El seguimiento de las células en el pez cebra transgénico GFP-Uso del sistema de fotoconvertible PSmOrange
5 de febrero de 2016
Establecimos el sistema fotoconvertible PSmOrange como una herramienta potente, sencilla y económica para el seguimiento de células in vivo en fondos transgénicos GFP. Este protocolo describe su aplicación en el sistema modelo de pez cebra.
El objetivo general de la tecnología de conversión fotográfica PSmOrange es rastrear las células en el animal vivo durante el desarrollo embrionario y la enfermedad. Este método puede responder a preguntas clave en la biología del desarrollo, como descubrir el origen de las células que se convierten en tejidos y órganos. La principal ventaja de esta técnica es que se puede aplicar en fondos transgénicos GFP.
Este método también se puede aplicar en diferentes campos de investigación como la regeneración, la progresión tumoral y la invasión. Después de generar e incrustar embriones que expresan PSmOrange y GFP de acuerdo con el protocolo de texto, coloque el embrión bajo el microscopio confocal y use el objetivo de aire 20x y los láseres de 488 y 561 nanómetros para escanear la muestra e identificar un área para fotoconvertir. Para detectar la proteína PSmOrange antes de la fotoconversión, utilice el láser de 561 nanómetros a 0,74 milivatios de potencia medida en el plano de enfoque por encima del objetivo y ajuste la potencia del láser según sea necesario.
Ajuste los factores de zoom para resaltar el área de interés y reducir el tiempo de adquisición de imágenes y la toxicidad de las fotos. Utilizando los láseres de 488 y 561 nanómetros en modo secuencial y un paso Z entre 1,0 y 2,0 micrómetros, adquiera una pila Z que cubra las estructuras de interés. Ajuste el promedio de línea y la frecuencia de escaneo para optimizar la calidad de la imagen.
A continuación, escanee la muestra y seleccione la región de interés, o la herramienta de ROI, para resaltar el área a fotoconvertir antes de fijar el ROI como el área de estimulación. Seleccione el módulo de blanqueo de fotoactivación, marque la casilla para activar el láser de 488 nanómetros, luego configure el láser de 488 nanómetros al 80% y la velocidad de escaneo a 0,5 segundos por fotograma. A continuación, abra la utilidad de fotoconversión y haga clic en Agregar'para especificar el protocolo de fotoconversión.
En el menú de estimulación de adquisición, configure Phase One en adquisición y en el menú de bucles, indique el número de imágenes que se adquirirán antes de la fotoconversión. Establezca la Fase Dos en estimulación e introduzca el número de eventos de estimulación que se van a realizar. Ajuste la Fase Tres como se describe para la Fase Uno.
Opcionalmente, inserte una Fase de Espera después de la Fase Dos introduciendo el tiempo de espera antes de la última ronda de adquisición de imágenes. Una vez configurados los parámetros, aplique la configuración de estimulación y ejecute la fotoconversión. Los ajustes miscroscópicos son cruciales para la fotoconversión de PSmOrange.
Para garantizar una fotoconversión exitosa, el embrión se visualiza directamente después del experimento para detectar la proteína PSmOrange fotoconvertida. Si la conversión no se ha realizado correctamente, se repite el procedimiento. Usando los láseres de 488, 561 y 640 nanómetros, y configurando el láser de 640 nanómetros a alta potencia, hasta 4,5 milivatios, adquiera una pila z final con los ajustes que se acaban de describir.
Para desmontar el embrión, retire la cámara del microscopio y use fórceps para extraer el embrión de la agarosa. Transfiera el embrión a una nueva placa de Petri de plástico esterilizada, o a una placa esterilizada de 6 pocillos, que contenga 0,2 milimolares de PTU en E3. Incubar el embrión a 28 grados centígrados hasta la etapa de desarrollo deseada. Para analizar el destino de las células fotoconvertidas que expresan la proteína PSmOrange, se volvió a incrustar el embrión de acuerdo con el protocolo de texto.
Bajo el miscroscopio confocal, escanee la muestra para identificar las células fotoconvertidas en la estructura transgénica GFP de interés. Utilice los láseres de 488, 561 y 640 nanómetros para adquirir una pila z con una pila fija de 1 a 2 micrómetros en modo secuencial que cubre las estructuras. Utilizando el software Image J Fiji, identifique las células que co-expresan GFP y la proteína fotoconvertida.
Duplique la pila original, use el complemento Desenfoque gaussiano y la calculadora de imágenes para restar las pilas suaves del original. Aplique umbrales específicos a los canales verde y rojo lejano para resaltar las células fotoconvertidas. A continuación, utilice la herramienta Analizar partículas para detectar las áreas de umbral en el canal verde con una configuración adecuada.
