En Vivo evaluación cuantitativa de la estructura miocárdica, la función, perfusión y viabilidad Usando computarizada micro-tomografía cardiaca
16 de febrero de 2016
Este método describe el uso de la tomografía microcomputarizada cuántica (MicroCT) para evaluar la morfología cardíaca, la función, la perfusión, el metabolismo y la viabilidad con el agente de contraste yodado en ratones con isquemia miocárdica inducida experimentalmente. La técnica se puede aplicar para la obtención de imágenes longitudinales in vivo no destructivas de alto rendimiento de varios modelos animales de enfermedades cardíacas humanas.
El objetivo general de este procedimiento es demostrar el uso de la microtomografía computarizada de alta velocidad en la obtención de imágenes con compuerta intrínseca cardiorespiratoria para evaluar las funciones miocárdicas globales y regionales en un modelo de isquemia cardíaca en ratón. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la fisiopatología cardíaca, como ¿cuáles son los efectos de la patología o de tratamientos farmacológicos sobre la función miocárdica global y regional? La principal ventaja de esta técnica es que proporciona una evaluación rápida, longitudinal y no invasiva de los parámetros cardíacos más importantes, que puede realizarse fácilmente por personal no especializado.
Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia de enfermedades cardiovasculares. Puede utilizarse como una herramienta preclínica para obtener una visión más profunda del desarrollo de enfermedades cardíacas. Nicole van Vliet, una técnica, junto con Elza van Deel, quien es posdoctoranda, e Yanto Ridwan, otro técnico de nuestro laboratorio, demostrarán el procedimiento.
Comience haciendo una pequeña incisión en la piel de un ratón de 12 semanas de edad entre la segunda y la tercera costilla. Luego, utilizando ganchos pequeños, separe los músculos del tórax para exponer los músculos intercostales. A continuación, use tijeras de resorte con hoja curva de dos milímetros para cortar cuidadosamente el tercer músculo intercostal sin dañar los pulmones.
Luego, utilizando fórceps, rompa el pericardio y use un trozo de gasa húmeda para separar los pulmones. Reposicione los ganchos hacia el interior del tórax de manera que sea visible una gran parte de la pared libre del ventrículo izquierdo y una porción de la aurícula izquierda. A continuación, utilizando la aurícula como punto de referencia para localizar la arteria coronaria izquierda, pase una sutura quirúrgica de seda siete ceros por debajo de la arteria coronaria izquierda y anude la sutura a dos milímetros por debajo del borde de la aurícula izquierda para estandarizar el tamaño del infarto.
Después de confirmar visualmente el éxito de la inducción del infarto mediante el palidecimiento de la pared libre del ventrículo izquierdo, insufle cuidadosamente el pulmón y cierre herméticamente el tórax con una sutura quirúrgica de seda seis ceros. Limpie la herida con solución salina y use más suturas de seda para cerrar la piel, seguido de la aplicación de un aerosol para heridas para estimular la cicatrización y prevenir infecciones. A continuación, coloque al ratón en una jaula sobre una almohadilla calefactora hasta que se recupere completamente.
Tres a cuatro horas después de la cirugía, encienda el escáner de microTC, abra el software de control del microTC y caliente el tubo de rayos X. Luego, trate el tapón de hule del vial de un agente de contraste yodado con alcohol al 70 % y use una jeringa de bajo volumen muerto para extraer entre cinco y diez microlitros del agente por gramo del peso corporal del animal. Después de eliminar las burbujas de aire, limpie la cola del ratón anestesiado con alcohol al 70 % y dilate con calor las venas de la cola.
Inyecte el agente de contraste en una vena lateral de la cola. Cuando aparezca el botón de modo en vivo en el software de control, el tubo de rayos X estará listo. Inserte la cubierta de pequeño orificio y la camilla para animales pequeños.
Haga clic en el botón de nueva base de datos en la ventana de la base de datos e ingrese un nombre para la nueva base de datos. Cuando aparezca el cuadro de diálogo, haga clic en el botón examinar y navegue hasta la unidad donde se guardará la base de datos. Luego haga clic en aceptar y observe la nueva base de datos en la ventana de la base de datos.
Para establecer las condiciones de escaneo, seleccione los parámetros adecuados. Coloque ahora el ratón inyectado y anestesiado sobre la camilla del animal en el escáner y deslice la puerta del instrumento hacia la derecha para activar el bloqueo de seguridad. Haga clic en el botón de modo en vivo para ver al sujeto en tiempo real y observe la ventana de captura de rayos X y al animal.
Pulse los botones de avance y retroceso del control del eje Z de la plataforma para mover la camilla del animal hasta que el tórax del ratón esté dentro del campo de visión. Luego, utilice las flechas izquierda y derecha del control de la camilla del animal para posicionar al animal dentro del cuadro delimitador azul. Seleccione 90 en la lista desplegable de control de rotación en la ventana del software de control y haga clic en el botón establecer para rotar el bastidor, asegurándose de que el animal permanezca dentro del cuadro delimitador azul de la ventana de captura X.
