Usando Tomoauto: Un protocolo para la de alto rendimiento automatizado tomografía crioelectrónica
30 de enero de 2016
Se presenta un protocolo sobre cómo utilizar la crio-tomografía electrónica de alto rendimiento para determinar alta resolución en las estructuras in situ de máquinas moleculares. El protocolo permite que grandes cantidades de datos a procesar, evita los cuellos de botella comunes y reduce el tiempo de inactividad de los recursos, lo que permite al usuario centrarse en cuestiones biológicas importantes.
El objetivo general de este procedimiento es ayudar a los usuarios a establecer una línea de recolección y procesamiento de alto rendimiento de tomografía crioelectrónica. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la crio-tomorgrafía electrónica, tales como: ¿cómo manejo los datos recopilados con detectores de nueva generación y proceso una gran cantidad de datos producidos por el software automatizado de recolección de series de inclinación? La principal ventaja de esta técnica es que el usuario puede configurar múltiples paquetes de software de manera unificadora, para encontrar una tubería eficiente para el procesamiento automatizado de series de inclinación, lo que permite dedicar más tiempo al análisis de tomografías.
Por lo general, las personas nuevas en la crio-ET tendrán dificultades porque se requieren muchos pasos tediosos para manejar datos masivos generados por el microscopio electrónico. Tuvimos la idea de este desarrollo por primera vez hace cinco años, cuando tuvimos que pasar manualmente por cientos de pasos para obtener una reconstrucción en 3D de una bacteria. Con anticipación, consulte el protocolo de texto sobre la preparación de las miniceldas Shigella flexneri.
A continuación, prepare las cuadrículas de microscopía electrónica tal y como se explica en una publicación existente de JoVE y también se documenta en el protocolo de texto. Después de haber cargado la etapa EM con la colección de miniceldas incrustadas en hielo vitrificado, comience a recopilar mapas de bajo aumento para la serie de inclinación. Mientras visualiza la pantalla fluorescente con un aumento bajo, de aproximadamente 2300x, encuentre cuadrados de cuadrícula que sean aceptables para la imagen.
Esta ubicación debe contener hielo fino y el tema de interés sin contaminantes. A continuación, ajuste la vista al centro del cuadrado de la cuadrícula y haga clic en el botón Agregar posición del escenario para guardar la ubicación. Luego, repita el proceso hasta que se haya guardado la ubicación de todos los cuadrados de la cuadrícula aceptables.
El siguiente paso comienza con la apertura de un nuevo archivo de montaje. En el cuadro de diálogo de configuración, establezca X e Y de modo que se capture todo el cuadrado de la cuadrícula. Para una cuadrícula estándar de malla de 200, haga un espacio de 10 por 10 con un valor de agrupación alto, como ocho.
También alterna la opción de mover la etapa en lugar de cambiar la imagen y la opción de omitir correlaciones utilizadas para alinear piezas. Ahora, en la ventana del Navegador, seleccione la primera posición de la etapa que se adquirirá mediante el botón de alternancia Adquirir. Continúe haciendo esto para cada posición de la etapa.
A continuación, en el menú Navegador, haga clic en Adquirir en puntos. En el cuadro de diálogo que se abre, active la opción adquirir imagen de mapa y la eucentricidad aproximada. Desactiva todas las demás opciones.
A continuación, haz clic en continuar y se realizará un montaje para cada posición del escenario. Continúe trabajando con el software SerialEM. En el Navegador, seleccione los mapas adquiridos y haga clic en Cargar mapa.
A continuación, haga clic en Añadir puntos y seleccione los puntos del mapa en los que se debe adquirir la serie de inclinación. Después de realizar las selecciones, haga clic en Dejar de agregar puntos y repita el proceso con cada mapa recopilado. A continuación, abra los parámetros en el menú Cámara y configure los modos Enfoque, Prueba y Grabar.
La opción de registrar datos fraccionados de dosis puede ser de especial interés, y se puede especificar en las opciones de registro. Para continuar, seleccione uno de los puntos en el mapa que se está visualizando actualmente y active la opción tilt-series en la ventana del Navegador. En el cuadro de diálogo que se abre, elija los parámetros para la serie de inclinación.
A continuación, repita el proceso de alternar la opción de serie de inclinación para cada uno de los puntos seleccionados en el mapa. A continuación, desde el Navegador inicie la opción Adquirir en Puntos. En el cuadro de diálogo, alterne las Tareas preliminares, Realinear con el elemento, Enfoque automático y Eucentricidad aproximada.
A continuación, establezca la tarea principal para adquirir tilt-series y elija close column vals at end para cerrar la columna cuando se hayan recopilado todos los puntos. Cuando se ejecuta el proceso, se recopilará una serie de inclinación en cada punto modificado para la recopilación de series de inclinación en cada mapa. Con la serie de inclinación original, el registro de salida de SerialEM y las imágenes individuales fraccionadas por dosis, todas en el directorio de trabajo actual, en un terminal, ejecute el siguiente comando para eliminar el artefacto de movimiento inducido por el haz.