Repita este paso para el canal rojo lejano. Abra el complemento de calculadora de imágenes para detectar las celdas colocalizadas. Muestre en amarillo los ROI superpuestos en el canal verde o en el canal rojo lejano con la herramienta Analizar partículas.
Con el software NIS-Elements, lleve a cabo una evaluación de fechas en 3D y muestre la pila en 3D utilizando la opción Mostrar vista de volumen. A continuación, utilice la interfaz gráfica para seleccionar los canales verde, rojo y rojo lejano, ajuste el brillo y el contraste y recorte la pila 3D para resaltar el área fotoconvertida. Aquí se muestra un ejemplo del sistema de fotocoversión PSmOrange en embriones transgénicos de cabeza flotante GFP FOXD3 de pez cebra.
A las 26 horas después de la fertilización, dos grupos de células en la parte anterior de la pineal fueron fotoconvertidos e inmediatamente tomados de imagen. La proteína se detectó con un láser rojo lejano de 640 nanómetros, pero no con un láser de 561 nanómetros. En estas células, la expresión de GFP se redujo inicialmente debido al fotoblanqueo.
A los 52 HPF, se detectaron GFP y H2B PSmOrange en las células fotoconvertidas que expresan la proteína H2B PSmOrange. Algunas de estas células formaron el parapineal en el lado izquierdo del cerebro. Este resultado es consistente con informes previos sobre el origen de la célula parapineal en la pineal anterior y muestra la aplicabilidad de la técnica PSmOrange en el embrión vivo de vertebrado transgénico GFP.
Siguiendo este procedimiento, el análisis de seguimiento celular se puede realizar en embriones manipulados genéticamente con el fin de responder preguntas adicionales sobre las jerarquías moleculares que subyacen al desarrollo de la célula.
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Resumen
El sistema PSmOrange es una herramienta rentable para el seguimiento celular in vivo en fondos transgénicos de GFP, particularmente en modelos de pez cebra. Este protocolo facilita el estudio del origen celular durante el desarrollo embrionario y las enfermedades.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Biología del desarrollo
- Seguimiento celular
- Desarrollo embrionario
Antecedentes
- La tecnología de conversión fotoactiva PSmOrange permite el seguimiento de células en organismos vivos.
- Este método es aplicable en diversos campos de investigación, incluyendo la regeneración y la progresión tumoral.
- Puede utilizarse en fondos transgénicos de GFP, lo que aumenta su versatilidad.
- Se emplea microscopía confocal para la visualización y la fotoconversión de células.
Objetivo del estudio
- Para rastrear células durante el desarrollo embrionario y los procesos de enfermedad.
- Para descubrir el origen de las células que se desarrollan en tejidos y órganos.
- Para obtener información sobre los comportamientos celulares en diversos contextos biológicos.
Métodos Utilizados
- Generación de embriones que expresan PSmOrange y GFP.
- Inclusión de embriones para el análisis mediante microscopía confocal.
- Uso de láseres de 488 y 561 nm para la obtención de imágenes.
- Fotoconversión de la proteína PSmOrange con fines de seguimiento.
Resultados principales
- Seguimiento exitoso de células en modelos de pez cebra utilizando el sistema PSmOrange.
- Capacidad demostrada para visualizar los orígenes y comportamientos celulares.
- Se destacó la aplicabilidad del método en diversas áreas de investigación biológica.
- Se proporcionó un protocolo sencillo que los investigadores pueden seguir.
Conclusiones
- El sistema PSmOrange es una herramienta eficaz para el seguimiento celular in vivo.
- Ofrece ventajas significativas en el estudio de la biología del desarrollo.
- Este método puede mejorar la comprensión de procesos biológicos complejos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El sistema de proteína fotoconvertible PSmOrange permite un seguimiento celular preciso in vivo en embriones de pez cebra transgénicos para GFP, abordando una limitación clave en la investigación de biología del desarrollo donde las líneas transgénicas existentes carecen de reporteros compatibles para el rastreo de linajes. Esta capacidad apoya la reducción mecanicista de riesgos en la validación de dianas al permitir la visualización directa de los orígenes celulares y las decisiones de destino celular en sistemas relevantes para enfermedades, particularmente en aplicaciones de oncología y medicina regenerativa que implican progresión tumoral, invasión y regeneración de tejidos. El método mejora la confianza predictiva en modelos preclínicos al proporcionar datos cuantitativos y resueltos espacialmente sobre la migración y diferenciación celular dentro de organismos intactos y vivos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la verificación de hipótesis terapéuticas mediante el seguimiento de poblaciones celulares definidas en líneas transgénicas para aclarar los orígenes celulares de tejidos y órganos.