En la ventana de captura X, haga clic con el botón izquierdo del ratón para redimensionar la región de interés cardiorespiratoria. Arrastre los bordes para que las trazas cardiorespiratorias sean claramente visibles en la vista de sincronización. Presione la posición inicial y redimensione la región de interés para lo cardiorespiratorio.
Asegúrese de que la región de interés cubra el diafragma y la porción apical del corazón en todas las posiciones del gabinete. Luego gire el gabinete 90 grados para verificar que las trazas cardiorespiratorias sigan siendo claramente visibles. Cuando el animal esté en posición, haga clic en el botón de escaneo de TC para iniciar la adquisición.
Aparecerá el mensaje de confirmación de la tomografía computarizada. Haga clic en sí. El indicador rojo de activación de rayos X encenderá el instrumento y comenzará el escaneo.
Al finalizar el escaneo, observe las vistas transversal, coronal y sagital de las reconstrucciones en un software visor 2D. Finalmente, retire al animal del escáner y monitórelo hasta que se recupere completamente. Aquí se muestran secciones transversales representativas del compartimento sanguíneo en eje corto, en diástole final y sístole final, de un corazón de ratón con infarto de miocardio.
En estas imágenes, cortes transversales cortos axiales en diástole final y sístole final de un corazón de ratón sin infarto de miocardio muestran una excelente delimitación de la cavidad ventricular izquierda con poco ruido de fondo. Observe cómo las áreas de rarefacción del contraste, correspondientes al infarto de miocardio, se delimitaron claramente en las imágenes cortas axiales del corazón de ratón sometido a ligadura de la arteria coronaria descendente anterior izquierda. Pero no en el animal operado simulado.
De acuerdo con el modelo de 17 segmentos de la Asociación Americana del Corazón, el ventrículo izquierdo puede subdividirse en porciones cortas axiales basal, media y apical. En estos representativos gráficos polares circunferenciales, se observa claramente una perfusión desigual en los segmentos medio-anterior, medio-inferolateral, medio-anterolateral, apical anterior y apical lateral en el ratón con infarto de miocardio en comparación con el animal sometido a cirugía simulada. Una vez dominada, la inducción del infarto de miocardio puede completarse en 45 minutos, mientras que la posterior imagenología por microTC requiere cuatro horas.
Al intentar este procedimiento, es importante recordar que el rendimiento funcional cardíaco depende del tipo y grado de anestesia. Por lo tanto, para obtener mediciones precisas, la frecuencia cardíaca debe mantenerse lo más fisiológica posible durante la adquisición de imágenes. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la farmacología exploraran estrategias de intervención en ratones y analizaran el impacto de estrategias terapéuticas en la progresión de la enfermedad.
Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de la cirugía de infarto de miocardio y saber cómo utilizar el sistema de microCT de alta velocidad junto con el agente de contraste basado en yodo para el espacio vascular. No olvide que trabajar con isoflurano puede ser peligroso y que siempre se deben tomar precauciones, como una buena ventilación, al realizar este procedimiento.
Descripción general
Este método describe el uso de la microtomografía computarizada cuántica (microTC) para evaluar la morfología cardíaca, la función, la perfusión, el metabolismo y la viabilidad con un agente de contraste yodado en ratones con isquemia miocárdica inducida experimentalmente. La técnica permite una evaluación rápida, longitudinal y no invasiva de parámetros cardíacos críticos.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Cardiología
- Técnicas de Imagen
- Investigación Preclínica
Antecedentes
- La isquemia miocárdica es un modelo importante para el estudio de las enfermedades cardíacas.
- Las técnicas de imagen no invasivas son esenciales para estudios longitudinales.
- La microTC permite una evaluación detallada de la función y estructura cardíacas.
- Comprender la fisiopatología cardíaca es crucial para el desarrollo de terapias.
Objetivo del estudio
- Demostrar el uso de la microtomografía computarizada (MicroCT) para evaluar la función miocárdica.
- Evaluar los efectos de tratamientos sobre la patología cardíaca.
- Proporcionar información sobre el desarrollo de enfermedades cardíacas.
Métodos Utilizados
- Inducción de infarto de miocardio en ratones mediante técnicas quirúrgicas.
- Administración de agente de contraste yodado para imágenes.
- Uso de micro-TC para obtener imágenes cardíacas.
- Análisis de la morfología y función cardíaca mediante software de imágenes.
Resultados principales
- La inducción exitosa de infarto de miocardio se confirmó visualmente.
- La microCT proporcionó una delimitación clara de las cavidades del ventrículo izquierdo.
