Name: Un ensayo de PCR digital de dos vías para la cuantificación simultánea de la Enterococcus spp. Y el marcador asociado HF183-fecal humana en las aguas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 14 s
Description: Aprende a realizar un ensayo de PCR digital dúplex para cuantificar simultáneamente Enterococcus spp. y el marcador HF183 en aguas recreativas. Este método elimina curvas estándar y reduce sesgos en el monitoreo de calidad del agua.

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Los autores no tienen agradecimientos.

1. Ensayo de la preparación de mezclas <ol><li> Hacer concentraciones de 100 mmol / L de existencias para todos los cebadores en el agua de grado molecular y sondas en TE pH 8. [Entero F1A, Entero R1, GPL813TQ 12; HF183-1, BthetR1, BthetP1 3]. Nota: Las sondas para los dos objetivos se marcaron con fluorescencia diferentes fluoróforos 7, como se indica en la Lista de Materiales / Equipos. </li><li> Preparar la mezcla maestra mezclando, por reacción planificada, 12 l digital de mezcla de PCR (2x madre, véase Lista de Materiales / Equipos), 0.216 l cada uno hacia adelante y el cebador, 0,06 l cada una sonda fluorescente inversa, y 5.016 l de agua libre de nucleasa (concentración final : 900 nM de cada cebador, 250 nM de cada sonda). Pipetear arriba y abajo al menos 10 veces para mezclar, teniendo la precaución de no introducir burbujas de aire en la solución. </li><li> Pipeta de 18 l maestro de la mezcla (del paso 1.2) en un tubo de PCR regular o plato, mezcla en molde de ADN 6 l (extraído como se describe Previouastuta 13) para hacer mezcla de ensayo para la generación de gotas. Si el análisis de muestras por duplicado, pipeta de 36 l de mezcla maestra y 12 l plantilla de ADN en cada pocillo. Deje los pocillos duplicados correspondientes vacío en el plato. Se deben incluir controles positivos (véase la lista de materiales / equipo) y no hay controles de plantilla (NTC) (es decir, con agua de grado molecular utilizada como plantilla). Nota: El control positivo es necesario para garantizar el ensayo está funcionando correctamente y el NTC es necesario para asegurar que no hay contaminación dentro de la placa y para establecer la línea de base fluorescente más adelante en el análisis de datos. Se recomienda a los usuarios de primera vez de usar las dos muestras de ADN sin diluir y diluidas. </li></ol> 2. Generación de la gotita y PCR Plate Setup <ol><li> Mezclar las mezclas de ensayo pipeteando arriba hacia abajo aproximadamente 15 veces usando una pipeta multicanal. Asegúrese de que la punta de la pipeta se mantiene dentro de líquido para evitar que el exceso de burbujas dentro de la mezcla. </li><li> insert cartucho 1 (que contiene 8 pocillos) en un soporte de cartucho en blanco y haga clic en el soporte del cartucho cerrada. Cartucho 1 es ahora firmemente en su lugar y no puede ser desalojado del soporte mientras que la generación de gotitas. Usando una pipeta multicanal, transferir suavemente 20 l de mezcla de ensayo en la posición media del cartucho de marcado &#39;Sample&#39; sin introducir burbujas de aire. </li><li> Pipetear en 70 l de aceite de generación de gotas hacia el lado izquierdo del cartucho (marcado &quot;Aceite&quot;). </li><li> cartucho de tapa con una junta asegurándose de que la junta es plana y se mantiene de manera uniforme por el 4 garrapatas hacia el borde del cartucho. Presione el botón de luz verde en el generador de gotas para abrir y colocar el cartucho. Pulse el botón verde iluminado de nuevo para cerrar el generador. Nota: Una vez que la puerta se cierra, el botón está atenuado, la puerta no puede ser reabierto y la generación de gotas comienza inmediatamente continua durante aproximadamente 1 min. </li><li> Si hace más de 8 reacciones, el lugar de cartucho 2 en un segundosoporte del cartucho de blanco y preparar de la misma manera como el cartucho 1 mientras que la generación de gotitas está en curso para ahorrar tiempo de instalación total. </li><li> Abra la puerta del generador de gotas cuando el botón de encendido se ilumina en verde tenue que indica la finalización de la generación de gotas. Retire el soporte blanco cartucho que contiene el cartucho 1, a un lado, y el lugar cartucho 2 en el generador de gotas. </li><li> Retire la junta de cartucho 1 y desechar. transferir suavemente el volumen total (aproximadamente 40 l) de las gotas generadas a partir de la tercera columna del cartucho (marcado &#39;Gotitas&#39;) sobre una placa de PCR final (mantenida a temperatura ambiente), durante el ciclo térmico. Nota: No unclick el soporte del cartucho blanco como la acción puede romper las gotas generadas recientemente; solamente abrir el soporte de cartucho después de que las gotitas se han transferido a la placa final. </li><li> Repita los pasos 2.1-2.7 para muestras adicionales. </li><li> Cuando todas las gotas están en la placa de PCR final, coloque un penetrablecubierta de aluminio en la parte superior de la placa y colóquela sobre una lámina de plástico. Ajuste el sellador a 180 ° C, pulse &quot;Play&quot; en el sellador y dejar sellado durante 10 s. </li></ol> 3. ciclos térmicos y de lectura de la gotita <ol><li> Coloque la placa de sellado