Name: Evaluación del huso meiótico en ovocitos de ratón por silenciamiento siRNA mediada (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Aprende a evaluar el ensamblaje del huso meiótico en ovocitos de ratón mediante silenciamiento siRNA e inmunofluorescencia. Este método permite estudiar la segregación cromosómica y los mecanismos de aneuploidía en biología reproductiva.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Esta investigación fue apoyada en parte por la Universidad de Georgia, y una subvención (HD071330) de los Institutos Nacionales de Salud para MMV.

Este protocolo fue aprobado por el Cuidado y Uso de Animales Comité Institucional (IACUC) de la Universidad de Georgia. 1. Preparativos <ol><li> Para el cultivo de los ovocitos, compra o recién preparar Medio Esencial Mínimo (MEM) y complementar con 3 mg / ml de albúmina de suero bovino (BSA) como se indica en la Tabla 1. Coloque una botella de poliestireno en un equilibrio de carga (tara a cero). Añadir todos los reactivos, excepto BSA, en orden y que aparezca el volumen final con MQ-agua en peso a un total de 250 g. A continuación, agregue la BSA, deje que se disuelva y esterilizar filtro. Nota: El medio MEM descrito requiere de equilibración y la incubación de células con una mezcla de gases médica de 5% de CO 2, 5% O 2 y 90% N 2. Sin embargo, otros medios de comunicación (por ejemplo, CZB) se pueden usar que permiten la incubación de las células en 5% de CO 2 en condiciones atmosféricas. </li><li> Para la microinyección de ovocitos, comprar o preparar medio M2. </li><li> Preparar pgonadotropina de suero de yegua reinante (PMSG) a una concentración de 5 UI / 100 l. </li><li> Compra y reconstituir las reservas siRNA a una concentración de trabajo de 1 mM. </li></ol> 2. ratón ovocitos Colección <ol><li> DÍA 1: Para estimular el desarrollo del folículo ovárico y aumentar el número de folículos pre-ovulatorios, administrar 5 UI de PMSG por vía intraperitoneal a ratones hembra de 48 horas antes de la recolección de los ovocitos. </li><li> DÍA 3: Para la recolección de los ovocitos y la cultura, estableció placas de cultivo de 35 mm con 3 ml de MEM / BSA suplementado con 1 mg / ml milrinona. Este inhibidor de la fosfodiesterasa mantiene los ovocitos en profase I arreste y evita la ruptura de la vesícula germinal (GVBD). Equilibrar las placas de cultivo en una mezcla de gases médica durante al menos 15 min. Se requiere Milrinona medio suplementado en toda la colección de ovocitos, así como la microinyección de ovocitos y el 24 horas de retención cultura período posterior siRNA: Nota. </li><li> Recuperar los ovarios de los ratones hembra utilizando laboratorio establecido prácticas 15 y traslado a una nueva placa de cultivo con pre-calentado y se equilibró MEM / BSA / milrinona. </li><li> Coloque la placa de cultivo en el escenario de un microscopio estereoscópico para la recolección de los ovocitos. Lanzamiento de cúmulo-ovocito complejos (COC de) perforando manualmente los folículos antrales con 27 G agujas. Fijar un ovario a la parte inferior de la placa de cultivo, con una aguja de 27 G unida a una jeringa de 1 ml, y utilizar una segunda aguja para perforar todos los folículos grandes. Repita el procedimiento para cada ovario. </li><li> Usando procedimientos boca pipeteo estándar u otros medios de aspiración de ovocitos, recoger todos los ovocitos que están rodeados por 2 o más capas de células del cumulus compactos. Transferir el COC de un nuevo plato y se incuba a 37 ° C durante 1 hora. </li><li> Retire con cuidado las células del cumulus que rodean por repetido pipeteo suave con una pipeta 1 ml ajustado a un volumen de aspiración de 750 l. Repita el paso de pipeteo cerca de 12 vecesy permitir que los ovocitos se recuperen durante 5 min. Continúe de esta manera hasta que todos o la mayoría de las células del cúmulo se han eliminado. La transferencia de los ovocitos denudados a otra placa de cultivo y permitir que se equilibre a 37 ° C durante 15 minutos. </li><li> Asignar los ovocitos denudados en tres grupos experimentales que se utilizarán para: (i) la microinyección de siRNAs específicos contra el blanco de interés, (ii) la microinyección de (control) siRNAs inespecíficos, y (iii) un grupo no inyectada de control para tener en cuenta condiciones de cultivo. </li></ol> 3. La