Name: Un modelo de microfluidos de biomiméticamente respiración pulmonar acinar Airways (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Aprende a crear un modelo microfluídico biomimético de vías respiratorias acinares pulmonares a escala real. Este método permite estudiar patrones de flujo y trayectorias de partículas para mejorar las terapias de inhalación.

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Este trabajo fue apoyado en parte por la Comisión Europea (Programa FP7) a través de una Beca de Integración Profesional (PCIG09-GA-2011-293604), la Fundación de Ciencias de Israel (Subvención nr. 990/12) y el Centro de Excelencia Technion en Salud Ambiental y Ciencias de la Exposición (TCEEH). La microfabricación de chips microfluídicos se llevó a cabo en la Unidad de Fabricación de Micro-Nano (MNFU) del Technion y contó con el apoyo de una subvención inicial del Instituto de Nanotecnología Russel Berrie (RBNI) del Technion. Los autores agradecen a Avshalom Shai por su ayuda durante el grabado iónico reactivo profundo (DRIE) y a Molly Mulligan y Philipp Hofemeier por las útiles discusiones.

Fabricación 1. Maestro <ol><li> Utilizar el grabado profundo de iones reactivos (DRIE) de un silicio sobre aislante de obleas (SOI) para fabricar una oblea de silicio maestro como se describe en trabajos anteriores 32, 33. NOTA: DRIE se prefiere estándar SU-8 micromecanizado debido a las características de alta relación de aspecto (40 micras de ancho y 90 micras zanjas profundas). </li></ol> 2. Fundición y sellado del dispositivo de microfluidos <ol><li> Mezclar PDMS y agente de curado en una relación de 10: 1 peso dentro de un contenedor pequeño limpia tal como un plato de plástico de pesaje. </li><li> Desgasificar la mezcla en un desecador al vacío hasta que se eliminen todas las burbujas de aire. NOTA: Prepare suficientes PDMS para todos los pasos subsiguientes. A continuación, el acrónimo &quot;PDMS&quot; se refiere siempre a las desgasificados 10: 1 de PDMS: mezcla-agente de curado que se preparó en los pasos 2.1 y 2.2. </li><li> Verter la mezcla desgasificada a una altura de aproximadamente 1 mm por encima de la oblea maestro. Degas, una vez más durante al menos40 minutos para eliminar todas las burbujas de aire por encima de la oblea y minimizar las burbujas debajo de la oblea. NOTA: Asegúrese de que la oblea es lo más cerca posible a la parte inferior de la placa. Si es necesario, pulse la oblea suavemente hacia la parte inferior con 2 barras de agitación y desgasificar una vez más. </li><li> Hornear a 65 ° C durante 20 minutos en un horno de convección natural. NOTA: Después de 20 minutos, el PDMS se endurece y casi completamente curado. Mientras que un tiempo más largo de cocción es posible hornear durante 20 minutos ahorra tiempo y mejora la adherencia de la segunda capa de PDMS (ver más abajo) a la primera. </li><li> Presente la sección de cuerpo de una jeringa de plástico de 2 ml utilizando un papel de lija de grano fino para mejorar la adherencia al PDMS. Además, utilizar el papel de lija para aplanar la base del cilindro de la jeringa mediante la colocación de la arena de papel sobre una superficie plana y de deslizamiento de la base del cilindro de la jeringa en la parte superior de la misma. Limpiar la jeringa usando aire a presión. </li><li> Coloque la sección de barril de la jeringa en la parte superior de la primera capa de PDMS con el LAapertura RGE frente a la superficie de los PDMS, y verter una segunda capa de PDMS en la parte superior de la primera uno a una altura de 5 ~ mm, y desgasificar la PDMS una vez más en un desecador. NOTA: La segunda capa de PDMS se debe verter desde el pequeño recipiente alrededor del cañón, y no debe entrar dentro de él. </li><li> Hornear la configuración completa a 65 ° C durante al menos 2 h en un horno de convección natural. NOTA: No hay necesidad de sostener el cuerpo en su lugar durante los procesos de curado ya que el peso del PDMS presionando contra la amplia base del barril tiene el barril firmemente en su lugar. </li><li> Cortar a través del molde de PDMS en torno a la región de modelado de la oblea maestro utilizando un bisturí. Si bien el corte, el bisturí debe débilmente toque la superficie de la oblea. A continuación, inserte suavemente un objeto puntiagudo, como fórceps de la oblea en la ranura creada por el bisturí, y se desprenda el PDMS emitidos por el oblea maestro. </li><li> Colocar el molde en una superficie suave cubierto con papel de aluminio con el lado estampadohacia arriba (es decir., el cañón debe colgar desde el borde de la mesa), y perforar un agujero en el PDMS en la entrada de entrada de la cámara y el canal utilizando un punzón de biopsia de 1 mm. </li><li> Escudo un portaobjetos de vidrio limpio con un (desgasificado) 10: 1 PDMS: mezcla-agente de curado utilizando un aplicador de giro programada a 3.000 rpm