Proceda con la alineación y reconstrucción de la serie de inclinación. Escriba el comando tomoauto en el terminal de la siguiente manera. Al comando, agregue el nombre de archivo de la serie tilt-to process, seguido del diámetro fiducial en nanómetros.
Si no desea el procesamiento CTF, simplemente omita la opción del comando. Este comando es el uso principal de tomoauto, ya que permite a los usuarios ejecutar todos los procesos involucrados en la alineación de una serie de inclinación, que originalmente requerían la intervención manual del usuario, en un solo comando, lo que permite a los usuarios programar rápidamente el procesamiento por lotes. Ahora, usando el comando 3dmod, revise la serie de inclinación alineada para ver si hay errores evidentes.
Aquí, filename es el nombre de la serie tilt sin sufijo. Luego, inspeccione el CTF estimado con el comando que se muestra aquí. De nuevo, filename es el nombre de la serie tilt sin sufijo.
Además, en el registro de salida producido por el comando tomoauto, verifique el error residual de la alineación. Se trata de una medida cuantitativa de la calidad general de la alineación. Si la alineación es aceptable, proceda con el cálculo de la reconstrucción.
Este comando se configura para corregir el CTF y borrar los marcadores de referencia utilizados en la alineación de la serie de inclinación. Para omitir la inspección visual e ir directamente a la reconstrucción, use este comando. Tomoauto tiene muchas opciones accesibles.
Una en particular es la posibilidad de incluir configuraciones locales descritas por un fichero auxiliar, según la documentación de tomoauto. Incluya el nombre de este archivo en el cuadro de diálogo de la línea de comandos mediante la opción de configuración local antes de anexar el nombre de archivo de la serie tilt. La capacidad de crear archivos de configuración local es la característica más potente de tomoauto, ya que permite a los usuarios configurar completamente cada comando utilizado, ajustando la ejecución a conjuntos de datos específicos o difíciles mientras se mantiene el procesamiento automatizado.
Dentro del protocolo de prueba hay instrucciones adicionales sobre cómo ejecutar el promedio de subtomograma. Siguiendo los protocolos descritos, se realizaron dos series de tilt alineadas con tomoauto. La alineación fina se calcula a partir de un modelo que define idealmente las coordenadas del marcador de referencia.
A 50 grados, una serie de inclinación rastreó las partículas de oro correctamente, lo que indica una alineación aceptable. Mientras que, en el caso de la segunda serie de inclinación, varios puntos del modelo, mostrados en rojo, se desviaban de su marcador dorado correspondiente, la ilustración del modelo no producía una alineación adecuada. Cuando se recopilan series de inclinación, tomoauto alinea con éxito entre el 80 y el 90% de la serie de inclinación recopilada.
Después de la reconstrucción, el tomograma final es un volumen 3D de la muestra de imagen. Esto se puede utilizar para la anotación celular por segmentación o el promedio de subtomografía para obtener información de mayor resolución de la maquinaria molecular dentro de la muestra. El promedio de 2,7 nanómetros del sub-tomograma de la Shigella flexneri adherida depositada en el EMDB muestra la gran mejora de esta técnica en comparación con la visualización del inyectosoma en un solo tomograma.
Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo recopilar y procesar datos de tomografía crioelectrónica utilizando SerialEM y tomoauto de manera automatizada y de alto rendimiento. Una vez dominada, esta técnica se puede utilizar para recopilar casi 100 series de inclinación en un día, si se realiza correctamente, y alinear una serie de inclinación en 20 minutos. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que siempre debe verificar la calidad de la alineación de la serie de inclinación.
Si un conjunto de series de inclinación no se alinea bien, intente alinear manualmente y transfiera los parámetros a una configuración local. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como el promedio de subtomografías, para responder preguntas adicionales, como determinar la estructura de mayor resolución de los complejos macromoleculares. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la crio-EM exploraran estructuras in situ de alta resolución en bacterias, virus y otros organismos.
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Descripción general
Este protocolo describe un método de tomografía electrónica criogénica de alto rendimiento para determinar estructuras tridimensionales a alta resolución de máquinas moleculares en su entorno natural. Optimiza el procesamiento de datos, minimiza los cuellos de botella y reduce el tiempo de inactividad de los recursos, permitiendo a los investigadores concentrarse en preguntas biológicas significativas.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Tomografía electrónica criogénica
- Biología molecular
- Biología estructural
Antecedentes
- Canalización de recopilación y procesamiento de alto rendimiento para tomografía electrónica criogénica.
- Dificultades en el manejo de datos provenientes de detectores de nueva generación.
- Necesidad de un procesamiento eficiente de grandes conjuntos de datos procedentes de la recopilación automatizada de series de inclinación.
