Generación de un "humanizado" Drosophila S2 Línea Celular Sensible a farmacológico Inhibición de la Kinesin-5

El objetivo general de este experimento es generar una línea celular de Drosophila S2 que sea sensible a los inhibidores de moléculas pequeñas del motor Kinesin-5, de modo que puedan usarse para estudiar la corrección de errores. La corrección de errores durante la división celular es un proceso en el que se desestabilizan las interacciones erróneas entre el cinetocoro y los microtúbulos, para dar a la célula una segunda oportunidad, u otra oportunidad, de formar uniones adecuadas para que el genoma pueda segregarse correctamente. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología celular, relacionadas con el proceso de corrección de errores.

La principal ventaja de esta técnica es que podemos utilizar una línea celular de Drosophila S2 que tiene menos cromosomas, y son sensibles a un inhibidor de Kinesina-5, lo que facilita la visualización de eventos individuales de corrección de errores. Comenzando con un matraz cuadrado de 25 centímetros previamente cultivado de células S2 que expresan GFP-alfa tubulina 100% confluente, transfiera dos mililitros del cultivo a una placa de 35 milímetros. Luego, incuba las células a temperatura ambiente durante aproximadamente una hora para que se semiadhieran.

Retire el medio de la placa y agregue un mililitro de medio de Schneider, complementado con FBS, en dos microgramos del reactivo de construcción y transfección Eg5-mCherry para transfectar las células siguiendo el protocolo del fabricante. Use Parafilm para sellar el plato e incube las células a 25 grados centígrados durante 16 a 18 horas. Luego agregue un mililitro de medio de Schneider y devuelva las células a la incubadora.

En el tercer día después de la transfección, transfiera 500 microlitros de células transfectadas a una nueva placa de cultivo de tejidos de 35 milímetros que contenga 1,5 mililitros de medio de Schneider para una inducción de prueba. Para inducir la expresión de Eg5-mCherry, agregue sulfato de cobre hasta una concentración final de 500 micromolares. Selle el plato en Parafilm e incube a 25 grados centígrados durante la noche.

Coloque un cubreobjetos recubierto de Concanavalina A de 22 milímetros por 22 milímetros previamente preparado en una placa de cultivo de tejidos limpia de 35 milímetros. A continuación, siembre 500 microlitros de las células inducidas al 100% confluentes en el cubreobjetos y deje que las células se adhieran a temperatura ambiente. Para verificar la expresión de Eg5-mCherry, ensamble el cubreobjetos en una cámara de rosas con medio e imagen a temperatura ambiente usando un microscopio de fluorescencia, de acuerdo con las pautas del protocolo de texto.

Después de asegurarse de que las células expresan tanto Eg5-mCherry como GFP alfa tubulina, transfiera el resto de las células transfectadas no inducidas a un matraz de cultivo de tejidos cuadrado de 25 centímetros, que contiene cuatro mililitros de medio de Schneider. Agregue Blasticidina S HCL a una concentración final de 25 microgramos por mililitro al matraz y continúe dividiendo las células en presencia de Blasticidina S HCL hasta que cese la muerte celular. Después de preparar el ARN bicatenario KLP61F de acuerdo con el protocolo de texto, siembre las células S2 que expresan Eg5-mCherry en una placa de cultivo de 35 milímetros al 25% de confluencia y déjelas adherir durante una hora.

Retire el medio de los platos y agregue un mililitro de medio Schneider sin suero a cinco microgramos de ARN KLP61F de doble cadena. Después de incubar a temperatura ambiente durante una hora, agregue un mililitro de medio Schneider con 10% FBS. Incubar las células a 25 grados centígrados.

24 horas después del tratamiento con dsRNA, inducir la expresión de Eg5-mCherry mediante la adición de sulfato de cobre a una concentración final de 500 micromolares. Incuba las células a 25 grados centígrados durante 24 horas más. Para llevar a cabo la obtención de imágenes de células vivas, coloque un cubreobjetos Recubierto de Concanavalina A de 22 milímetros por 22 milímetros en una placa de cultivo de tejidos limpia de 35 milímetros.

Siembre 500 microlitros de las células tratadas con dsRNA que se han inducido durante la noche en el cubreobjetos y déjelas adherir durante aproximadamente una hora. Después de recopilar imágenes de lapso de tiempo de husos bipolares de acuerdo con el protocolo de texto, retire el medio de la cámara de rosas y agregue el medio de Schneider que contiene un STLC micromolar y reemplace el medio STLC dos veces más, descartando el medio después de cada lavado para visualizar el colapso del huso. Para lavar el medicamento y revertir el colapso del huso, retire con cuidado el medio que contiene STLC de la cámara de rosas y deséchelo en un contenedor de desechos, y use de 6 a 8 milímetros en total del medio de Schneider para lavar las celdas cuatro veces, desechando el medio después de cada lavado.