durante 30 segundos, y hornear durante&gt; 1 hora a 65 ° C. A continuación, limpiar la diapositiva y PDMS fundido utilizando cinta adhesiva transparente. </li><li> Tratar la superficie del molde y PDMS recubierto portaobjetos de vidrio PDMS con plasma de O2 (por ejemplo, utilizando un tratador corona de mano) durante 1 minuto, y luego presione suavemente las superficies juntas y hornear a 65 ° C durante la noche (O / N) . </li></ol> 3. Relleno de dispositivos y de actuación <ol><li> Mezclar agua suspendidas partículas de poliestireno fluorescentes con agua y glicerol en un vial de vidrio para obtener una (v / v) mezcla 64/36 de glicerol / agua con 0,25% (w / w) partículas .. </li><li> Colocar una gota de la solución de glicerol en la parte superior de la entrada del canal y una gota de DI water en la entrada de la cámara, a continuación, colocar el aparato en un desecador y vacío durante ~ 5 min. NOTA: Antes de liberar la espera de vacío de las burbujas que se forman en las gotas de solución de glicerol y agua DI al pop. Tras la liberación de vacío los líquidos son absorbidos en los espacios vacíos en el interior del dispositivo. Si el aire residual permanece dentro de los canales, eliminarlo mediante la aplicación de presión externa sobre los fluidos (por ejemplo., Usando una jeringa) y permitiendo que el aire se difunda en el PDMS. </li><li> Inyectar ~ 2 ml de agua DI en la cámara superior (es decir, el cuerpo de la jeringa, la Fig. 2b) hasta que esté completamente llena de agua. Luego cubra la cámara superior con una punta roma de la jeringa de calibre 19, cortar la punta de la otra punta de la jeringa de calibre 19 roma e insertar este consejo a la entrada de la cámara lateral. Conectar ambas puntas de jeringa a una jeringa de 1 ml mediante un tubo de teflón delgado y un conector en forma de T. NOTA: Asegúrese de que la jeringa de 1 ml, tubo de teflón, conector en forma de T y la cámara superior (Barr jeringa de 2 mlEL) son todo lleno de agua sin burbujas. Esto se puede lograr mediante la apertura de los puntos de conexión, que empuja el agua a través de secciones vacías de tubo y volver a conectar los puntos de conexión. </li><li> Coloque la jeringa de 1 ml con una bomba de jeringa pre-programados para imitar, por ejemplo, un ciclo de respiración corriente tranquila (con un periodo de T = 4 s) construida de rampas lineales, es decir, de cero a 1,8 ml / min en 1 segundo, a partir de 1,8 ml / min a -1.8 ml / min en 2 segundos y desde -1.8 ml / min a cero en 1 seg. </li></ol> 4. Los experimentos de visualización de flujo: micro-partículas de velocimetría de imagen (μPIV) <ol><li> Mientras que el dispositivo está siendo accionado, obtener una serie de 9 - 12 imágenes de enganche de fase, de doble marco del flujo de partículas cabeza de serie, utilizando un sistema (μPIV) micro-partículas imagen velocimetría que consiste, por ejemplo de un CCD exposición marco de múltiples dual la cámara (por ejemplo., 1.600 × 1.200 píxeles para lograr una resolución suficiente), un doble láser de Nd-YAG pulsado (longitud de onda: 532 nm, energía de salida: 400 mJ, duración del pulso: 4 nseg), y un microscopio invertido. NOTA: Tal sistema es capaz de obtener pares de marco con un retraso de tiempo de hasta unos pocos microsegundos entre el primer y segundo bastidores. Para lograr imágenes doble marco de enganche de fase, es útil para adquirir una serie doble marco en por ejemplo., 10 Hz (pares de bastidor están separados por 0,1 segundos una de otra). Entonces, los datos pueden ser reorganizados para que todos los pares de trama que están separados por un tiempo de ciclo completo (aquí T = 4 seg) forman una nueva serie de tiempo. La adquisición de imágenes se debe repetir varias veces mientras la modificación del tiempo de retraso entre el primer y segundo bastidores de cada par de trama (es decir., 100 microsegundos a 0,1 segundos) para la resolución de diferentes regiones de flujo dentro de la cavidad alveolar. Nota: las configuraciones alternativas con respecto a las mejores combinaciones de sistemas de adquisición de imagen (. Es decir, la cámara) y la iluminación de las fuentes (es decir, láser) a la imagen talesmicroflujos también están disponibles 34, 35. </li><li> Utilizar un algoritmo de suma de correlación para calcular mapas de vectores de velocidad de enganche de fase del campo de flujo resultante de la serie de imágenes para cada intervalo de tiempo utilizado. Repita este proceso varias veces con diferentes tiempos de retraso entre el primer y segundo bastidores de cada par de trama para la resolución de diferentes regiones de flujo dentro de la cavidad alveolar. A continuación, utilizar un programa de análisis de datos para coser juntos los mapas de flujo individuales en un mapa completo y de alto detallada de los patrones de flujo promediando la superposición de puntos de datos 33. </li></ol>

