros de suspensión de linfocitos T efector marcados con fluorescencia por ratón en una jeringa equipada con una aguja de calibre 27 y medio.

Luego, gire la jeringa con la aguja hacia arriba y golpee suavemente el cuerpo de la jeringa, moviendo el émbolo hacia arriba y hacia abajo según sea necesario para eliminar cualquier burbuja. Cuando las células estén listas, transfiera los ratones a una jaula limpia y colóquelos bajo una lámpara de calor hasta que las venas de la cola se vasodilaten. A continuación, transfiera el primer ratón al sujetador, y limpie la cola con un hisopo de alcohol.

Después de identificar una vena lateral de la cola, inyecte lentamente 200 microlitros de células en la vena. Cuando todas las células hayan sido transferidas, aspire 50 microlitros de emulsión completa de fluoresceína en una jeringa de insulina de calibre 28 y medio, y presione firmemente el émbolo para eliminar cualquier burbuja de aire grande. Luego, coloque un dedal en el dedo índice izquierdo y sostenga cuidadosamente la oreja del ratón entre el pulgar izquierdo y el dedal, con la oreja en posición ventral hacia arriba.

Luego deslice la aguja, con el bisel hacia arriba, dentro de la dermis en el tercio externo de la pabellón auricular, y ligeramente fuera del centro, e inyecte lentamente diez microlitros de emulsión en el tejido. Después de inyectar a todos los animales, supervise a los ratones hasta que se recuperen completamente. Tres días después de la inmunización, vasodilata las venas de la cola de los animales inyectados tal como se acaba de demostrar.

Después de anestesiar, inmovilice la cola del primer ratón con un par de pinzas. Limpie la cola con un hisopo de alcohol y luego deslice cuidadosamente un catéter con aguja de calibre 30 y medio dentro de una vena lateral de la cola, verificando la permeabilidad mediante una ligera presión sobre el émbolo de la jeringa. Una vez que el catéter esté en su lugar, aplique una o dos gotas de adhesivo tisular de cianoacrilato en el sitio de inyección y deje que el adhesivo se seque durante aproximadamente 30 segundos.

Luego, use tijeras para recortar cuidadosamente los bigotes y el pelo de la parte posterior y los laterales de la oreja. A continuación, use un hisopo para humedecer la superficie interna de la oreja con PBS. Luego, gire el ratón y aplane la oreja inyectada sobre una cubreobjetos de vidrio de 24 por 50 milímetros, número uno punto cinco, hasta que quede al ras con el vidrio.

Elimine el exceso de PBS. Luego, use dos pares de pinzas curvas para sujetar un trozo de cinta adhesiva de tela de aproximadamente 20 milímetros de largo longitudinalmente por las esquinas superiores, y coloque la parte inferior de la cinta sobre la laminilla en la parte superior de la oreja del ratón. Enrolle la cinta sobre el resto de la oreja, apartando el exceso de pelo con las pinzas según sea necesario, y utilice un hisopo seco para presionar suavemente la cinta alrededor de la oreja y asegurar un sello hermético, teniendo cuidado de no presionar directamente sobre la oreja.

Es esencial que la oreja esté sujetada con cinta adhesiva a la cubreobjetos, con un buen sellado en ambos lados y con el mínimo número de burbujas de aire, ya que esto afectará la calidad de las imágenes que se puedan obtener. Ahora sujete con cinta adhesiva una plataforma de imagen fluorescente para microscopio a un bloque calefactor de 37 grados Celsius y aplique grasa al vacío en ambos lados de la zona de la oreja de la plataforma. Gire el ratón para colocar la cubreobjetos sobre la plataforma, teniendo cuidado de alinear la oreja en el centro del fieltro.

Cuando el oído esté en su lugar, coloque firmemente el cono nasal de isoflurano en el soporte sobre la plataforma, asegurándose de que el cono quede fijo y cubra completamente la nariz del ratón. Luego, utilice un hisopo de algodón para presionar con firmeza, pero con cuidado, la laminilla sobre la plataforma de imagen, extendiendo la grasa al vacío debajo de la laminilla. Envuelva dos trozos de cinta de 20 milímetros y dos trozos más largos alrededor de la parte superior de la plataforma para fijar la laminilla a la plataforma.

A continuación, traslade el ratón a la platina del microscopio. Sujete la plataforma con más cinta y aplique una doble capa de grasa de vacío sobre el cubreobjetos alrededor de la oreja. Luego, envuelva al ratón con una manta térmica llena de agua y llene el depósito de grasa de vacío con agua destilada a 37 grados Celsius.

Para la adquisición de imágenes en vivo con lapso de tiempo, comience colocando el objetivo sobre el centro de la oreja y bajando el objetivo hasta que apenas toque la superficie del agua en el depósito. A continuación, utilizando una fuente de luz externa, baje lentamente el objetivo hasta que la superficie de la oreja entre en enfoque. Luego, baje las cortinas interna y externa alrededor de la platina del microscopio y ajuste la longitud de onda del láser a 900 nanómetros en la ventana del controlador del láser de dos fotones, la potencia del láser en la ventana de configuración de adquisición del láser y los voltajes del PMT en la ventana de control de adquisición de imágenes.