en el termociclador, uno compatible con la placa de PCR final utilizada en el paso 2.7, y una velocidad de rampa de temperatura de 2,0 ° C / seg. </li><li> Ejecutar el programa térmico de la siguiente manera: 10 min a 95 ° C, seguido de 40 ciclos de 30 segundos a 94 ° C y 60 seg a 60 ° C, seguido de un mantenimiento de 10 min a 98 ° C (opcional: asimiento final en 4 o 15 ° C). </li><li> Una vez finalizado el ciclismo, la transferencia de la placa a un lector de gota para la medición automática de la fluorescencia en cada gotita en cada pocillo. Alternativamente, la placa de almacenar a 4 ° C durante hasta 3 días antes de la lectura de las gotas. Asegúrese de que las gotas estén a temperatura ambiente antes de proceder a la lectura. <ol><li> Abra el software que acompaña a la configuración de la lectura de las gotas. Enel menú por defecto &#39;Configuración&#39; que contiene un esquema de una placa de vacío 96, haga doble clic en el pocillo A1 para abrir el menú contiene tres secciones: &#39;ejemplo,&#39; &#39;Ensayo 1&#39; y &#39;Ensayo 2.&#39; </li><li> En la sección &quot;muestra&quot; escriba el ID de la muestra en la casilla &quot;Nombre&quot; y pulse Enter o marcar la casilla a la derecha marcada &#39;Aplicar&#39;. A continuación, haga clic en el menú desplegable etiquetada &#39;Experimento&#39; y seleccione &#39;RED&#39; (detección de eventos raros) y haga clic en entrar. </li><li> Mover a la sección denotada &#39;Ensayo 1.&#39; En la sección &quot;Nombre&quot; llenar el ensayo (por ejemplo, Enterococcus) y haga clic en entrar. En el cuadro de abajo titulada &#39;Tipo&#39; haga clic en el menú desplegable y seleccione &quot;Canal 1 Desconocido &#39;y haga clic en entrar. </li><li> Mover a la sección denotada &#39;Ensayo 2.&#39; En la sección &quot;Nombre&quot; llenar el ensayo (por ejemplo, HF183) y haga clic en entrar. En el cuadro de abajo titulada &#39;Tipo&#39;, haga clic en el menú desplegable de un menúd Seleccione &#39;Channel 2 Unknown &quot;y haga clic en entrar. Toda la información de los pasos 3.3.2 a 3.3.4 está ahora presente en el pocillo A1. </li><li> Nombre de todas las subsiguientes pozos que contienen gotitas. Para ahorrar tiempo de configuración total, haga clic &#39;Shift&#39; o &#39;Ctrl&#39; para seleccionar múltiples pozos simultáneamente. </li><li> Cuando la representación digital de la placa refleja la placa física, pulse &quot;OK&quot; en la parte inferior derecha del menú. En el nuevo menú que aparece en la parte superior de la placa esquemática, en la sección &#39;Plantilla&#39; elige &quot;Guardar como&quot; y el nombre y guardar la placa. </li><li> A la izquierda de la pantalla, haga clic en &quot;Ejecutar&quot; y seleccione apropiada Conjunto colorante presente en la ventana pop-out &quot;Opciones de ejecución&quot;. La recolección de datos se inicia y se visualiza en tiempo real en el software. </li></ol></li></ol> 4. Análisis de los datos y generación de informes <ol><li> Cuando el lector ha terminado y una caja aparece que indica &quot;carrera completa&quot;, haga clic en &#39;Aceptar&#39;. Nota: El suavecerámica muestra el archivo de datos final, en la sección &quot;Analizar&quot; del software. En este punto de vista, el software tiene todos los pocillos de la placa y seleccionadas por defecto a la trama de datos &#39;2D Amplitud&#39;. </li><li> Compruebe la separación entre las gotitas positivos y negativos. Asegúrese de que la fluorescencia en todas las gotas en los pozos NTC están cerca de la línea de base. </li><li> Haga clic en el botón denominado &quot;Eventos&quot;. A la derecha del histograma presentado haga clic en el cuadro llamado &quot;Total&quot; y el cuadro llamado &quot;single&quot; en la parte inferior para mostrar el número total de gotitas aceptados por pocillo. Excluye todos los pozos que contienen &lt;10.000 gotitas 7 manteniendo pulsada la tecla Ctrl y haciendo clic en el pozo (s) a ser excluidos. </li><li> Haga clic en el botón indicado como &#39;1D Amplitud&#39; para establecer el umbral de fluorescencia a aproximadamente una desviación estándar (500-700 unidades de fluorescencia) por encima de las gotitas negativas en pocillos NTC para ambos objetivos. En el extremo izquierdo de la pantalla de la ONUder &#39;Auto Analyze&#39; muestra dos botones de umbral, seleccione el icono de la derecha que tiene una sólida línea horizontal de color rosa que lo atraviesa. </li><li> Haga clic en la casilla a la izquierda de &quot;umbral establecido &#39;en cada una de las gráficas de amplitud e introduzca los valores de umbral de fluorescencia apropiados. Las concentraciones objetivo en copia por reacción de l A continuación se calculan automáticamente. Nota: Los umbrales no necesitan ser idénticos para los distintos objetivos. </li><li> Exportar los resultados en un archivo .csv haciendo clic en el botón &quot;Exportar&quot; en la esquina superior izquierda de la pantalla 1D amplitud. En el archivo .csv, multiplicar la concentración objetivo exportados por 4 para convertirlo de copia de destino (23S gen de Enterococcus spp. O el marcador HF183) por reacción de l copiar del objetivo por l plantilla de ADN. </li></ol>