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<li>Haefeli-Bleuer, B., Weibel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphometry+of+the+human+pulmonary+acinus%5BTitle%5D)+AND+%22Anat.+Rec%22%5BJournal%5D)">Morphometry of the human pulmonary acinus.</a> Anat. Rec. 220 (4), 401-414 (1988).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

<html> Una característica crítica de la plataforma acinar de microfluidos que aquí se presenta es su capacidad para reproducir los movimientos de respiración fisiológicamente realistas que dan lugar a perfiles de flujo fisiológicas y velocidades dentro de los conductos acinares y dentro de los alvéolos. Dado que los canales de microfluidos se producen con una relación de aspecto relativamente baja (es decir., W d / h ≈ 3,9, donde w d es la anchur...

Una cuantificación detallada de la dinámica de flujo respiratorio en el distal, regiones alveolada de los pulmones es de suma importancia en la comprensión de la mezcla del flujo de aire en el acino pulmonar y predecir el destino de los aerosoles inhalados en la más profunda de las vías respiratorias 1-3. Este último aspecto es de particular preocupación cuando abordar por una parte los peligros de las partículas contaminantes inhalados o por el contrario en la búsqueda de nuevas estrategias para la administración de fármacos mejorado y selectiva de agentes terapéuticos inhalados a sitios localizados de pulmón 4, 5, así como para la administración sistémica. Hasta la fecha, los flujos respiratorios en las regiones acinares pulmonares profundas han sido típicamente investigado in silico usando la dinámica de fluidos computacional (CFD) o, alternativamente, in vitro con modelos experimentales ampliados de coincidencia siguientes similitud hidrodinámico. En las últimas décadas, los métodos CFD se han aplicado cada vez más para estudiar fenómenos de flujo acinar, de cabeza del ce modelos alveolares 6, 7 y alveolada conductos 8-12 para más elaborado modelos in silico que capturan anatómicamente realista árbol acinar estructuras con múltiples generaciones de conductos alveolada y hasta varios cientos de alvéolos individuales 13-15. En conjunto, los esfuerzos numéricos han sido fundamentales en el esclarecimiento de la función y la influencia del movimiento de la pared durante la respiración en los movimientos que siguió los patrones de flujo de aire acinar. En ausencia de movimiento de la respiración, estática de recirculación característica alvéolos fluye dentro de sus cavidades que exhiben ningún intercambio convectivo de aire entre el conducto acinar y el alvéolo 6, 7; en otras palabras, los flujos de alveolares serían totalmente aislados de flujos dentro de los árboles acinares y el intercambio de aire daría lugar únicamente de mecanismos de difusión. Con la existencia de las expansiones cíclicas del dominio alveolar, sin embargo, las topologías de flujo alveolares se modifican drásticamente y la resulting patrones de flujo dentro de los alvéolos están íntimamente ligados a la localización de un alvéolo lo largo del árbol acinares (por ejemplo., vs. proximal distal generaciones). En particular, se ha planteado la hipótesis en las simulaciones que los patrones de flujo alveolares están fuertemente influenciadas por la relación de alveolar para ductal velocidades de flujo tal que las generaciones proximales del árbol acinar pulmonar, donde esta relación es relativamente grande siguiente conservación de la masa a través de una estructura de árbol, característica recirculación de los complejos flujos dentro de las cavidades alveolares con pathlines fluidos irreversibles. Con cada generación acinar más profunda, la relación de alveolar para velocidades de flujo ductal disminuye gradualmente de tal manera que las generaciones acinares distales presentan líneas de corriente más radiales como que recuerdan a inflaciones y deflaciones de un globo simples. Con los avances en las técnicas de imagen modernas, datos de imagen pulmonar 16, 17 de los roedores, incluyendo rata y ratón, han dado lugar a algunos de los primeros simultánea CFDciones de los flujos acinares reconstruidos anatómicamente en los alvéolos reconstruidas. A pesar de estos progresos prometedores, estos estudios recientes son todavía limitados para hacer frente a los fenómenos de flujo de aire en los sacos alveolares terminales sólo el 18, 19 