microinyección de ovocitos <ol><li> Establecer placas de cultivo con 3 ml de medio M2 suplementado con milrinona (1 mg / ml) para la microinyección de ovocitos. Preparar placas de cultivo que contenían MEM / BSA / milrinona para el lavado y la posterior cultura de ovocitos inyectados. Nota: medio M2 contiene HEPES tampón y requiere pre-calentamiento a 37 ° C durante 15 minutos en condiciones atmosféricas. MEM requiere pre-calentamiento y el equilibrio usando gases medicinales como describird arriba. </li><li> Prepare el sistema de microinyección. Cargue la aguja de inyección con 5 l de solución de siRNA 1 M. Asegure la pipeta de sujeción y la aguja de inyección para micromanipuladores del sistema de microinyección y configurar la unidad de inyección con el volumen y la presión calibrada. </li><li> Coloque un 200 l micro-gota de medios M2 en el interior de la tapa de una placa de cultivo de 3 cm y añadir un ovocito para configurar y alineación del sistema de microinyección. </li><li> Utilizando el ovocito como guía, ajuste las posiciones de la explotación y de inyección de agujas. Aplicar presión negativa a la pipeta de sujeción para fijar suavemente el ovocito y ajustar la posición de la aguja de inyección con el diámetro más ancho de la célula. Ajustar la configuración para permitir que la microinyección de aproximadamente 10 pl de la solución de siRNA en cualquier lugar en el citoplasma del ovocito. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53586/53586fig1.jpg" /> Figura 1. ovocitos microinyección creó. ( <strong&gt; A) imagen representativa de una micro-200 l gota de medios de comunicación M2 colocado en la tapa de una placa de cultivo de 3 cm, con la aguja de sujeción de la pipeta y la inyección colocado a la izquierda y derecha, respectivamente. (B) Grupo de la profase I arrestado ovocitos (GV-etapa) antes de la microinyección. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53586/53586fig1large.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> </li><li> Devuelva la tapa para la etapa de microscopio estereoscópico y añadir un 200 l micro-gota de medios M2 fresco. Añadir un grupo de ovocitos (~ 10) a la micro-gota mediante pipeteo boca, o métodos alternativos, a continuación, devolver la tapa con micro-gota a la etapa de microinyección. <ol><li> Proceda a microinyectar los ovocitos individuales. Asegurar un ovocito con la pipeta tenencia, introduzca lentamente la punta de la aguja de inyección en el citoplasma y expulsar el volumen de inyección de la solución de siRNA. Retraer con cuidado la aguja de inyección y move el oocito inyectado a una posición en la parte inferior de la micro-drop. Mueva ovocitos inyectados, sin éxito, a una posición en la parte superior de la micro-drop. </li><li> Repita el procedimiento de microinyección con cada ovocito. Para mantener la viabilidad de oocitos óptima, microinyectar sólo un pequeño número de ovocitos a la vez. Asegúrese de que este proceso no toma más de unos pocos minutos para evitar que la temperatura y pH cambios en la micro-drop. </li></ol></li><li> Aspirar inyecta éxito ovocitos o mover con cuidado la tapa con el micro-gota de ovocitos inyectados con el microscopio estereoscópico. La transferencia de los ovocitos viables inyectados con la pipeta boca o métodos alternativos, al MEM / BSA medio / milrinona de lavar y equilibrar a 37 ° C. </li><li> El uso de otro grupo de ovocitos, repita el proceso de microinyección con una nueva aguja de inyección cargado con siRNAs no específicos para el grupo de control. Lave los ovocitos en MEM / BSA / milrinona y traslado a una placa de cultivo separado. </li><li> Cultura todos los grupos deovocitos durante 24 horas en MEM / BSA / milrinona a 37 ° C en una atmósfera de gas médico. Nota: Se necesita el periodo de cultivo &#39;bloque milrinona&#39; para la meta eficiente agotamiento ARNm / proteína. </li></ol> 4. ovocitos de la cultura para la maduración meiótica <ol><li> DÍA 4: Para cada grupo experimental de ovocitos configuración 4 placas de cultivo (35 mm) con 3 ml de MEM / BSA. Suplemento un plato medios por grupo con 10% de suero bovino fetal (de alta calidad) (FBS) a utilizar para la maduración de ovocitos. Permitir que todos los platos de cultivo se equilibren a 37 ° C con la mezcla de gases medicinales. </li><li> Para liberar ovocitos de &quot;bloque milrinona &#39;, secuencialmente lavar los ovocitos tres veces en platos que contienen MEM / BSA y luego transferir los ovocitos al plato que contiene la maduración de medios con 10% de FBS. Cultura todos los grupos de ovocitos de 17 horas a 37 ° C, para permitir la reanudación y la progresión de la meiosis. </li><li> DÍA 5: Preparar soluciones para fixa ovocitoción, incluyendo: (i) 4% de paraformaldehído (PFA) en tampón PEM (TUBOS 100 mM [pH 6,9], 1 mM de MgCl 2, 1 mM EGTA) con 0,5% de Triton-X 100, y (ii) PBS suplementado con 5 % de FBS que se utilizarán para lavar y bloquear los ovocitos. Nota: Estas soluciones requieren pre-calentamiento a 37 ° C antes de la fijación de los ovocitos. </li><li> Para la fijación de los ovocitos (después del cultivo 17 hr), con rapidez transferir cada grupo experimental de los oocitos mediante pipeteado boca o métodos alternativos en los pocillos individuales (de un plato de 4 pocillos) que contiene 750 l de pre-calentado solución PFA 4% y se incuba a 37 ° C durante 1 hora. Posteriormente lavar cada grupo de ovocitos 3 veces (15 min cada uno) en 750 l de PBS precalentado que contienen 5% de FBS. </li><li> Ovocitos bloque en 200 l de PBS / 5% de FBS O / N a 4 ° C para minimizar la unión inespecífica del anticuerpo. </li></ol> Análisis 5. Inmunofluorescencia <ol><li> DÍA 6: Nota: La inmunotinción se realiza en una placa multi-pocillo y la OOCytes se transfieren en serie a los pocillos secuenciales, que contiene respectivas soluciones de anticuerpos y de lavado. Cualquiera de 48 o 96 pocillos placas se pueden usar, simplemente ajustar el volumen de la solución basada en el tamaño también. Para placas de 96 pocillos utilizar 200 l por pocillo. Los ovocitos se transfieren a las diferentes soluciones en el orden siguiente: solución de anticuerpo primario - 3 pozos de lavado - solución de anticuerpo secundario - 3 pozos de lavado. Para limitar exposición a la luz de la placa se puede cubrir con papel de aluminio. Preparar fresco PBS / 5% de FBS y utilizar esta solución para preparar diluciones de anticuerpos (por ejemplo, conejo anti-pericentrina (1 / 1.000), ratón anti-tubulina (1 / 1.000)). </li><li> La transferencia de los ovocitos fijos de cada grupo experimental a los pocillos individuales que contienen 200 l (o 100 l, si se desea menos volumen) de la solución de anticuerpo primario y tapar el pozo con parafilm. Incubar acuerdo con las condiciones óptimas de anticuerpo específico (por ejemplo, 37 ° C durante 1 hr, o 4 ° CO / N). Nota: El anticuerpo primario dilution así como el tiempo de incubación y la temperatura específica requieren pruebas para determinar las condiciones óptimas para diferentes anticuerpos utilizados. </li><li> Después de la incubación con el anticuerpo primario, se lavan los ovocitos tres veces en PBS / FBS al 5% (10-15 min cada uno). </li><li> La transferencia de los ovocitos en la solución que contiene anticuerpos secundarios conjugados con fluorescencia (por ejemplo, 1 / 1.000 de dilución de anticuerpos anti-conejo y anti-ratón conjugado con fluorocromos de diferentes longitudes de onda). Incubar durante 1 hora a 37 ° C. </li><li> Lavar los ovocitos tres veces en PBS / FBS al 5% (10 - 15 min cada uno). </li><li> Tras la etapa de lavado final, la transferencia de los ovocitos en un portaobjetos de vidrio limpio y suavemente aspirar cualquier exceso de solución de lavado. Esto inmovilizar los ovocitos en la superficie de vidrio. Añadir 8 l de los medios de comunicación (que contiene DAPI) montaje y superponer cuidadosamente los medios de montaje con un 22 mm x 22 mm cubreobjetos. Baje el cubreobjetos lentamente para evitar atrapar burbujas de aire y / o dañar los ovocitos. Nota: Como alternativa, para mantener las propiedades 3-dimensionales de los ovocitos para el análisis de microscopía confocal, añadir un pequeño volumen de 100 cuentas de vidrio micras (mezclado con vaselina) a las esquinas de la hoja de la cubierta antes de montar en la diapositiva. </li><li> Diapositivas se almacenan a 4 ° C, o proceder a la evaluación de la progresión meiótica, así como el análisis de los niveles de expresión y localización subcelular de proteínas utilizando un microscopio de fluorescencia equipado con los filtros necesarios para que coincida con los anticuerpos secundarios utilizados. </li></ol>

