Un ensayo de PCR digital de dos vías para la cuantificación simultánea de la Enterococcus spp. Y el marcador asociado HF183-fecal humana en las aguas

El objetivo general de este ensayo de PCR digital dúplex es cuantificar simultáneamente la contaminación fecal general y humana asociada en las aguas. Este ensayo puede ayudar a responder preguntas clave en el control de la calidad del agua recreativa, como la cantidad de indicador fecal general, es decir, Enterococcus y, lo que es más importante, el marcador HF183 asociado a las heces humanas, hay en las aguas.

La principal ventaja de este ensayo es que cuantifica dos objetivos en una reacción y, en comparación con la qPCR, elimina la necesidad de ejecutar curvas estándar y, por lo tanto, el sesgo y la variabilidad asociados. La demostración del procedimiento estará a cargo de Meredith Raith, nuestra Técnica Superior de Investigación. Para comenzar este procedimiento, primero prepare concentraciones de stock de 100 micromoles por litro para todos los cebadores en agua de grado molecular y sondas en tampón TEPH 8 como se describe en el texto del protocolo.

A continuación, prepare una mezcla maestra mezclando cantidades adecuadas de mezcla de PCR digital, cebadores directos e inversos, la sonda fluorescente y agua sin nucleasas. Pipetea hacia arriba y hacia abajo al menos 10 veces para mezclar teniendo cuidado de no introducir burbujas de aire en la solución. Dado que la mezcla maestra de dPCR es más viscosa que la mezcla maestra de qPCR convencional, es necesario utilizar la técnica de mezcla por pipeteo para crear una solución homogénea.

Esto permite una cuantificación precisa de dPCR aguas abajo. Para hacer la mezcla de ensayo para la generación de gotas para procesar muestras por duplicado, pipetee 36 microlitros de la mezcla maestra en una placa de PCR normal. A cada una de las Mezclas Maestras de 36 microlitros, mezcle 12 microlitros de plantilla de ADN, dejando los pocillos replicados correspondientes vacíos en la placa.

Incluya controles positivos para garantizar que el ensayo funcione correctamente. No incluya controles de plantilla o NTC para garantizar que no haya contaminación dentro de la placa y para establecer la línea de base fluorescente más adelante para el análisis de datos. Antes de configurar el generador de gotas, mezcle las mezclas de ensayo utilizando una pipeta multicanal para pipetear las mezclas hacia arriba y hacia abajo aproximadamente 15 veces.

Asegúrese de que la punta de la pipeta permanezca dentro del líquido para evitar que se formen burbujas dentro de la mezcla. A continuación, inserte el cartucho uno que contiene ocho pocillos en un soporte de cartucho blanco y cierre el soporte del cartucho. El cartucho uno ahora está firmemente en su lugar y no se puede desprender del soporte mientras genera gotas.

Con una pipeta multicanal, transfiera suavemente 20 microlitros de la mezcla de ensayo a la posición central de la muestra marcada con cartucho sin introducir burbujas de aire. Pipetear en 70 microlitros de aceite Droplet Generation en el lado izquierdo del cartucho marcado como aceite. Cubra el cartucho con una junta, asegurándose de que la junta esté plana y sujeta uniformemente por las cuatro marcas hacia el borde del cartucho.

Presione el botón de luz verde en el generador de gotas para abrir la puerta y colocar el cartucho. Presione el botón nuevamente para cerrar el generador. Una vez que la puerta se cierra, el botón verde se atenúa y la puerta no se puede volver a abrir.

La generación de gotas comenzará inmediatamente y continuará durante aproximadamente un minuto. Mientras la generación de gotas está en curso, coloque el cartucho dos en un segundo soporte de cartucho blanco y prepárelo de la misma manera que para el cartucho uno. Cuando se complete la generación de gotas, el botón con luz tenue se volverá verde.

Abra la puerta del generador de gotas, retire el soporte blanco del cartucho que contiene el cartucho uno y déjelo a un lado. Coloque el cartucho dos en el generador de gotas. Retire la junta del cartucho uno y deséchela.

No desabrochar el soporte del cartucho blanco, ya que la acción puede romper las gotas recién generadas. Con una pipeta multicanal ajustada a 40 microlitros, inserte las puntas en la tercera columna de las gotas marcadas con el cartucho en un ángulo de 45 grados y pipetee lentamente todas las gotas. Transfiéralos a la placa de PCR final colocando la punta de la pipeta contra la pared del pocillo aproximadamente a la mitad y expulsando las gotas lentamente.

De la misma manera, cuando se complete la generación de gotas para el cartucho dos, retire la junta del cartucho dos y transfiera las gotas generadas a la placa PCR final. Coloque una cubierta de papel de aluminio perforable encima de la placa y colóquela en un sellador de placas. Ajuste el sellador a 180 grados centígrados, presione reproducir en el sellador y selle durante 10 segundos.

Para comenzar este procedimiento, coloque la placa PCR final sellada en el termociclador. Utilice un termociclador que sea compatible con la placa PCR final y con una velocidad de aumento de temperatura de dos grados centígrados por segundo. Ejecute el siguiente programa térmico diez minutos a 95 grados centígrados, seguidos de 40 ciclos de 30 segundos a 94 grados centígrados y 60 segundos a 60 grados centígrados, seguidos de una retención de diez minutos a 98 grados centígrados.

Una vez finalizado el ciclo, transfiera la placa a un lector de gotas para la medición automática de fluorescentes en cada gota en cada pocillo. Asegúrese de que las gotas estén a temperatura ambiente antes de continuar con la lectura de gotas. Comience abriendo el software adjunto para configurar la lectura de gotas.