o unos alvéolos en torno a un solo conducto 20. Como resultado, las investigaciones del estado de la técnica de los fenómenos de flujo respiratorio en los acinos siguen dominadas por los estudios centrados en genéricos geometrías inspiradas anatómicamente del entorno acinar 2. En el lado experimental, diversas configuraciones que ofrecen una vía aérea con uno o varios alvéolos se han desarrollado a lo largo de los años 21-24. Sin embargo, no existe ningún modelos experimentales de bifurcar las vías respiratorias alveolada que son capaces de imitar la respiración fisiológica mediante la expansión y la contratación de una manera similar a la respiración. Dada la falta de plataformas experimentales atractivos en parte, el estudio de los fenómenos de transporte acinar sigue siendo limitada en lo que respecta a validating estudios computacionales y críticamente, sigue habiendo una escasez de datos experimentales disponibles. . En los últimos años, Ma et al (2009) han construido un modelo de pared rígida a mayor escala de un acino que consta de tres generaciones acinares; Sin embargo, la falta de movimiento de la pared en este modelo limita su capacidad para capturar los patrones de flujo alveolares en condiciones realistas de respiración. Otros experimentos a escala plano incluyendo un modelo de pared móvil en base a los datos anatómicos de réplica de yeso recientemente se introdujeron 25; Sin embargo, dado que el modelo sólo capturó las dos últimas generaciones acinares (es decir., sacos terminales), que no pudo capturar los flujos de recirculación complejas que caracterizan a las generaciones acinares más proximales. Estos últimos ejemplos de experimentos a escala arriba subrayan aún más las limitaciones en curso con estos planteamientos. Específicamente, ningún experimento existente hasta el momento ha demostrado la transición planteado la hipótesis de recirculación para radial fluye a lo largolos acinos y de ese modo confirman las predicciones numéricas de las topologías de flujo hipótesis de existir en árboles acinares pulmonar reales 7, 15. Tal vez lo más crítico, los experimentos a escala arriba están muy limitados en la investigación de partículas de transporte y deposición dinámica de 26 inhalada debido a las dificultades en la adecuación de todos los no relevantes parámetros dimensionales (por ejemplo., la difusión de partículas, un mecanismo de transporte crítico para las partículas sub-micrométricas, está completamente descuidado). Con desafíos experimentales en curso, nuevas plataformas experimentales que se puedan investigar las vías respiratorias flujos de aire y dinámica de las partículas en las paredes móviles complejas se buscan redes acinares. Aquí, un anatómicamente inspirado en el modelo in vitro se introduce acinar. Esto imita la plataforma de microfluidos acinares pulmonar fluye directamente en la escala acinar representativa, y amplía la creciente gama de modelos de microfluidos pulmonares 27, que incluye asma bronquial plug-flo líquidaws 28-30 y la barrera alveolocapilar 31. Es decir, cuenta con el diseño actual de un árbol de la vía aérea alveolada cinco generación simplificada con la expansión y las paredes, en los movimientos cíclicos se consiguen mediante la presión que controla el interior de una cámara de agua que rodea las paredes laterales PDMS delgadas y donde la pared superior es deformada por un agua adicional contraer cíclicamente cámara situada directamente encima de la estructura acinar. A diferencia de los dispositivos de microfluidos de capas múltiples comunes, esta cámara está formado simplemente mediante la incorporación de la sección de barril de una jeringa dentro del dispositivo de PDMS, y no requiere la preparación de un molde de PDMS adicional. El enfoque que aquí se presenta miniaturizado ofrece un medio simple y versátil para la reproducción de las estructuras acinares complicados con paredes móviles, en comparación con modelos a escala en marcha durante la captura de las características subyacentes del entorno de flujo acinar. Esta plataforma puede ser utilizado para flow visualización mediante partículas de fluido a poner en suspensión dentro de las vías respiratorias (ver resultados representativos de abajo). En un futuro próximo, el modelo se puede utilizar con partículas en el aire para el estudio de la dinámica de partículas inhaladas acinares.