<ol><li>Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+aneuploidy%3A+mechanisms+and+new+insights+into+an+age-old+problem%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem.</a> Nat Rev Genet. 13 (7), 493-504 (2012).</li>
<li>Hassold, T. J., Hunt, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((To+err+%28meiotically%29+is+human%3A+the+genesis+of+human+aneuploidy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy.</a> Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).</li>
<li>Szollosi, D., Calarco, P., Donahue, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absence+of+Centrioles+in+the+First+and+Second+Meiotic+Spindles+of+Mouse+Oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Absence of Centrioles in the First and Second Meiotic Spindles of Mouse Oocytes.</a> J Cell Sci. 11 (2), 521-541 (1972).</li>
<li>Manandhar, G., Schatten, H., Sutovsky, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrosome+Reduction+During+Gametogenesis+and+Its+Significance%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Centrosome Reduction During Gametogenesis and Its Significance.</a> Biol Reprod. 72 (1), 2-13 (2005).</li>
<li>Zimmerman, W. C., Sillibourne, J., Rosa, J., Doxsey, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitosis-specific+anchoring+of+gamma+tubulin+complexes+by+pericentrin+controls+spindle+organization+and+mitotic+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitosis-specific anchoring of gamma tubulin complexes by pericentrin controls spindle organization and mitotic entry.</a> Mol Biol Cell. 15 (8), 3642-3647 (2004).</li>
<li>Ma, W., Baumann, C., Viveiros, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NEDD1+is+crucial+for+meiotic+spindle+stabilty+and+accurate+chromosome+segregation+in+mammalian+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">NEDD1 is crucial for meiotic spindle stabilty and accurate chromosome segregation in mammalian oocytes.</a> Dev Biol. 339 (439-450), (2010).</li>
<li>Ma, W., Viveiros, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+pericentrin+in+mouse+oocytes+disrupts+microtubule+organizing+center+function+and+meiotic+spindle+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Reprod+Dev%22%5BJournal%5D)">Depletion of pericentrin in mouse oocytes disrupts microtubule organizing center function and meiotic spindle organization.</a> Mol Reprod Dev. 81 (11), 1019-1029 (2014).</li>
<li>Bouniol-Baly, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Transcriptional+Activity+Associated+with+Chromatin+Configuration+in+Fully+Grown+Mouse+Germinal+Vesicle+Oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Differential Transcriptional Activity Associated with Chromatin Configuration in Fully Grown Mouse Germinal Vesicle Oocytes.</a> Biol Reprod. 60 (3), 580-587 (1999).</li>
<li>De La Fuente, R., Eppig, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+Activity+of+the+Mouse+Oocyte+Genome%3A+Companion+Granulosa+Cells+Modulate+Transcription+and+Chromatin+Remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional Activity of the Mouse Oocyte Genome: Companion Granulosa Cells Modulate Transcription and Chromatin Remodeling.</a> Dev Biol. 229 (1), 224-236 (2001).</li>
<li>Hodgman, R., Tay, J., Mendez, R., Richter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CPEB+phosphorylation+and+cytoplasmic+polyadenylation+are+catalyzed+by+the+kinase+IAK1%2FEg2+in+maturing+mouse+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">CPEB phosphorylation and cytoplasmic polyadenylation are catalyzed by the kinase IAK1/Eg2 in maturing mouse oocytes.</a> Development. 128 (14), 2815-2822 (2001).</li>
<li>De La Fuente, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+modifications+in+the+germinal+vesicle+%28GV%29+of+mammalian+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Chromatin modifications in the germinal vesicle (GV) of mammalian oocytes.</a> Dev Biol. 292 (1), 1-12 (2006).</li>
<li>Wianny, F., Zernicka-Goetz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+interference+with+gene+function+by+double-stranded+RNA+in+early+mouse+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Specific interference with gene function by double-stranded RNA in early mouse development.</a> Nat Cell Biol. , 270-275 (2000).</li>
<li>Svoboda, P., Stein, P., Hayashi, H., Schultz, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+reduction+of+dormant+maternal+mRNAs+in+mouse+oocytes+by+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Selective reduction of dormant maternal mRNAs in mouse oocytes by RNA interference.</a> Development. 127 (19), 4147-4156 (2000).</li>
<li>Svoboda, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renaissance+of+mammalian+endogenous+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Renaissance of mammalian endogenous RNAi.</a> FEBS Letters. 588 (15), 2550-2556 (1016).</li>
<li>Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBehringer%2C+R+%22Manipulating+the+Mouse+Embryo%3A+A+Laboratory+Manual%22">Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual</a>. , Fourth Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2014).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar

Si bien hay varios métodos para la transferencia de ácido nucleico exógeno en las células somáticas, tales como la electroporación y la transfección, microinyección es el método óptimo para la entrega de moléculas de RNA en oocitos de ratón transcripcionalmente quiescentes. El protocolo actual ofrece un enfoque eficaz para el agotamiento in vitro de ARNm específicos que permiten a las pruebas funcionales de diferente huso y / o factores MTOC asociada en ovocitos. Este enfoque se traduce en el agotamiento de la ...

La meiosis es un proceso de división único que ocurre en gametos (ovocitos y espermatozoides) y consiste en dos divisiones sucesivas sin intervenir la síntesis de ADN para segregar los cromosomas homólogos y cromátidas hermanas durante la meiosis I y meiosis II, respectivamente 1. Los errores en la segregación cromosómica durante la división meiótica en ovocitos pueden dar lugar a aneuploidía, que se hereda por el embrión durante la fertilización. En particular, la incidencia de la aneuploidía en embriones en desarrollo aumenta con el avance de la edad materna y es una causa importante de defectos congénitos, así como la pérdida del embarazo en mujeres 1,2, por lo tanto, lo que subraya una importante necesidad de comprender la base molecular de la aneuploidía durante la división meiótica . Durante la división celular, la segregación cromosómica depende crucialmente de montaje del huso mitótico microtúbulos y el establecimiento de interacciones del cromosoma microtúbulos estables para el correcto apego a husillo opuestopolos. Es importante destacar que la formación del huso meiótico en ovocitos de mamíferos difiere de la mitosis en las células somáticas, y está regulado por los centros de organización de microtúbulos (COMT) únicas que carecen de centriolos 3,4. Proteínas esenciales necesarios para la nucleación de microtúbulos y organización localizar a COMT ovocitos, incluyendo γ-tubulina que cataliza ensamblaje de los microtúbulos. Además, pericentrina funciona como un andamio de proteínas esenciales, que se une y anclajes gamma-tubulina, así como otros factores en COMT 5. En particular, nuestros estudios demuestran que el agotamiento de las proteínas asociadas-MTOC clave interrumpe organización huso meiótico y conduce a errores en la segregación cromosómica ovocitos, que no se resuelven por completo por el punto de control de ensamblaje del huso (SAC) 6,7. Por lo tanto, los defectos en la estabilidad del huso, que no provocan la detención meiótica, plantean un riesgo significativo para contribuir a la aneuploidía. A pesar de su papel esencial en el montaje y organización del huso, prot MTOC ovocitocomposición y función ein sigue siendo poco conocida. Prueba de la función de las proteínas diana específicas en ovocitos de mamíferos es un reto, ya que las células se vuelven transcripcionalmente inactiva poco antes de la reanudación de la meiosis 8,9. Por lo tanto, los ovocitos pre-ovulatorios se basan en tiendas de mRNA maternos para reanudar la meiosis y apoyan la división meiótica, así como las primeras divisiones de escisión después de la fertilización 10,11. La eficacia de la interferencia de ARN (RNAi) mediada por la degradación de transcritos de ARNm en ovocitos de mamíferos está bien establecido y RNAs maternas reclutados para la traducción durante la maduración meiótica son particularmente susceptibles de siRNA dirigidos 12-14. Por lo tanto, la microinyección de RNAs de interferencia cortos (siRNAs) en oocitos proporciona un enfoque valioso para agotar los ARNm diana para el ensayo funcional. A continuación, describimos los métodos para el aislamiento de los ovocitos de ratón y el agotamiento de siRNA mediada por transcri específicapts para probar la función de una proteína esencial asociada a MTOC, pericentrina. Además, se describen condiciones de análisis de inmunofluorescencia para evaluar la formación del huso meiótico en ovocitos.

<table><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><reactivos fuertes></fuertes></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gonadotropina sérica de yegua embarazada (PMSG)</td><td>EMD Biosciences</td><td>367222</td><td></td></tr><tr><td>Medio esencial mínimo (MEM)</td><td></td><td></td><td>*Receta descrita en la Tabla 1</td></tr><tr><td>Solución salina equilibrada de Earle's (10x)</td><td>Sigma</td><td>E-7510</td><td></td></tr><tr><td>Sodio Bicarbonato</td><td>Sigma</td><td>S-5761</td><td></td></tr><tr><td>Ácido pirúvico, sal sódica&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P-5280</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina G, sal de potasio&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P-7794</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de estreptomicina&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S-9137</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G-8540</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, sal disódica dihidratada&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>E-4884</td><td></td></tr><tr><td>Aminoácidos Esenciales (50x)</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>11130-051</td><td></td></tr><tr><td>MEM Mezcla de Vitaminas (100x)</td><td>Sigma</td><td>M-6895</td><td></td></tr><tr><td>Solución de Rojo de Fenol</td><td>Sigma</td><td>P-0290</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina Suero Bovino (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A1470</td><td></td></tr><tr><td>Milrinona</td><td>Sigma</td><td>M4659</td><td></td></tr><tr><td>Suero Fetal Bovino (FBS)</td><td>Hyclone</td><td>SH30070.01</td><td></td></tr><tr><td>EmbryoMax M2 Media con Hepes</td><td>EMD Millipore</td><td>MR-015-D</td><td></td></tr><tr><td>siRNAs dirigidos a Pericentrin</td><td>Qiagen</td><td>GS18541</td><td></td></tr><tr><td>siRNAs de control negativo&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>SI03650318</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído (solución al 16%)</td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Sigma</td><td>T-8787</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Hyclone</td><td>SH30028.02</td><td></td></tr><tr><td>Anti-pericentrina (conejo)</td><td>Covance</td><td>PRB-432C</td><td></td></tr><tr><td>A-tubulina antiacetilada (ratón)</td><td>Sigma</td><td>T-6793</td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti-rabbbit Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-21430</td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti-ratón Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>A-11017</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Equipo principal</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico (SMZ 800)</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vertical Fluorescente Microscopio</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio invertido</td><td>Nikon&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema de microinyecciones Femtojet</td><td>Manipuladores Eppenforf</td><td></td><td></td></tr> Micro <tr><td>Agujas de microinyección</td><td></td><td></td> Eppendorf (femtotips)Pipetas de sujeción 930000035 <td></td>Eppendorf</tr><tr><td>(VacuTip)</td><td>Eppendorf</td><td>930001015</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td>Plasticware</td><td></td></tr><tr><td>Placas</td> de cultivo de ><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>35 mm</td><td>Corning Life Sciences</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>placas de 4 pocillos</td><td>Thermo Scientific</td><td>176740</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 96 pocillos</td><td>Corning Life Sciences</td><td>3367</td><td></td></tr><tr><td>0,45 mm Sistema de filtro CA</td><td>Corning Life Sciences</td><td>430768</td><td></td></tr></tbody></table>