- Contexto histórico del manejo manual de datos en criotomografía electrónica.
Objetivo del estudio
- Establecer un protocolo optimizado para la tomografía electrónica criogénica.
- Facilitar el procesamiento automatizado de series de inclinación.
- Mejorar la eficiencia del análisis de tomogramas.
Métodos Utilizados
- Protocolo de tomografía electrónica criogénica de alto rendimiento.
- Configuración de múltiples paquetes de software para el procesamiento de datos.
- Técnicas automatizadas de adquisición de series de inclinación.
- Preparación de minicélulas de Shigella flexneri para análisis.
Resultados principales
- Reducción de pasos tediosos necesarios para el manejo de datos.
- Mayor eficiencia en el procesamiento de conjuntos grandes de datos.
- Enfoque mejorado en preguntas biológicas mediante un flujo de trabajo optimizado.
- Aplicación exitosa del protocolo en la generación de reconstrucciones 3D.
Conclusiones
- El protocolo simplifica significativamente el proceso de tomografía electrónica criogénica.
- Permite a los investigadores dedicar más tiempo al análisis en lugar del procesamiento de datos.
- Las aplicaciones futuras podrían mejorar aún más nuestra comprensión de las máquinas moleculares.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La tomografía crioelectrónica de alto rendimiento aborda el cuello de botella en el procesamiento de datos en biología estructural, permitiendo la generación rápida de complejos macromoleculares tridimensionales en contextos celulares nativos. Al automatizar la adquisición y alineación de series de inclinación, el método reduce la intervención manual y acelera los flujos de trabajo de validación de objetivos en las fases iniciales del descubrimiento. Esto respalda la confianza predictiva en la reducción de riesgos mecanicistas para programas de objetivos antimicrobianos y de virulencia.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la visualización de máquinas macromoleculares intactas, como los sistemas de secreción de tipo III, en estados casi nativos para la interrogación de dianas funcionales.
- Valor operativo: Reduce el tiempo dedicado al manejo manual de datos, permitiendo a los científicos centrarse en la prueba de hipótesis biológicas en lugar de en cuellos de botella de procesamiento.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Genera promedios de subtomogramas que mejoran el contraste y la resolución para la fenotipificación estructural confiable de dianas terapéuticas.
- Valor operativo: Estandariza la recopilación y el procesamiento de datos mediante tomoauto, posibilitando resultados reproducibles en grandes conjuntos de datos para la preparación de ensayos.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Valor científico: Proporciona reconstrucciones tridimensionales con una resolución de ~2,7 nm para apoyar la comprensión mecanicista de complejos de virulencia en sistemas relevantes para enfermedades.
- Valor operativo: Facilita la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica mediante la generación de datos estructurales cuantificables para la priorización de objetivos.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se integra en la continuidad del descubrimiento, desde la validación del blanco hasta la optimización del fármaco líder, al proporcionar información estructural de alta resolución sobre complejos macromoleculares in situ.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías mediante la visualización de ensamblajes macromoleculares en entornos celulares nativos.
- Selección: Permite la estandarización de ensayos mediante el procesamiento automatizado de series de inclinación y métricas cuantitativas de calidad de alineación.
- Análisis: Proporciona mediciones de error residual a partir de los registros de salida de tomoauto como indicadores objetivos de la calidad del alineación para decisiones basadas en datos.
- Investigación Traducional: Conecta los datos estructurales con el avance preclínico al resolver complejos en estados mutantes o condicionados para el diseño guiado por estructura.
- Reutilización Empresarial: Establece una tubería reutilizable y configurable mediante archivos de configuración local en tomoauto para una aplicación consistente en diversos objetivos y conjuntos de datos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de objetivos al reducir la ambigüedad mecanicista mediante imágenes in situ de alta resolución.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad y escalabilidad, permitiendo casi 100 series de inclinación por día y alineación en aproximadamente 20 minutos por serie.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al proporcionar datos estructurales confiables en etapas tempranas del proceso de descubrimiento, reduciendo el riesgo biológico en fases avanzadas.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de objetivos basada en estados estructurales resolubles y dinámicas complejas.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en microscopía electrónica criogénica, operación de SerialEM y procesamiento mediante línea de comandos de tomoauto.
- Depende de un microscopio electrónico criogénico de 300 kV equipado con cámara de detección directa e infraestructura computacional para el alineamiento y reconstrucción de series de inclinación.
- Necesita estandarización entre equipos en la preparación de rejillas, nomenclatura de datos y archivos de configuración local para un procesamiento consistente.
- Implica consideraciones de adaptación frente a variaciones en el grosor del hielo, contaminación de la muestra y marcado con marcadores fiduciales en diferentes sistemas modelo.
- Incluye limitaciones prácticas, como tasas de éxito en el alineamiento del 80–90 % para las series de inclinación recopiladas, lo que requiere intervención manual en los casos fallidos.