<table><tbody><tr><td>Polidimetilsiloxano (PDMS) y agente de curado</td><td>Dow Corning</td><td>(240)4019862</td><td>Sylgard&reg; 184 Kit de elastómero de silicona</td></tr><tr><td>Plastipak Jeringa de 2 ml</td><td>BD</td><td>300185</td><td></td></tr><tr><td>Norm-Ject Luer slip Jeringa de 1 ml</td><td>Henke Sass Wolf </td><td>4010-200V0</td><td></td></tr><tr><td>1 mm Punzón de biopsia</td><td>Kai Medical</td><td>BP-10F</td><td></td></tr><tr><td>Laboratorio Corona Treater</td><td>Productos Electro-Technic</td><td>BD-20AC</td><td></td></tr><tr><td>PHD Ultra Bomba de jeringa Aparato</td><td>Harvard</td><td>703006</td><td></td></tr><tr><td>Partículas fluorescentes rebuscadas teñidas de rojo</td><td>Thermo-Scientific</td><td></td><td>Uncatalloged 0.86 &micro; Se utilizaron perlas</td></tr><tr><td>Glycerin AR</td><td>Gadot</td><td>830131320</td><td></td></tr><tr><td>FlowMaster MITAS Velocimetría de imágenes de micropartículas (&micro; PIV) sistema </td><td>LaVision</td><td>1108630</td><td></td></tr></tbody></table>

un modelo de microfluidos de biomiméticamente respiración pulmonar acinar airways