En el menú de configuración predeterminado que contiene un esquema de una placa vacía de 96 pocillos, haga doble clic en el pocillo A1 para abrir el menú que contiene tres secciones, Muestra, Ensayo 1 y Ensayo 2. En la sección Muestra, escriba el ID de muestra en el cuadro con la etiqueta Nombre y marque la casilla de la derecha marcada Aplicar. A continuación, haga clic en el menú desplegable con la etiqueta experimento, elija ROJO para Detección de eventos raros y haga clic en Enter.

Pase a la sección denominada Ensayo 1. En la sección Nombre, rellene el ensayo y haga clic en Intro. En el cuadro de abajo con la etiqueta Tipo, haga clic en el menú desplegable, elija Canal 1 Desconocido y haga clic en Enter.

Pase a la sección denominada Ensayo 2. En la sección Nombre, rellene el ensayo y haga clic en Intro. En el cuadro de abajo con la etiqueta Tipo, haga clic en el menú desplegable, elija Canal 2 Desconocido y haga clic en Enter.

Toda la información de los pasos anteriores ahora está presente en el pocillo A1.Name en todos los pocillos posteriores que contienen gotas. Para ahorrar tiempo total de configuración, haga clic en Mayús o Control para elegir varios pozos simultáneamente. Cuando la representación digital de la placa refleje la placa física, presione OK en la parte inferior derecha del menú.

En el nuevo menú que aparece en la parte superior del esquema de la placa, en la Plantilla, elija Guardar como y asigne un nombre y guarde la placa. A la izquierda de la pantalla, haga clic en Ejecutar y seleccione el conjunto de tintes apropiado en la ventana emergente Opciones de ejecución. La recopilación de datos se iniciará y se mostrará en tiempo real en el software.

Cuando el lector haya terminado y aparezca un cuadro que indique Ejecución completada, haga clic en Aceptar. Compruebe la separación entre las gotas positivas y negativas. Asegúrese de que los fluorescentes en todas las gotas de los pocillos NTC estén cerca de la línea de base. Haga clic en el botón Eventos.

En la parte inferior, haga clic en la casilla denominada Único y, a la derecha del histograma presentado, haga clic en la casilla denominada Total para mostrar el número total de gotas aceptadas por pocillo. Excluya los pozos que contengan menos de 10.000 gotas manteniendo pulsada la tecla de control y haciendo clic en los pocillos que desea excluir. Haga clic en el botón denotado Amplitud 1D para establecer el umbral fluorescente en aproximadamente una desviación estándar de las gotas negativas en los pocillos NTC para ambos objetivos.

En el extremo izquierdo de la pantalla, debajo de Análisis automático que muestra dos botones de umbral, elija el icono de la derecha que tiene una línea horizontal de color rosa sólido que lo atraviesa. Haga clic en el cuadro a la izquierda de Establecer umbral debajo de cada uno de los gráficos de amplitud e ingrese los valores de umbral de fluorescencia apropiados. A continuación, se calculan automáticamente las concentraciones objetivo en copia por reacción de microlitros.

Exporte los resultados en un archivo CSV haciendo clic en el botón Exportar en la esquina superior izquierda de la pantalla Amplitud 1D. En el archivo CSV, multiplique la concentración objetivo exportada por cuatro para convertirla de copia del objetivo por reacción de microlitro, a copia del objetivo por plantilla de ADN de microlitro. Esta figura compara los formatos dúplex y simplex del ensayo de PCR digital.

Los paneles izquierdo y derecho muestran la cuantificación de Enterococcus y HF183 respectivamente con los coeficientes de correlación correspondientes entre los resultados dúplex y simplex. Las líneas continuas indican las líneas de regresión y el sombreado gris indica los errores estándar correspondientes. Los símbolos indican diferentes tipos de muestras.

Los resultados son muy consistentes y, a menudo, indistinguibles, ya sea que Enterococcus y HF183 se midan simultáneamente en una reacción o por separado en dos reacciones. El ensayo de PCR digital también puede tolerar el inhibidor en concentraciones de uno a dos órdenes de magnitud más altas que las toleradas por sus homólogos de qPCR. Esta figura muestra la cuantificación de qPCR y PCR digital del marcador HF183 en ADN de aguas residuales limpias con aumento en las concentraciones de ácido húmico que inhibe la PCR.

La cuantificación esperada de HF183 en ausencia de inhibidores se define como un pliegue de confianza del 95% entre las dos líneas punteadas horizontales. La PCR digital denotada por triángulos continúa proporcionando una cuantificación precisa hasta una concentración de ácido húmico de 15 nanogramos por reacción de microlitro, mientras que la qPCR denotada por cruces comienza a subestimarse a un nanogramo por microlitro y se inhibe completamente a cinco nanogramos por microlitro. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo realizar este ensayo de PCR digital de gotas dúplex HF183 enteral u otro ensayo similar utilizando diferentes cebadores y sondas.

Desde el desarrollo de este ensayo dúplex, que se publicó en Water Research en 2015, hemos desarrollado y validado una gran cantidad de otros ensayos de PCR digital que se dirigen a bacterias indicadoras fecales generales, marcadores de seguimiento microbiano y patógenos transmitidos por el agua. Estos ensayos proporcionan una cuantificación directa e imparcial de su objetivo y se están convirtiendo en alternativas útiles a los ensayos de qPCR en el campo de las pruebas de calidad del agua.