evaluación del huso meiótico en ovocitos de ratón por silenciamiento sirna mediada

Meiotic Spindle Assessment in Mouse Oocytes by siRNA-mediated Silencing

Los errores en la segregación cromosómica durante la división meiótica en los gametos pueden provocar aneuploidía que posteriormente se transmite al embrión tras la fecundación. La aneuploidía resultante en los embriones en desarrollo es reconocida como una de las principales causas de pérdida del embarazo y defectos congénitos de nacimiento como el síndrome de Down. La segregación cromosómica precisa depende críticamente de la formación del aparato fusiforme de los microtúbulos, sin embargo, este proceso sigue siendo poco conocido en los ovocitos de mamíferos. Curiosamente, el ensamblaje meiótico del huso difiere de la mitosis y está regulado, al menos en parte, por centros organizadores de microtúbulos (MTOC) únicos. La evaluación de las proteínas asociadas a MTOC puede proporcionar información valiosa sobre los mecanismos reguladores que gobiernan la formación y organización del huso meiótico. Aquí, describimos métodos para aislar ovocitos de ratón y agotar las proteínas asociadas a MTOC utilizando un enfoque mediado por siRNA para probar la función. Además, describimos la fijación de ovocitos y las condiciones de análisis de inmunofluorescencia para evaluar la formación y organización del huso meiótico.

La microinyección de siRNAs proporciona un enfoque eficaz para la degradación del ARNm y el agotamiento de la proteína posterior en oocitos, que permite a las pruebas funcionales eficiente y altamente específica de diferentes factores diana in vitro. Posteriormente, la inmunofluorescencia se utiliza para el análisis específico fenotipo, así como para validar el agotamiento de la proteína en oocitos inyectados con siRNA. En el ejemplo actual, marcaje fluorescente de ovocitos individuales con DAPI junto con antic...

A continuación, presentamos un protocolo para el agotamiento de ARNm siRNA mediada específico seguido por análisis de inmunofluorescencia para evaluar ensamblaje del huso meiótico y la organización de los ovocitos de ratón. Este protocolo es adecuado para el agotamiento de las transcripciones in vitro y la evaluación funcional de los diferentes husillo y / o factores MTOC asociada en ovocitos.

Evaluación del huso meiótico en ovocitos de ratón por silenciamiento siRNA mediada

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon ...