A Microfluidic Model of Biomimetically Breathing Pulmonary Acinar Airways

La cuantificación de las características del flujo respiratorio en las profundidades acinares pulmonar y cómo influyen en el transporte aerosol inhalado es crítica con respecto a la optimización de las técnicas de inhalación de drogas, así como la predicción de los patrones de deposición de partículas en el aire potencialmente tóxicos en los alvéolos pulmonares. Aquí, las técnicas de litografía blanda se usan para fabricar estructuras de las vías respiratorias acinares-como complejos en los veraces longitud escalas anatómicas que reproducen fenómenos de flujo acinar fisiológicas en un sistema ópticamente accesible. El dispositivo de microfluidos cuenta con 5 generaciones de bifurcar conductos alveolada con la expansión periódicamente y paredes de contratación. Wall accionamiento se consigue mediante la alteración de la presión dentro de las cámaras llenas de agua de los alrededores de las delgadas paredes del canal acinar PDMS tanto de los lados y la parte superior del dispositivo. En contraste con los dispositivos de microfluidos de capas múltiples comunes, donde se requiere el apilamiento de moldes de varios PDMS, se presenta un método simple para fabricar la parte superiorcámara mediante la incorporación de la sección de barril de una jeringa en el molde de PDMS. Esta novedosa configuración de microfluidos proporciona movimientos respiratorios fisiológicos que a su vez dan lugar a características acinares flujos de aire. En el presente estudio, se utilizó micro partículas velocimetría de imagen (μPIV) con partículas líquidas en suspensión de cuantificar tales flujos de aire a juego basado en la similitud hidrodinámico. La buena concordancia entre los resultados μPIV y fenómenos de flujo acinar esperados sugieren que la plataforma de microfluidos puede servir en un futuro próximo como una herramienta atractiva en vitro para investigar el transporte de partículas en el aire directamente representativa y la deposición en las regiones acinares de los pulmones.

Diseño asistido por ordenador (CAD) y microscopio imágenes de la plataforma acinar in vitro se presentan en la Fig. 1. El modelo acinar biomimético cuenta con cinco generaciones de ramificación canales rectangulares alineadas con las cavidades cilíndricas alveolares similar (Fig. 1). Aquí, las generaciones de modelos se numeran de generación 1 (para la generación más proximal) para la generación de 5 (para la generación más distal). Tenga en cuenta que sólo la entrada del canal...

Se utilizó la litografía blanda para producir un modelo representativo a escala real de las vías respiratorias alveoladas pulmonares que se expanden y contraen periódicamente, imitando el movimiento fisiológico de la respiración. Esta plataforma recrea los flujos de acinares respiratorios en un chip, y se prevé que facilite la investigación experimental de la dinámica de los aerosoles inhalados y la deposición en el acino pulmonar.

Un modelo de microfluidos de biomiméticamente respiración pulmonar acinar Airways

Quantifying respiratory flow characteristics in the pulmonary acinar depths and how they influence inhaled aerosol transport is critical towards ...