Luego, después de agregar medio nuevo para rellenar la cámara, continúe con la toma de imágenes. Para tener acceso al medio para el lavado y lavado de medicamentos, retire con cuidado el cubreobjetos superior de la cámara de rosas mientras está asegurado en el microscopio. Alternativamente, se puede utilizar una placa de Petri con fondo de vidrio tratada con Concanavalina A de manera similar a los cubreobjetos para la obtención de imágenes de células vivas.

Después de sembrar 500 microlitros de células S2 tratadas con KLP61F dsRNA en un cubreobjetos de Concanavalina A y dejar que las células se adhieran, agregue 1,5 mililitros de medio de Schneider para llevar el volumen final a dos mililitros. Una vez que las células se hayan detenido en la mitosis de acuerdo con el protocolo de texto, agregue un STLC micromolar e incube durante una hora para permitir que se formen monopolos. Lave el STLC usando dos mililitros de medio Schneider fresco para enjuagar las hojas de cubierta tres veces.

Para fijar las celdas en diferentes puntos de tiempo de formación de huso bipolar y para evaluar los sitios de fijación del cinetocoro, comience usando dos mililitros de 1X BRB80 para enjuagar rápidamente los cubreobjetos. En una campana química, agregue dos mililitros de PFA al 10% en 1X BRB80 e incube durante 10 minutos. A continuación, para permeabilizar las células, agregue 1%Triton X en 1X PBS e incube durante 10 minutos.

A continuación, utilice dos mililitros de 0,1%Triton X en 1X PBS para lavar las células tres veces. A continuación, transfiera el cubreobjetos, con el lado de la celda hacia arriba, a una hoja de Parafilm en una placa de Petri de 150 milímetros. Agregue 150 microlitros de suero de burro hervido, o BDS, a los cubreobjetos e incube a temperatura ambiente durante una hora para bloquear la unión de anticuerpos inespecíficos.

Después de la incubación, retire el bloque y agregue 150 microlitros de anticuerpos primarios preparados de acuerdo con el protocolo de texto antes de incubar a temperatura ambiente durante una hora. Después de lavar las fundas tres veces, agregue anticuerpos secundarios conjugados con flúor-4 diluidos en BDS e incube a temperatura ambiente durante 30 a 60 minutos. Una vez que los cubreobjetos se hayan lavado tres veces, incubarlos con 150 microlitros de BDS, que contiene un microgramo por mililitro de DAPI durante cinco minutos.

Luego, después de que los cubreobjetos se hayan lavado dos veces, use ocho microlitros de medio de montaje para montar la muestra, con la célula hacia abajo, en un portaobjetos de tres por una pulgada. Usa esmalte de uñas para pintar las esquinas. Por último, utilice un objetivo de 100X para obtener imágenes de células con husos bipolares que expresen Eg5-mCherry.

Tomemos una serie Z, que consta de 30 planos a intervalos de 0,2 micrómetros en todos los canales. Analice cuidadosamente el cinetocoro y los microtúbulos para determinar el estado de adhesión. KLP61F es necesario para formar husos bipolares en las células de Drosophila S2; sin embargo, los inhibidores de la quinesina-5 de moléculas pequeñas son ineficaces contra ella.

Estas imágenes muestran que la Kinesina-5 Eg5 humana puede rescatar la función de KLP61F en células de Drosophila S2. Cuando se agrega el inhibidor de la kinesina-5, STLC, los niveles asociados a los microtúbulos del motor disminuyen y el huso colapsa, lo que resulta en un monopolo en las células que carecen de KLP61F endógeno como resultado de un ARN I exitoso. Esta figura demuestra que la inhibición de la kinesina-5 se puede revertir mediante el lavado del fármaco, y la recuperación de un huso bipolar se puede seguir con el tiempo. Tras la eliminación del inhibidor, Eg5-mCherry se vuelve a asociar con los microtúbulos y las células pueden progresar a una anafase bipolar.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo generar una línea celular de Drosophila S2 que sea sensible a una pequeña molécula inhibidor de Kinesin-5. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en unas seis horas, si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante planificar con anticipación, ya que este método requiere preparación con unos días de anticipación.

No olvide que trabajar con inhibidores de moléculas pequeñas puede ser peligroso, así que siempre use guantes. La construcción de células humanizadas de mosca de la fruta se puede demostrar mediante la aplicación de tecnologías Crispr-Cas 9 y la sustitución de la Drosophila Kinesin-5 por su contraparte humana. El desarrollo de células humanizadas de Drosophila debería avanzar en nuestra comprensión de la corrección de errores y otros procesos celulares esenciales en el futuro.