El objetivo general de este procedimiento es evaluar la formación y organización del huso mitótico en células tras el agotamiento mediado por ARNi de proteínas clave asociadas al MTOC, como la perrina. Este método puede ayudar a responder preguntas fundamentales en el campo de la biología reproductiva, tales como los mecanismos que regulan la segregación cromosómica y las posibles alteraciones que conducen a la aneuploidía en todos los sitios. La principal ventaja de esta técnica es que permite un silenciamiento eficiente de transcritos y un análisis específico mediante inmunofluorescencia de células individuales.Este procedimiento también puede adaptarse para estudiar casi cualquier proteína diana; 48 horas antes del día de recolección, tratar las ratonas utilizadas para la recolección de ovocitos con cinco unidades internacionales de PMSG inyectadas por vía intraperitoneal. Después de recolectar los ovarios siguiendo prácticas estándar, transferirlos a una placa con medio MEM precalentado y equilibrado, suplementado con BSA y mil reona, y preparar el aislamiento de los ovocitos bajo un microscopio estereoscópico. Liberar los complejos de cito con cumulus o COCs fijando un ovario al fondo de la placa de cultivo mediante una aguja de calibre 27 y utilizar una segunda aguja para puncionar los folículos antrales mediante aspiración de ovocitos o la técnica estándar de pipeteo bucal.Recoger los ovocitos rodeados por dos o más capas de células del cúmulo compactas. Transferir estos COC a un nuevo recipiente con M-E-M-B-S-A mild reone e incubarlos durante una hora a 37 grados Celsius. A continuación, proceder con la desnudación de los ovocitos utilizando métodos estándar.Prepare el plato de cultivo para la inyección con tres mililitros de medio M2 con un microgramo por mililitro de milone. También prepare los platos de lavado y cultivo con M-E-M-B-S-A milone. A continuación, cargue cinco microlitros de la solución de INA uno milimolar en la aguja de inyección y prepárela para la microinyección.Ahora coloque una gota de 100 microlitros de medio M2 en la tapa de un platillo de tres centímetros. Cargue un ovocito en la gota y utilícelo para ajustar la posición de la pipeta de sujeción. Fije el sitio OAS sujetándolo a la pipeta de sujeción mediante presión negativa.Luego, ajuste la posición de la aguja de inyección al diámetro más amplio del ovocito. Una vez posicionada, inyecte aproximadamente 10 picolitros de solución en el citoplasma del ovocito, evitando el núcleo. Devuelva la tapa a la platina del microscopio estereoscópico y agregue 100 microlitros de medio M dos fresco.Coloque aproximadamente 10 ovocitos en el medio. Luego, en la etapa de microinyección, proceda con la microinyección. Sujete cada ovocito con la pipeta de sujeción e inserte lentamente la aguja de inyección en el citoplasma.Inyecte la solución de ARNip S y retire cuidadosamente la pipeta de inyección. Mueva las células inyectadas con éxito a un extremo de la gota y las células inyectadas sin éxito al extremo opuesto de la gota. Debería tomar solo unos minutos inyectar 10 células, lo cual es fundamental para mantener su viabilidad.Mueva la tapa al portaobjetos del microscopio estereoscópico y transfiera todas las células inyectadas con éxito a una placa con M-E-M-B-S-A Mel conocido a 37 grados Celsius. Transfiera las cito a un incubador a 37 grados Celsius con una atmósfera de gas médico e incube durante 24 horas. Comience liberando las cito del bloque mil reone mediante lavado de las células tres veces en M-E-M-B-S-A.Luego, transfiera los cito a medio de maduración que contiene cultivo con 10 % de FBS. Incube las células durante 17 horas a 37 grados Celsius. Así, la meiosis se reanudará al día siguiente.Fije las c&eacute;lulas. Utilice aspiraci&oacute;n con pipeta o pipeteo bucal para trasladar r&aacute;pidamente los diferentes grupos experimentales a los pocillos de placas de cuatro pocillos que contienen 750 microlitros de PFA al 4% precalentado. Deje que las c&eacute;lulas incuben durante una hora despu&eacute;s.Lave cada grupo tres veces con 750 microlitros de PBS tibio con 5 %FBS. Cada lavado debe durar 15 minutos en el incubador; después del lavado, bloquee cada grupo de sitios O en 5 %FBS en BS. Deje que el bloqueo continúe durante la noche a cuatro grados Celsius para la inmunotinción. Utilice una fila de ocho pocillos en la placa de múltiples pocillos para cada grupo experimental de cítos.4 placas de 96 pocillos cargan 200 microlitros de solución por pocillo. Inicie el proceso de tinción con una solución de anticuerpo primario recién preparada. Luego cubra los pocillos con parafilm e incube las células según las especificaciones del anticuerpo tras la incubación con el anticuerpo primario.Lave las c&eacute;lulas tres veces con PBS que contenga 5 % de FBS durante 10 a 15 minutos por lavado. Despu&eacute;s de los tres lavados, transfiera las c&eacute;lulas a un pocillo con soluci&oacute;n de anticuerpo secundario. Cubra estos pocillos con paraform.Incubar las células durante una hora a 37 grados Celsius y luego lavar tres veces como antes. Una vez lavadas, transferir los ovocitos a portaobjetos de vidrio limpios. Todos los ovocitos de un grupo experimental se transfieren a un solo portaobjeto.Aspire cualquier exceso de solución para inmovilizar las células y agregue inmediatamente ocho microlitros de dappy que contenga medio de montaje. Luego, cúbralo, deslice cuidadosamente para evitar burbujas de aire o daño a las células. Las células fueron microinyectadas con un ARNi de control no específico o con perrin ARNi tras 17 horas de cultivo; la mayoría de los controles alcanzaron la etapa de metafase II y presentaron husos mitóticos organizados con cromosomas alineados. La marca de perrin, mostrada en rojo, fue intensa y se localizó con precisión en los polos del huso.Los transcritos se silenciaron con éxito, ya que la tinción Perrin en las células inyectadas con irna no se detectó. La mayoría de estos ovocitos permanecieron en metafase I y presentaron estructuras del huso desorganizadas con cromosomas mal alineados. Algunos progresaron a metafase II, pero también exhibieron husos alterados.Ahora debería tener una buena comprensión de cómo recolectar e inyectar microscópicamente citocitos de ratón con ARNi específico y luego inmunotincionar estos citocitos para el análisis de fluorescencia de la formación y organización del huso. Es importante recordar trabajar con rapidez y mucha precaución para preservar la viabilidad y la calidad de los citocitos.