<ol><li>Recreational Water Quality Criteria. EPA. , Office of Water. Washington, DC. 820-F-12-058. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://water.epa.gov/scitech/swguidance/standards/criteria/health/recreation/">http://water.epa.gov/scitech/swguidance/standards/criteria/health/recreation/</a> (2012).</li>
<li>Boehm, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+forty-one+microbial+source+tracking+methods%3A+A+twenty-seven+lab+evaluation+study%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Performance of forty-one microbial source tracking methods: A twenty-seven lab evaluation study.</a> Water Res. 47 (18), 6812-6828 (2013).</li>
<li>Layton, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+human+fecal+anaerobe-associated+PCR-based+assays+in+a+multi-laboratory+method+evaluation+study%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Performance of human fecal anaerobe-associated PCR-based assays in a multi-laboratory method evaluation study.</a> Water Res. 47 (18), 6897-6908 (2013).</li>
<li>Cao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+platform%2C+reference+material%2C+and+quantification+model+on+enumeration+of+Enterococcus+by+quantitative+PCR+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Effect of platform, reference material, and quantification model on enumeration of Enterococcus by quantitative PCR methods.</a> Water Res. 47 (1), 233-241 (2013).</li>
<li>Sivaganesan, M., Siefring, S., Varma, M., Haugland, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MPN+estimation+of+qPCR+target+sequence+recoveries+from+whole+cell+calibrator+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">MPN estimation of qPCR target sequence recoveries from whole cell calibrator samples.</a> J. Microbiol. Methods. 87 (3), 343-349 (2011).</li>
<li>Huggett, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Digital+MIQE+Guidelines%3A+Minimum+Information+for+Publication+of+Quantitative+Digital+PCR+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">The Digital MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Digital PCR Experiments.</a> Clin. Chem. 59 (6), 892-902 (2013).</li>
<li>Cao, Y., Raith, M. R., Griffith, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+digital+PCR+for+simultaneous+quantification+of+general+and+human-associated+fecal+indicators+for+water+quality+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Droplet digital PCR for simultaneous quantification of general and human-associated fecal indicators for water quality assessment.</a> Water Res. 70, 337-349 (2015).</li>
<li>Sanders, R., Huggett, J. F., Bushell, C. A., Cowen, S., Scott, D. J., Foy, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Digital+PCR+for+Absolute+DNA+Quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Digital PCR for Absolute DNA Quantification.</a> Anal. Chem. 83 (17), 6474-6484 (2011).</li>
<li>Whale, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+microfluidic+digital+PCR+and+conventional+quantitative+PCR+for+measuring+copy+number+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acid+Res%22%5BJournal%5D)">Comparison of microfluidic digital PCR and conventional quantitative PCR for measuring copy number variation.</a> Nucleic Acid Res. 40 (11), 82-89 (2012).</li>
<li>Hindson, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+quantification+by+droplet+digital+PCR+versus+analog+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR.</a> Nature Methods. 10 (10), 1003-1005 (2013).</li>
<li>Morisset, D., Štebih, D., Milavec, M., Gruden, K., Žel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+food+and+feed+aamples+with+droplet+digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of food and feed aamples with droplet digital PCR.</a> PLoS One. 8 (5), e62583(2013).</li>
<li>Method 1611: Enterococci in Water by TaqMan® Quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR) Assay. EPA. , Office of Water. Washington, DC. EPA-821-R-12-008. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://water.epa.gov/scitech/methods/cwa/bioindicators/upload/Method-1611-Entercocci-in-Water-by-TaqMan-Quantitative-Polymerase-Chain-Reaction-qPCR-Assay.pdf">http://water.epa.gov/scitech/methods/cwa/bioindicators/upload/Method-1611-Entercocci-in-Water-by-TaqMan-Quantitative-Polymerase-Chain-Reaction-qPCR-Assay.pdf</a> (2012).</li>
<li>Cao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+molecular+community+analysis+methods+for+discerning+fecal+sources+and+human+waste%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Evaluation of molecular community analysis methods for discerning fecal sources and human waste.</a> Water Res. 47 (18), 6862-6872 (2013).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Hay unos pocos pasos críticos en el protocolo. En primer lugar, la mezcla de las mezclas de ensayo puede ser difícil porque la mezcla maestra es más viscoso que las mezclas convencionales maestros qPCR. agitación simple puede conducir a una mezcla insuficiente, que a su vez conduce a una distribución no uniforme de moldes de ADN en las mezclas de ensayo y, posteriormente, en las gotitas. La técnica de mezcla por pipeteado se describe en el protocolo se debe seguir para asegurar la cuantificación precisa dPCR. En segundo...