- Las áreas de rarefacción del contraste correspondientes al infarto se delimitaron adecuadamente.
- Se observaron diferencias en la perfusión entre corazones infartados y corazones sometidos a cirugía simulada.
Conclusiones
- La microTC es una herramienta valiosa para la obtención de imágenes cardíacas no invasivas.
- Esta técnica puede mejorar la comprensión de las enfermedades cardíacas.
- Permite una evaluación rápida de la función cardíaca en modelos preclínicos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este método permite una evaluación rápida, longitudinal y no invasiva de la estructura y función cardíacas en modelos preclínicos, apoyando la validación temprana de objetivos y la reducción de riesgos mecanicistas en el descubrimiento de fármacos cardiovasculares. Al proporcionar datos cuantitativos tridimensionales anatómicos y funcionales, mejora la confianza predictiva en la identificación de compuestos líderes y en las decisiones de avance preclínico. La técnica reduce la dependencia de puntos finales terminales y apoya flujos de trabajo escalables y reproducibles para equipos de I+D multifuncionales.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas mediante la evaluación cuantitativa de la función miocárdica global y regional en modelos de enfermedad.
- Valor operativo: Apoya la reducción del riesgo biológico al proporcionar un monitoreo longitudinal y no invasivo de la progresión de la patología cardíaca.
- Valor predictivo: Facilita la selección de carteras al ofrecer lecturas reproducibles de perfusión y viabilidad que se correlacionan con la eficacia terapéutica.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Listo para ensayo: Prepara sistemas biológicos validados para la evaluación posterior de compuestos mediante el establecimiento de la función cardíaca basal y la reproducibilidad del infarto.
- Resultados cuantitativos: Proporciona mediciones tridimensionales estandarizadas y de alta resolución de volúmenes ventriculares, movimiento de la pared y defectos de perfusión para la estandarización del ensayo.
- Escalabilidad para cribado: Permite la evaluación confiable de compuestos mediante la adquisición y análisis automatizados de imágenes compatibles con flujos de trabajo de alto rendimiento.
Investigación Translacional y Preclínica
- Relevancia para la enfermedad: Modela el infarto de miocardio humano mediante la oclusión permanente de la arteria descendente anterior, asegurando una continuidad traslacional desde el descubrimiento hasta la validación preclínica.
- Reducción mecanicista de riesgos: Proporciona una visión temprana de los efectos del tratamiento sobre el metabolismo y la viabilidad cardíacos, reduciendo la pérdida biológica en fases avanzadas.
- Avance ajustado al riesgo: Apoya las decisiones de continuar o no continuar al vincular puntos finales de imagen funcional con la relevancia fisiopatológica en modelos de enfermedad cardiovascular.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento desde la validación del blanco hasta la identificación de compuestos activos y la evaluación de la eficacia preclínica, permitiendo la evaluación iterativa de señales de seguridad cardíaca y eficacia.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías al cuantificar la disfunción miocárdica regional en modelos isquémicos.
- Selección: Garantiza la preparación del ensayo mediante imágenes con contraste reproducibles y protocolos estandarizados de inducción de infarto.
- Analítica: Proporciona variables dependientes cuantitativas, incluyendo la fracción de eyección, el grosor de la pared y el tamaño del defecto de perfusión, para comparaciones entre grupos.
- Investigación Traducional: Se conecta con la validación preclínica mediante el monitoreo longitudinal de los cambios metabólicos y de viabilidad tras la intervención.
- Reutilización Empresarial: Funciona como una plataforma de imagenología reutilizable en múltiples indicaciones cardiovasculares y modalidades terapéuticas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de objetivos al reducir la ambigüedad mecanicista en la fisiopatología cardíaca.
- Valor operativo: Mejora la estandarización y la reproducibilidad mediante compuertas automatizadas y protocolos estandarizados de administración de contraste.
- Valor estratégico: Mejora la eficiencia del capital al permitir la detección temprana de compuestos cardiotoxicos o ineficaces.
- Impacto en la cartera: Informa la priorización ajustada al riesgo mediante puntos finales objetivos y cuantitativos que respaldan las decisiones de avance.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en cirugía de animales pequeños, manejo de anestesia y operación de microTC.
- Depende de sistemas de microTC de alta velocidad con compatibilidad para compuestos de contraste yodados y sincronización cardiorrespiratoria.
- Requiere estandarización entre equipos de trabajo en los protocolos de inducción de infarto, administración de contraste y análisis de imágenes.
- Las consideraciones de adaptación incluyen ajustes específicos del modelo para la frecuencia cardíaca, frecuencia respiratoria y cinética del contraste entre especies.
- Las limitaciones prácticas incluyen restricciones por dosis de radiación en estudios longitudinales y la necesidad de agentes de contraste especializados, como eXIA160, para evaluación funcional.