meiotic-spindle-assessment-mouse-oocytes-sirna-mediated

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Los ovocitos son propensos a la aneuploidía debido a errores en la segregación cromosómica durante la maduración meiótica. Huevos aneuploides puede causar infertilidad, abortos involuntarios o trastornos del desarrollo como el síndrome de Down. Aquí se describen los métodos para introducir los materiales de elección en los ovocitos y los métodos para estudiar la maduración meiótica y evaluar la ploidía.

La microinyección de ovocitos de ratón, Maduración y Evaluación de ploidía

Ovogénesis en mamíferos es conocido por ser errores, particularmente debido a protooncogenes del cromosoma. Este manuscrito describe métodos de preparación de cromatina extensión de profase de ratón, metafase I y II etapas ovocitos. Estas técnicas fundamentales permiten el estudio de las proteínas de la cromatina-limite y morfología cromosómicas en mamíferos Oogénesis.

Cromatina difundir preparados para el análisis de progresión de ovocitos de ratón de profase a metafase II

Como las variantes genéticas asociadas con enfermedades humanas empiezan a ser descubierto, se está convirtiendo en cada vez más importante para el desarrollo de sistemas con los que evaluar rápidamente la importancia biológica de las variantes identificadas. Este protocolo describe los métodos para evaluar la función del gen humano durante la meiosis femenina utilizando ovocitos de ratón.

Uso de ovocitos de ratón para evaluar la función humana del Gene durante la Meiosis I

Reproducible, contar los números de los mRNAs de los ovocitos, in situ de la fluorescencia de una molécula de RNA hibridación (RNA-pescado) fue optimizado para las células no adherentes. Ovocitos se recolectaron, cruzado por hibridación con las sondas específicas de transcripción y cuantificaron utilizando un software de cuantificación de la imagen.

Uso de la sola molécula fluorescente en Situ del hibridación (SM-pescado) para cuantificar y Localize mRNAs en oocitos murinos

Proporcionamos un esquema del protocolo clínico para la evaluación no invasiva de la madurez del óvulo humano mediante microscopía de luz polarizada.

Evaluación de la madurez del óvulo humano y su aplicación clínica

Se presenta un protocolo optimizado que permite el agotamiento de los centros organizadores de microtúbulos citoplasmáticos en ovocitos de ratón durante la metafase I utilizando un láser de femtosegundo de infrarrojo cercano.

Ablación con láser multifotón de centros organizadores de microtúbulos citoplasmáticos en ovocitos de ratón

El error en la segregación cromosómica es una característica común en los ovocitos. Por lo tanto, estudiar el punto de control de ensamblaje del husillo da pistas importantes sobre los mecanismos necesarios para producir óvulos sanos. El presente protocolo describe tres ensayos complementarios para evaluar la integridad del punto de control del ensamblaje del huso en ovocitos de ratón.

Evaluación de la integridad del punto de control del ensamblaje del husillo en ovocitos de ratón

Mantener la integridad del genoma del ovocito es necesario para asegurar la fidelidad genética en el embrión resultante. Aquí, presentamos un protocolo preciso para detectar roturas de doble cadena de ADN en células germinales femeninas de mamíferos.

Detección de roturas de ADN bicatenario en ovocitos de ratón

Este protocolo proporciona un marco experimental para documentar el impacto físico del citoesqueleto en la forma nuclear y los orgánulos internos sin membrana en el sistema de ovocitos de ratón. El marco se puede adaptar para su uso en otros tipos de células y contextos.

Captura de la agitación basada en el citoesqueleto del núcleo del ovocito de ratón a través de escalas espaciales

Los errores meióticos en las sinapsis y la recombinación son comunes en los ovocitos de mamíferos. El análisis riguroso de las proteínas involucradas en estos procesos es esencial para comprender cómo y por qué la ovogénesis a menudo sale mal. Las técnicas aquí presentadas permiten un seguimiento exhaustivo de la recombinación y las sinapsis para evaluar la calidad de los ovocitos en ratones.

Preparación de distribuciones de cromosomas meióticos de ovocitos de ratón para la evaluación de la sinapsis y la recombinación

Aprende a evaluar el ensamblaje del huso meiótico en ovocitos de ratón mediante silenciamiento siRNA e inmunofluorescencia. Este método permite estudiar la segregación cromosómica y los mecanismos de aneuploidía en biología reproductiva.

Evaluación del huso meiótico en ovocitos de ratón por silenciamiento siRNA mediada

Explorar más videos