Los métodos cuantitativos de PCR (qPCR) han sido ampliamente utilizados para el seguimiento de recreo calidad del agua y aplicaciones de seguimiento de fuente microbiana porque son más rápidos, más flexible y específica en comparación con los métodos tradicionales basadas en el cultivo. En consecuencia, la qPCR se recomienda para lograr rápidos resultados de monitoreo de aguas fecales para los indicadores generales, tales como Enterococcus spp., En los criterios de calidad del agua recreativa USEPA 1 revisado. Muchos ensayos de qPCR también se han desarrollado y validado para la identificación de las fuentes de contaminación fecal en las aguas ambientales 2. Entre estos, los ensayos de marcadores HF183 se encuentran entre los más utilizados para la identificación de la contaminación fecal humana asociada-3. Sin embargo, los resultados qPCR a menudo pueden estar sesgados porque se basan en las curvas de calibración para la cuantificación. qPCR cuantifica concentraciones desconocidas de diana en las muestras por interpolación de su ciclo de cuantificación (CQ) de un stancurva Dard que describe una relación lineal entre Cq y cantidad logarítmica de un conjunto de patrones diluidos en serie. Por lo tanto, la falta de material de referencia estándar fiable y consistente puede sesgar en gran medida los resultados qPCR. Los estudios demostraron que qPCR resultados diferían usando patrones de aproximadamente la mitad de un registro de diferentes proveedores 4 y 2 veces usando diferentes lotes de normas del mismo vendedor 5. La tecnología digital de PCR (dPCR) cuantifica una muestra desconocida contando la frecuencia de casos positivos en un gran número de informes de terminación en miniatura que se generan mediante la partición de la PCR cuantitativa a granel en miles o millones de nanolitros uniforme o reacciones picolitros 6. Se hace referencia como PCR gotita digital (es decir, en este artículo) o cámara de PCR digital, respectivamente, si las particiones son gotitas de agua-en-aceite (es decir, este artículo) o pequeñas cámaras en un chip. Una concentración de la muestra mayor resultará en presencia de ADN diana(PCR, por tanto, positiva) en una mayor proporción de particiones, una relación aproximada por distribución de Poisson. Como tal, los resultados binarios (PCR positivo o negativo) se registran y la frecuencia de las gotitas de positivos se utiliza para calcular las concentraciones de muestras desconocidas directamente a través de Poisson aproximación, eliminando la necesidad de una curva estándar como en qPCR. Esta naturaleza binaria de la cuantificación de PCR digital proporciona ventajas adicionales sobre qPCR 7. Debido a que la amplificación retrasado todavía puede producir una PCR positiva, dPCR cuantificación es más robusto frente a la inhibición que reduce la eficiencia de amplificación. Del mismo modo, dPCR cuantificación no se ve afectada por la variabilidad en valores Cq como es qPCR, lo que aumenta la precisión de dPCR comparación con qPCR 8-10. Además, el proceso de partición asegura una muy pequeña cantidad de ADN diana presente en cada gota, minimizando efectivamente la competencia sustrato (durante amplification de diferentes dianas de ADN) que son obstáculos comunes para lograr la impresión a doble cara (es decir, un ensayo mide simultáneamente dos dianas de ADN) en la qPCR. Como tal, si carrera en duplex o simplex (es decir, un objetivo se mide en un único ensayo) dPCR produce cuantificación casi indistinguibles de los dos objetivos de 7,11. El objetivo del ensayo de PCR digital (EntHF183 dPCR) descrito en este artículo es obtener cuantificación directa simultánea del indicador fecal general de Enterococcus spp. Y el marcador HF183-humano fecal asociada con una mayor precisión, reproducibilidad y robustez frente a la inhibición en comparación con su qPCR homólogos. Este ensayo ha sido utilizado con éxito para la cuantificación de la contaminación fecal en agua dulce del medio ambiente, el agua marina, y diversos materiales fecal 7, pero también puede ser aplicado a cualquier otro tipo de aguas y aguas residuales. Este ensayo representa una gran promesa para el análisis de los sedimentos o suelos debido a sus alta tolerancia a la inhibición, pero se necesitan más pruebas debido a la complejidad de inhibidor se mezcla en este tipo de muestras.