El objetivo general de este sistema modelo es imitar la geometría y el movimiento respiratorio del acino pulmonar para estudiar los patrones de flujo de aire en el acino y las trayectorias de micro partículas en suspensión. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de los fenómenos de transporte acinar, tales como los efectos de la gravedad, el medicamento y la difusión sobre los resultados de deposición de partículas.La principal ventaja de esta técnica es que los experimentos se realizan dentro de un modelo a escala uno a uno, en lugar de un modelo ampliado. Esto permite una observación precisa del movimiento browniano de las partículas. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia por inhalación, ya que se puede lograr una mejor comprensión del depósito de fármacos en aerosol.Para comenzar, utilice la grabación por iones reactivos en profundidad de una oblea de silicio sobre aislante para fabricar una oblea maestra de silicio según se describió anteriormente. A continuación, mezcle el PDMS y el agente de curado en una proporción de diez a uno en peso dentro de un recipiente pequeño y limpio. Desgasifique la mezcla en un desecador bajo vacío hasta que se eliminen todas las burbujas de aire.Coloque la oblea maestra en una placa de Petri y vierta la mezcla de PDMS desgasificada hasta una altura de aproximadamente un milímetro por encima de la oblea maestra. Desgasifique nuevamente el PDMS vertido durante al menos 40 minutos, hasta que se eliminen todas las burbujas de aire por encima de la oblea y se minimicen las burbujas por debajo de ella. Asegúrese de que la oblea esté lo más cerca posible del fondo de la placa.Si es necesario, presione suavemente la oblea hacia el fondo utilizando dos varillas de agitación y desgasifique una vez más. Luego, hornee el PDMS a 65 grados Celsius durante 20 minutos en un horno con convección natural. Mientras el PDMS se hornea, lije la sección del cilindro de una jeringa plástica de dos mililitros, utilizando papel de lija de grano fino para mejorar su adherencia al PDMS.Además, utilice el papel de lija para nivelar la base del cilindro de la jeringa colocando el papel de lija sobre una superficie plana y deslizando la base del cilindro sobre él. Limpie cualquier residuo de la jeringa utilizando aire comprimido. A continuente, coloque la sección del cilindro de la jeringa sobre la primera capa de PDMS con la abertura grande orientada hacia la superficie del PDMS.Vierta una segunda capa de PDMS encima de la primera, hasta una altura de aproximadamente cinco milímetros, asegurándose de que el PDMS no entre en el cuerpo de la jeringa. Luego, desgasifique el PDMS una vez más. Incube todo el montaje a 65 grados Celsius durante al menos dos horas en un horno de convección natural para endurecer el PDMS.Corte a través del molde de PDMS alrededor de la región patroneada de la oblea matriz utilizando un escalpelo. Durante el corte, el escalpelo debe tocar débilmente la superficie de la oblea. Luego, inserte suavemente una herramienta delgada, como pinzas para obleas, en la muesca creada por el escalpelo y desprenda cuidadosamente la pieza de PDMS de la oblea matriz.Coloque el molde sobre una superficie blanda cubierta con papel de aluminio, de modo que el lado con el patrón quede hacia arriba, y haga un orificio en el PDMS en la entrada de la cámara y en la entrada del canal, utilizando un punzón de biopsia de un milímetro. A continuación, agregue algo del PDMS con agente de curado sobre un portaobjetos de vidrio limpio y recubra con una capa delgada mediante centrifugación a 3.000 RPM durante 30 segundos. Luego, hornee el portaobjetos a 65 grados Celsius durante al menos una hora.Limpie la placa y la pieza de PDMS con cinta adhesiva. Trate las superficies de la placa de vidrio recubierta y del PDMS moldeado con plasma de oxígeno utilizando un aparato de tratamiento por corona. Tenga en cuenta que cada superficie debe tratarse durante al menos un minuto.Luego, presione suavemente las superficies juntas y hornee durante toda la noche a 65 grados Celsius. Mezcle partículas fluorescentes de poliestireno en suspensión acuosa con agua y glicerol en un vial de vidrio para obtener una relación de volumen a volumen de 64 a 36 de glicerol respecto al agua, que contenga 0,25 % de partículas en peso. A continuación, coloque una gota de la solución de glicerol en la parte superior de la entrada del canal y una gota de agua desionizada en