- Valor operativo: Compatible con líneas transgénicas de GFP existentes, lo que elimina la necesidad de generar nuevos promotores y reduce el tiempo de desarrollo de modelos.
- Valor predictivo: Facilita la reducción de riesgos biológicos mediante la observación directa de las decisiones del destino celular, mejorando la confianza en las asociaciones entre dianas y mecanismos de enfermedad.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Genera datos espaciales y temporales cuantificables sobre la migración de células fotoconvertidas, lo que permite comparaciones objetivas de perturbaciones genéticas o farmacológicas.
- Valor operativo: Utiliza microscopía confocal estándar con excitación láser secuencial (488, 561, 640 nm), sin requerir equipos especializados más allá de los núcleos de imagen típicos.
- Escalabilidad: Compatible con imágenes 3D de alta resolución y herramientas de postprocesamiento (ImageJ Fiji, NIS-Elements) para análisis de co-localización reproducible con GFP.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Relevancia para la enfermedad: Aplicable directamente al estudio de modelos de invasión y metástasis de células tumorales en modelos de cáncer xenoinjertados o transgénicos en pez cebra.
- Continuidad traslacional: Permite una transición fluida desde el descubrimiento (seguimiento del origen celular) hasta la validación preclínica mediante el monitoreo de la injertación, migración e integración de células fotoconvertidas in vivo.
- Decisiones ajustadas al riesgo: Proporciona puntos finales visuales y cuantitativos para tomar decisiones de avance o suspensión en las primeras etapas del desarrollo preclínico, basadas en el comportamiento celular en contextos relevantes para la enfermedad.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El sistema PSmOrange se integra en la fase de descubrimiento temprano hasta la preclínica, actuando como una herramienta de cribado fenotípico y validación mecanicista que conecta la manipulación genética con lecturas funcionales celulares en modelos vertebrales vivos.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis al permitir el mapeo del destino de poblaciones celulares específicas en respuesta a perturbaciones genéticas o ambientales en embriones transgénicos GFP.
- Tamizaje: Genera salidas cuantitativas estandarizadas y reproducibles (porcentajes de co-localización, distancias de migración) adecuadas para ensayos de compuestos o supresores/mejoradores genéticos.
- Análisis: Produce datos de fluorescencia multicanal (GFP, PSmOrange naranja/rojo, PSmOrange fotoconvertido en infrarrojo lejano) que permiten un análisis riguroso de co-localización y partículas para fenotipado objetivo.
- Investigación Traducional: Se conecta con trabajos preclínicos mediante el seguimiento del comportamiento celular en modelos de regeneración y progresión tumoral, aportando información sobre la validez mecanicista de los blancos.
- Reutilización Empresarial: Representa una capacidad de plataforma reutilizable; la inyección de ARNm permite una implementación rápida en múltiples líneas transgénicas sin necesidad de generar nuevas cepas estables.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista en la validación de objetivos al proporcionar evidencia visual directa de la dinámica celular en organismos intactos.
- Valor operativo: Permite la estandarización entre laboratorios mediante protocolos definidos de fotoconversión y ajustes láser (488 nm al 80 % de potencia, 0,5 s/imagen; 640 nm hasta 4,5 mW para la detección).
- Valor estratégico: Mejora la eficiencia del capital aprovechando los recursos transgénicos existentes de GFP, evitando la identificación costosa de promotores de novo y la generación de líneas.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo al proporcionar datos funcionales tempranos in vivo sobre el comportamiento celular, reduciendo los fracasos en fases avanzadas debido a la complejidad biológica no anticipada.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en microscopía confocal, técnicas de fotoconversión y separación espectral de fluorescencia.
- Depende del acceso a sistemas confocales de barrido láser con láseres de 488, 561 y 640 nm y conjuntos de filtros adecuados.
- Necesita la estandarización de la selección de regiones de interés (ROI), potencia del láser, velocidad de escaneo y parámetros de z-stack entre diferentes usuarios para obtener resultados reproducibles.
- La adaptación a especies de teleósteos no pertenecientes al pez cebra puede requerir la optimización de la dosis de ARNm y la eficiencia de fotoconversión.
- Limitación práctica: La eficiencia de fotoconversión depende de los niveles de expresión proteica y de la accesibilidad de las células diana a la penetración del láser en tejidos más gruesos.