<table><tbody><tr><td>Microtubos de baja unión</td><td>Costar</td><td>3207</td><td>Para el almacenamiento de reactivos, muestras/producción de mezclas maestras</td></tr><tr><td>Agua sin nucleasas</td><td>FisherSci</td><td>BP2484-50</td><td></td></tr><tr><td>Tampón TE pH 8</td><td>FisherSci</td><td>BP2473-100</td><td></td></tr><tr><td>Hardshell Placa de 96 pocillos</td><td>BioRad</td><td>HSP-9601</td><td>Para la mezcla maestra inicial y la inoculación de muestras</td></tr><tr><td>Película</td> <td>de sellado de aluminioBioRad</td><td>359-0133</td><td>Para sellar la placa de muestra</td></tr><tr><td>Generador de gotas</td><td>BioRad</td><td>186-3002</td><td></td></tr><tr><td>Generación de gotas Aceite</td><td>BioRad</td><td>186-3005</td><td></td></tr><tr><td>Cartucho</td><td>BioRad</td><td>186-4008</td><td></td></tr><tr><td>DG8 Soporte de cartucho</td><td>BioRad</td><td>186-3051</td><td></td></tr><tr><td>Junta</td><td>BioRad</td><td>186-3009</td><td></td></tr><tr><td>20 &#956; l puntas de pipeta</td><td>Rainin</td><td>GP-L10F</td><td>para tansferring de muestra/mezcla maestra a cartidge</td></tr><tr><td>200 &#956; l puntas de pipeta</td><td>Rainin</td><td>GP-L200F</td><td>Para transferir las gotas a la placa Twin.Tec</td>final</tr><tr><td>Placa Twin.Tec de 96 pocillos</td><td>Eppendorf</td><td>951020320</td><td>Para el ciclo térmico y la lectura de las gotas finales</td></tr><tr><td>Lámina de sellado térmico perforable</td><td>BioRad</td><td>181-4040</td><td>Para sellar la placa Twin.Tec antes del ciclo térmico</td></tr><tr><td>Selladora de placas PX1 PCR</td><td>BioRad</td><td>181-4000</td><td></td></tr><tr><td>CFX96 Termociclador</td><td>BioRad</td><td>CFX96 y C1000</td><td>Solo se necesita el termociclador, sin óptica</td></tr><tr><td>QX100 Lector de gotas</td><td>BioRad</td><td>186-3001</td><td></td></tr><tr><td>Aceite Lector de gotas</td><td>BioRad</td><td>186-3004</td><td></td></tr><tr><td>Gota PCR Supermix&nbsp;</td><td>BioRad</td><td>186-3024</td><td>i.e. la mezcla de PCR digital en el software</td></tr><tr><td>QuantaSoft manuscrito (v1.3.2)</td><td>Quantasoft&nbsp;</td><td>QX100&nbsp;</td><td>Para visualizar, analizar y exportar datos de ddPCR</td></tr><tr><td>Entero Forward Primer (Ent F1A)</td><td>Operon</td><td>GAGAAATTCCAAACGAACTTG</td><td>Se puede utilizar un proveedor alternativo</td></tr><tr><td>Entero Reverse Primer (Ent R1)</td><td>Operon</td><td>CAGTGCTCTACCTCCATCATT</td><td>Se puede utilizar un proveedor alternativo</td></tr><tr><td>Entero Probe (GPL813TQ)</td><td>Operon</td><td>[6-FAM]-TGG TTC TCT CCG AAA TAG CTT TAG GGC TA-[BHQ1]</td><td>Se puede utilizar un proveedor alternativo, pero el floróforo tiene que ser FAM</td></tr><tr><td>HF183 Forward Primer ( HF183-1)</td><td>Operón</td><td>ATCATGAGTTCACATGTCCG</td><td>Se puede utilizar un proveedor alternativo</td></tr><tr><td>HF183 Cebador inverso (BthetR1)</td><td>Operón</td><td>CGTAGGAGTTTGGACCGTGTGT</td><td>Se puede utilizar un proveedor alternativo</td></tr><tr><td>Sonda HF183 (BthetP1)</td><td>Operón</td><td>[6-HEX]-CTGAGAGGAAGGTCCCCC ACATTGGA-[BHQ1]</td><td>Se puede utilizar un proveedor alternativo, pero el floróforo tiene que ser HEX (si se utiliza VIC, se debe elegir la compensación matricial adecuada. &nbsp;</td></tr><tr><td>Control positivo</td><td></td><td></td><td>Mezcla de ADN genómico E. faecalis y plásmido estándar HF183 (pedido de IDT). Para conocer los métodos detallados de cultivo de E. faecalis y las secuencias del plásmido HF183 ordenado, véase Cao et al. 2015 (doi:10.1016/j.watres.2014.12.008). Los estándares de ADN Enterococcus disponibles comercialmente (ATCC 29212Q-FZ) también se pueden utilizar en el control positivo en lugar del ADN genómico preparado en laboratorio E. faecalis.</td></tr></tbody></table>