la entrada de la cámara.Luego, coloque el aparato dentro de un desecador y aplique vacío durante aproximadamente cinco minutos. Antes de liberar el vacío, espere a que desaparezcan las burbujas que se forman en las gotas de solución de glicerol y agua desionizada. Al liberar el vacío, los líquidos son succionados hacia los espacios vacíos dentro del dispositivo.Si queda aire residual dentro de los canales, elimínelo aplicando presión externa sobre los fluidos mediante una jeringa y permitiendo que el aire se difunda hacia el PDMS. A continuación, inyecte aproximadamente dos milímetros de agua desionizada en la cámara superior hasta que quede completamente llena de agua. Luego, cubra la cámara con la punta roma de una jeringa de calibre 19.Corte la punta de otra jeringa rombuda de calibre 19 e inserte esta punta en la entrada de la cámara lateral. Conecte ambas puntas de jeringa a una jeringa de un mililitro utilizando un tubo delgado de teflón y un conector en forma de t. Asegúrese de que la jeringa de un mililitro, el tubo de teflón, el conector en forma de t y la cámara superior estén completamente llenos de agua, sin burbujas.A continuación, conecte la jeringa de un mililitro a una bomba de jeringa y prográmela para imitar un ciclo respiratorio tranquilo, tal como se describe en el protocolo de texto adjunto. Con el fin de obtener imágenes de simetría de velocidades de micro-partículas, coloque el dispositivo sobre la platina de un microscopio invertido. Luego, encienda el láser de Nd:YAG de doble pulso y cargue el software de análisis de imágenes en la computadora.Mientras se acciona el dispositivo, obtenga una serie de nueve a doce imágenes de doble cuadro sincronizadas por fase del flujo sembrado con partículas, utilizando un sistema de microsimetría de imágenes de partículas de acuerdo con las especificaciones del fabricante. Para obtener imágenes de doble cuadro sincronizadas por fase, adquiera una serie de doble cuadro a 10 hercios. Luego, reorganice los datos de manera que todos los pares de cuadros separados por un tiempo completo de ciclo formen una nueva serie temporal.Utilice la suma del algoritmo de correlación para calcular el mapa vectorial de velocidad con fase bloqueada y obtener así el campo de flujo resultante a partir de la serie de imágenes. Repita este proceso varias veces con tiempos de retardo variables entre el primer y segundo fotograma de cada par de fotogramas para resolver diferentes regiones de flujo dentro de la cavidad alveolar. A continuación, utilice un programa de análisis de datos para unir los mapas de flujo individuales en un mapa completo y altamente detallado de los patrones de flujo, promediando los puntos de datos superpuestos.Una característica fundamental de la plataforma acinar microfluídica aquí presentada es su capacidad para reproducir movimientos fisiológicamente realistas de la respiración que generan perfiles y velocidades de flujo fisiológicos dentro de los conductos acinares y de los alvéolos. Los perfiles de velocidad del flujo a través del ancho de los canales muestran una disminución constante de las tasas de flujo hacia generaciones acinares más profundas. Los perfiles de flujo cerca y dentro de las cavidades alveolares indican que las magnitudes del flujo disminuyen abruptamente a lo largo de la abertura de los alvéolos.Lo que resulta en velocidades de flujo dos a tres órdenes de magnitud más lentas dentro de los alvéolos en comparación con los conductos. Además, los patrones de flujo cambian considerablemente con el aumento de la generación acinar. Mientras que la primera generación presenta una zona de recirculación, que coincide aproximadamente con el centro de los alvéolos, la tercera generación se caracteriza por una zona de recirculación desplazada hacia el lado proximal de los alvéolos, con un patrón de líneas de corriente más abierto.Finalmente, se observan líneas de corriente radiales sin zona de re-circulación en la generación cinco del dispositivo. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en unas pocas horas si se lleva a cabo correctamente. Tras seguir este procedimiento, que permite la visualización del flujo en geometrías acinares, la plataforma puede utilizarse para rastrear partículas aéreas individuales con el fin de explorar la dinámica y la posición de las partículas inhaladas.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

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