En las ventanas de configuración de tamaño y modo de adquisición, configure el microscopio a una resolución de cinco doce por cinco doce píxeles, con un tiempo de permanencia de dos microsegundos por píxel, y seleccione repetición XY para activar un modo de imagen en vivo para escanear a través del tejido. Una vez localizado un campo de imagen adecuado, localice la célula más alta en la dermis y haga clic en el botón establecer cero para fijar la posición Z en cero. Desplácese hacia abajo en la dirección Z para medir la profundidad de la célula.

Luego, establezca las posiciones inicial y final en la ventana de configuración de adquisición del microscopio, y ajuste los voltajes del PMT y la potencia del láser en la ventana Z brillante para optimizar la visualización de las células a lo largo de la profundidad del campo de imagen. Verifique los botones de profundidad y tiempo, y configure un filtro común para escanear la imagen tres veces por línea en la ventana de modo de control de adquisición de imagen. Ajuste la profundidad de corte en Z en la ventana de adquisición de imagen del microscopio de modo que se tarde aproximadamente un minuto en capturar una pila completa, como se indica en la ventana de vista de tiempo.

Luego, para evaluar la estabilidad del tejido, configure el número de repeticiones en cinco en la ventana de configuración de adquisición de escaneo temporal y haga clic en el botón de escaneo para capturar una imagen de lapso de tiempo de cinco minutos del área. Si el tejido es estable después de cinco minutos, establezca el número de repeticiones entre 30 y 45 en la ventana de configuración de adquisición de escaneo temporal y registre una imagen de lapso de tiempo de 30 a 45 minutos, vigilando cualquier desplazamiento menor del tejido mientras se adquiere la imagen. Guarde la imagen previa al anticuerpo en el formato adecuado y luego aspire la mezcla de anticuerpos en una jeringa tuberculínica de un mililitro, teniendo cuidado de eliminar todas las burbujas de aire.

Presione suavemente el émbolo para que la solución de anticuerpos forme una gota en la punta de la aguja, y levante las cortinas alrededor del estadio para localizar el catéter. Sustituya la jeringa de PBS por la jeringa con anticuerpos, y luego inyecte lentamente los anticuerpos en el catéter. Una vez que los anticuerpos hayan sido inyectados con éxito, vuelva a bajar las cortinas y anote la hora de la inyección.

Luego, comience inmediatamente a recopilar una nueva secuencia de imágenes de 20 a 40 minutos, en la misma ubicación y utilizando los mismos ajustes del instrumento que en la imagen previa al anticuerpo. Finalmente, guarde el archivo de imagen posterior al anticuerpo en el formato adecuado y retire cuidadosamente al ratón de la platina del microscopio, monitoreando al animal hasta que se recupere completamente. El análisis de la dermis auricular intacta mediante este protocolo facilita la obtención de imágenes de alta resolución y de lapsos de tiempo de la dinámica de las células T efectoras en la dermis inflamada.

En este video, pueden observarse las células T efectoras verdes transferidas adoptivamente moviéndose a través del tejido dérmico. Sin embargo, tras la administración de anticuerpos bloqueantes de integrina anti-beta uno y anti-beta tres mediante el catéter, las células previamente móviles se detienen dentro de la dermis. Las células muestran una velocidad media disminuida tras la administración de los anticuerpos, así como una reducción significativa en su índice de meandricidad.

Es decir, la razón entre el desplazamiento total y la longitud total de la trayectoria. Las autofluorescencias de los folículos pilosos, las sombras y autofluorescencias del pelo superpuesto, así como las burbujas de aire atrapadas entre la superficie de la oreja y la lámina de cubierta, pueden generar artefactos de imagen que dificultan la visualización de las células T e interfieren con el software automatizado de análisis de imágenes. Además, el uso de múltiples fuentes de calor puede provocar problemas de estabilidad del tejido, lo que produce grandes oscilaciones durante la adquisición de imágenes y dificulta la interpretación de los resultados.

Una vez dominada, la obtención de imágenes de las células T CD4 en la dermis puede completarse en dos o tres horas, si el procedimiento se ha realizado correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar seguir las pautas adecuadas de cuidado y uso de animales para trabajar con ratones. Este procedimiento puede adaptarse para visualizar otros subconjuntos de células T u otros tipos de células inmunitarias en la oreja, utilizando diferentes modelos de infección o diferentes métodos para inducir inflamación.

Después de su desarrollo, la imagenología intravital allanó el camino para que los investigadores en el campo de la inmunología exploraran la dinámica de las respuestas inmunitarias en curso en animales vivos. No olvide que trabajar con un láser multifósforo puede ser extremadamente peligroso y que siempre se deben tomar precauciones, como un blindaje adecuado, durante la realización de este procedimiento. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo inducir inflamación en la dermis de la oreja de un ratón y de cómo utilizar la imagenología intravital para capturar imágenes de lapso de tiempo de la actividad de las células T CD4 antes y después de la administración de anticuerpos.