un ensayo de pcr digital de dos vías para la cuantificación simultánea de la<em&gt; enterococcus spp.</em&gt; y el marcador asociado hf183-fecal humana en las aguas

A Duplex Digital PCR Assay for Simultaneous Quantification of the Enterococcus spp. and the Human Fecal-associated HF183 Marker in Waters

Este manuscrito describe un ensayo de PCR duplex digitales (EntHF183 dPCR) para la cuantificación simultánea de Enterococcus spp. Y el marcador HF183-fecal asociada humano. El EntHF183 dúplex dPCR (denominado en adelante como EntHF183 dPCR) ensayo utiliza las mismas secuencias de cebadores y sondas como sus homólogos individuales publicados por PCR cuantitativa (qPCR). Del mismo modo, las mismas de filtración de agua y extracción de ADN procedimientos que se realiza antes de la qPCR se siguen antes de ejecutar dPCR. Sin embargo, el ensayo dPCR duplex tiene varias ventajas sobre los ensayos de qPCR. Lo más importante, el ensayo dPCR elimina la necesidad para el funcionamiento de una curva estándar y, por tanto, el sesgo y la variabilidad asociada, mediante la cuantificación directa de sus objetivos. Además, mientras que a doble cara (es decir, la cuantificación simultánea) Enterococcus y HF183 en qPCR a menudo conduce a una subestimación grave del objetivo menos abundantes en una muestra, dPCR proporciona cuantificación coherente de ambos objetivos, amolasu cuantificó individualmente o simultáneamente en la misma reacción. El ensayo dPCR también es capaz de tolerar concentraciones de inhibidor de PCR que son de uno a dos órdenes de magnitud mayores que las toleradas por qPCR. Estas ventajas hacen que el ensayo EntHF183 dPCR particularmente atractivo, ya que al mismo tiempo proporciona información precisa y repetible en tanto la contaminación fecal general y asociada humano en aguas ambientales sin la necesidad de ejecutar dos ensayos de qPCR separadas. A pesar de sus ventajas sobre qPCR, el límite de cuantificación superior del ensayo dPCR con instrumentación disponible actualmente es de aproximadamente cuatro órdenes de magnitud más baja que la que puede conseguirse por qPCR. En consecuencia, se necesita dilución para la medición de altas concentraciones de organismos diana tales como los observados típicamente siguiente derrames de aguas residuales.

Un buen centro EntHF183 duplex dPCR debe dar lugar a relativamente alto número de gotitas aceptados (ca. 10,000-17,000) y diferencia relativamente grande (ca. 5000) entre los valores de fluorescencia para las gotitas de negativos y positivos 7. Inusualmente bajo número de gotitas probablemente indica problemas en el proceso de generación de las gotas, y un punto de corte de 10.000 gotitas se sugiere a partir de datos empíricos del sistema dPCR gotita utilizad...

Este manuscrito describe un ensayo de teléfono digital de dos PCR que se puede utilizar para cuantificar simultáneamente Enterococcus spp. Y los marcadores genéticos HF183 como indicadores de contaminación fecal general y asociada a humanos en aguas de recreo.

Un ensayo de PCR digital de dos vías para la cuantificación simultánea de la<em&gt; Enterococcus spp.</em&gt; Y el marcador asociado HF183-fecal humana en las aguas

This manuscript describes a duplex digital PCR assay (EntHF183 dPCR) for simultaneous quantification of Enterococcus spp. and the human fecal-associated ...

El objetivo general de este ensayo de PCR digital duplex es cuantificar simultáneamente la contaminación fecal general y asociada a humanos en aguas. Este ensayo puede ayudar a responder preguntas clave en el monitoreo de la calidad del agua recreacional, como, cuánto indicador fecal general, es decir, Enterococcus, y más importante aún, cuánto marcador HF183 asociado a heces humanas hay en las aguas.La principal ventaja de este ensayo es que cuantifica dos dianas en una sola reacción y, en comparación con la qPCR, elimina la necesidad de realizar curvas estándar y, por lo tanto, el sesgo y la variabilidad asociados. El procedimiento será demostrado por Meredith Raith, nuestra Técnica de Investigación Senior. Para comenzar este procedimiento, prepare primero concentraciones stock de 100 micromoles por litro para todos los cebadores en Agua de Grado Molecular y para las sondas en tampón TEPH 8, tal como se describe en el texto del protocolo.A continuación, prepare una mezcla maestra mezclando las cantidades adecuadas de mezcla de PCR digital, cebadores directo y reverso, la sonda fluorescente y agua libre de nucleasas. Aspire y expulse con la pipeta al menos 10 veces para mezclar, teniendo cuidado de no introducir burbujas de aire en la solución. Dado que la mezcla maestra de PCR digital es más viscosa que la mezcla maestra convencional de qPCR, es necesario utilizar la técnica de mezclado por pipeteo para obtener una solución homogénea.Esto permite una cuantificación precisa mediante dPCR en pasos posteriores. Para preparar la Mezcla de Ensayo para la Generación de Gotas para correr las muestras por duplicado, pipetee 36 microlitros del Mezcla Maestra en una placa PCR convencional. A cada uno de los 36 microlitros de Mezcla Maestra, añada 12 microlitros de molde de ADN, dejando vacíos los pozos correspondientes para los replicados en la placa.Incluya controles positivos para asegurar que el ensayo funcione correctamente. Incluya controles sin plantilla (NTC) para asegurar que no haya contaminación en la placa y para establecer posteriormente la línea base de fluorescencia durante el análisis de datos. Antes de preparar el generador de gotas, mezcle las mezclas de ensayo utilizando una pipeta multicanal para aspirar y dispensar las mezclas de arriba abajo aproximadamente 15 veces.Asegúrese de que la punta de la pipeta permanezca dentro del líquido para evitar la formación de burbujas de aire en la mezcla. A continuación, inserte el cartucho uno, que contiene ocho pocillos, en un soporte blanco para cartuchos y cierre el soporte haciendo clic. El cartucho uno ya está firmemente colocado y no puede desalojarse del soporte durante la generación de gotas.Utilizando una pipeta multicanal, transfiera suavemente 20 microlitros de la Mezcla de ensayo a la posición central del cartucho marcada como muestra, sin introducir burbujas de aire. Pipete 70 microlitros de aceite para generación de gotas al lado izquierdo del cartucho marcado como aceite. Cubra el cartucho con una junta, asegurándose de que la junta esté plana y sujetada uniformemente por las cuatro marcas situadas hacia el borde del cartucho.Pulse el botón iluminado en verde del Generador de Gotas para abrir la puerta y colocar el cartucho. Presione el botón nuevamente para cerrar el generador. Una vez que la puerta se cierra, el botón verde se atenúa y la puerta no puede volver a abrirse.La generación de gotas comenzará inmediatamente y continuará durante aproximadamente un minuto. Mientras la generación de gotas está en curso, coloque el cartucho dos en un segundo soporte blanco para cartuchos y prepárelo de la misma manera que el cartucho uno. Cuando la generación de gotas haya finalizado, el botón débilmente iluminado se volverá verde.Abra la puerta del Generador de Gotas, retire el soporte blanco del cartucho que contiene el cartucho uno y colóquelo aparte. Coloque el cartucho dos en el Generador de Gotas. Retire la junta del cartucho uno y deséchela.No desactive el soporte blanco del cartucho, ya que esta acción podría romper las gotas recién generadas. Utilizando una pipeta multicanal ajustada a 40 microlitros, inserte las puntas en la tercera columna del cartucho marcada como gotas, en un ángulo de 45 grados, y aspire lentamente todas las gotas. Transfiéralas a la placa final de PCR colocando la punta de la pipeta contra la pared del pocillo aproximadamente a la mitad de su profundidad y expulsando las gotas lentamente.De la misma manera, cuando se complete la generación de gotas para el cartucho dos, retire la junta del cartucho dos y transfiera las gotas generadas a la placa final de PCR. Coloque una cubierta de aluminio perforable sobre la placa y colóquela en un sellador de placas. Configure el sellador a 180 grados celsius, presione reproducir en el sellador y selle durante 10 segundos.Para comenzar este procedimiento, coloque la placa final de PCR sellada en el termociclador. Utilice un termociclador compatible con la placa final de PCR y con una velocidad de rampa térmica de dos grados Celsius por segundo. Ejecute el siguiente programa térmico: diez minutos a 95 grados Celsius, seguidos de 40 ciclos de 30 segundos a 94 grados Celsius y 60 segundos a 60 grados Celsius, seguidos por una incubación de diez minutos a 98 grados Celsius.Tras finalizar el ciclo, transfiera la placa a un lector de gotas para la medición automática de la fluorescencia en cada gota de cada pocillo. Asegúrese de que las gotas estén a temperatura ambiente antes de proceder con la lectura de gotas. Comience abriendo el software correspondiente para configurar la lectura de gotas.En el menú de configuración predeterminado que contiene un esquema de una placa de 96 pocillos vacía, haga doble clic en el pocillo A1 para abrir el menú que contiene tres secciones: Muestra, Ensayo 1 y Ensayo 2. En la sección Muestra, escriba el ID de la muestra en el cuadro etiquetado como Nombre y marque la casilla situada a la derecha con la leyenda Aplicar. A continuación, haga clic en el menú desplegable etiquetado como experimento, seleccione RED para Detección de Eventos Raros y haga clic en Intro.Diríjase a la sección denominada Ensayo 1. En la sección Nombre, complete el ensayo y haga clic en Intro. En el cuadro etiquetado Tipo ubicado debajo, haga clic en el menú desplegable, seleccione Canal 1 Desconocido y pulse Intro.Diríjase a la sección denominada Ensayo 2. En la sección Nombre, complete el ensayo y haga clic en Intro. En el cuadro etiquetado Tipo ubicado debajo, haga clic en el menú desplegable, seleccione Canal 2 Desconocido y pulse Intro.Toda la información de los pasos anteriores ahora está presente en el pocillo A1. Asigne nombre a todos los pocillos subsiguientes que contengan gotas. Para ahorrar tiempo total de configuración, haga clic en mayúsculas o control para seleccionar varios pocillos simultáneamente. Cuando la representación digital de la placa refleje la placa física, presione Aceptar en la parte inferior derecha del menú.En el nuevo menú que aparece en la parte superior del esquema de la placa, bajo Plantilla, elija Guardar como y asigne un nombre y guarde la placa. A la izquierda de la pantalla, haga clic en Ejecutar y seleccione el Conjunto de colorantes adecuado en la ventana emergente Opciones de ejecución. La recopilación de datos se iniciará y se mostrará en tiempo real en el software.Cuando el lector haya terminado y aparezca un cuadro que indique Ejecución completada, haga clic en Aceptar. Verifique la separación entre las gotas positivas y negativas. Asegúrese de que la fluorescencia en todas las gotas de los pocillos NTC esté cerca de la línea base. Haga clic en el botón etiquetado como Eventos.En la parte inferior, haga clic en el cuadro denominado Individual y, a la derecha del Histograma presentado, haga clic en el cuadro denominado Total para mostrar el número total de gotas aceptadas por pocillo. Excluya cualquier pocillo que contenga menos de 10 000 gotas manteniendo presionada la tecla de control y haciendo clic en los pocillos que desee excluir. Haga clic en el botón denominado Amplitud 1D para establecer el umbral de fluorescencia aproximadamente a una desviación estándar de las gotas negativas en los pocillos de NTC para ambos objetivos.En el extremo izquierdo de la pantalla, debajo de Auto Analizar, donde se muestran dos botones de umbral, seleccione el icono de la derecha que tiene una línea horizontal rosa sólida que lo atraviesa. Haga clic en la casilla a la izquierda de Establecer umbral debajo de cada uno de los gráficos de amplitud e ingrese los valores adecuados de umbral de fluorescencia. Las concentraciones objetivo en copias por microlitro de reacción se calculan entonces automáticamente.Exporte los resultados en un archivo CSV haciendo clic en el botón Exportar en la esquina superior izquierda de la pantalla de Amplitud 1D. En el archivo CSV, multiplique la concentración del objetivo exportada por cuatro para convertirla de copias de objetivo por microlitro de reacción a copias de objetivo por microlitro de plantilla de ADN. Esta figura compara los formatos dúplex y simplex del ensayo de PCR digital.Los paneles izquierdo y derecho muestran respectivamente la cuantificación de Enterococcus y HF183, junto con los coeficientes de correlación correspondientes entre los resultados de la reacción múltiple y la reacción simple. Las líneas continuas indican las líneas de regresión y el sombreado gris indica los errores estándar correspondientes. Diferentes tipos de muestras están indicados por los símbolos.Los resultados son altamente consistentes y a menudo indistinguibles, ya sea que Enterococcus y HF183 se midan simultáneamente en una sola reacción o por separado en dos reacciones. El ensayo de PCR digital también puede tolerar inhibidores en concentraciones uno o dos órdenes de magnitud más altas que las toleradas por sus contrapartes de qPCR. Esta figura muestra la cuantificación por qPCR y PCR digital del marcador HF183 en ADN de aguas residuales limpias al que se le añadió ácido húmico en concentraciones crecientes, el cual inhibe la PCR.La cuantificación esperada de HF183 en ausencia de inhibidores se define como un intervalo de confianza del 95 % entre las dos líneas horizontales punteadas. La PCR digital, indicada por triángulos, continúa proporcionando una cuantificación precisa hasta una concentración de ácido húmico de 15 nanogramos por microlitro de reacción, mientras que la qPCR, indicada por cruces, comienza a subestimar a un nanogramo por microlitro y queda completamente inhibida a cinco nanogramos por microlitro. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar este ensayo de PCR digital por gotas duplex entérico para HF183 u otro ensayo similar utilizando diferentes cebadores y sondas.Desde el desarrollo de este Ensayo Duplex, publicado en Water Research en 2015, hemos desarrollado y validado una serie de otros ensayos de PCR Digital que tienen como diana bacterias indicadoras fecales generales, marcadores de rastreo microbiano y patógenos transmitidos por el agua. Estos ensayos permiten la cuantificación directa e imparcial de sus dianas y se están convirtiendo en alternativas útiles a los ensayos de PCR cuantitativa (qPCR) en el campo de la evaluación de la calidad del agua.

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