Un ensayo de PCR digital de dos vías para la cuantificación simultánea de la

El objetivo general de este ensayo de PCR digital duplex es cuantificar simultáneamente la contaminación fecal general y asociada a humanos en aguas. Este ensayo puede ayudar a responder preguntas clave en el monitoreo de la calidad del agua recreacional, como, cuánto indicador fecal general, es decir, Enterococcus, y más importante aún, cuánto marcador HF183 asociado a heces humanas hay en las aguas.

La principal ventaja de este ensayo es que cuantifica dos dianas en una sola reacción y, en comparación con la qPCR, elimina la necesidad de realizar curvas estándar y, por lo tanto, el sesgo y la variabilidad asociados. El procedimiento será demostrado por Meredith Raith, nuestra Técnica de Investigación Senior. Para comenzar este procedimiento, prepare primero concentraciones stock de 100 micromoles por litro para todos los cebadores en Agua de Grado Molecular y para las sondas en tampón TEPH 8, tal como se describe en el texto del protocolo.

A continuación, prepare una mezcla maestra mezclando las cantidades adecuadas de mezcla de PCR digital, cebadores directo y reverso, la sonda fluorescente y agua libre de nucleasas. Aspire y expulse con la pipeta al menos 10 veces para mezclar, teniendo cuidado de no introducir burbujas de aire en la solución. Dado que la mezcla maestra de PCR digital es más viscosa que la mezcla maestra convencional de qPCR, es necesario utilizar la técnica de mezclado por pipeteo para obtener una solución homogénea.

Esto permite una cuantificación precisa mediante dPCR en pasos posteriores. Para preparar la Mezcla de Ensayo para la Generación de Gotas para correr las muestras por duplicado, pipetee 36 microlitros del Mezcla Maestra en una placa PCR convencional. A cada uno de los 36 microlitros de Mezcla Maestra, añada 12 microlitros de molde de ADN, dejando vacíos los pozos correspondientes para los replicados en la placa.

Incluya controles positivos para asegurar que el ensayo funcione correctamente. Incluya controles sin plantilla (NTC) para asegurar que no haya contaminación en la placa y para establecer posteriormente la línea base de fluorescencia durante el análisis de datos. Antes de preparar el generador de gotas, mezcle las mezclas de ensayo utilizando una pipeta multicanal para aspirar y dispensar las mezclas de arriba abajo aproximadamente 15 veces.

Asegúrese de que la punta de la pipeta permanezca dentro del líquido para evitar la formación de burbujas de aire en la mezcla. A continuación, inserte el cartucho uno, que contiene ocho pocillos, en un soporte blanco para cartuchos y cierre el soporte haciendo clic. El cartucho uno ya está firmemente colocado y no puede desalojarse del soporte durante la generación de gotas.

Utilizando una pipeta multicanal, transfiera suavemente 20 microlitros de la Mezcla de ensayo a la posición central del cartucho marcada como muestra, sin introducir burbujas de aire. Pipete 70 microlitros de aceite para generación de gotas al lado izquierdo del cartucho marcado como aceite. Cubra el cartucho con una junta, asegurándose de que la junta esté plana y sujetada uniformemente por las cuatro marcas situadas hacia el borde del cartucho.

Pulse el botón iluminado en verde del Generador de Gotas para abrir la puerta y colocar el cartucho. Presione el botón nuevamente para cerrar el generador. Una vez que la puerta se cierra, el botón verde se atenúa y la puerta no puede volver a abrirse.

La generación de gotas comenzará inmediatamente y continuará durante aproximadamente un minuto. Mientras la generación de gotas está en curso, coloque el cartucho dos en un segundo soporte blanco para cartuchos y prepárelo de la misma manera que el cartucho uno. Cuando la generación de gotas haya finalizado, el botón débilmente iluminado se volverá verde.

Abra la puerta del Generador de Gotas, retire el soporte blanco del cartucho que contiene el cartucho uno y colóquelo aparte. Coloque el cartucho dos en el Generador de Gotas. Retire la junta del cartucho uno y deséchela.

No desactive el soporte blanco del cartucho, ya que esta acción podría romper las gotas recién generadas. Utilizando una pipeta multicanal ajustada a 40 microlitros, inserte las puntas en la tercera columna del cartucho marcada como gotas, en un ángulo de 45 grados, y aspire lentamente todas las gotas. Transfiéralas a la placa final de PCR colocando la punta de la pipeta contra la pared del pocillo aproximadamente a la mitad de su profundidad y expulsando las gotas lentamente.

De la misma manera, cuando se complete la generación de gotas para el cartucho dos, retire la junta del cartucho dos y transfiera las gotas generadas a la placa final de PCR. Coloque una cubierta de aluminio perforable sobre la placa y colóquela en un sellador de placas. Configure el sellador a 180 grados celsius, presione reproducir en el sellador y selle durante 10 segundos.

Para comenzar este procedimiento, coloque la placa final de PCR sellada en el termociclador. Utilice un termociclador compatible con la placa final de PCR y con una velocidad de rampa térmica de dos grados Celsius por segundo. Ejecute el siguiente programa térmico: diez minutos a 95 grados Celsius, seguidos de 40 ciclos de 30 segundos a 94 grados Celsius y 60 segundos a 60 grados Celsius, seguidos por una incubación de diez minutos a 98 grados Celsius.

Tras finalizar el ciclo, transfiera la placa a un lector de gotas para la medición automática de la fluorescencia en cada gota de cada pocillo. Asegúrese de que las gotas estén a temperatura ambiente antes de proceder con la lectura de gotas. Comience abriendo el software correspondiente para configurar la lectura de gotas.

En el menú de configuración predeterminado que contiene un esquema de una placa de 96 pocillos vacía, haga doble clic en el pocillo A1 para abrir el menú que contiene tres secciones: Muestra, Ensayo 1 y Ensayo 2. En la sección Muestra, escriba el ID de la muestra en el cuadro etiquetado como Nombre y marque la casilla situada a la derecha con la leyenda Aplicar. A continuación, haga clic en el menú desplegable etiquetado como experimento, seleccione RED para Detección de Eventos Raros y haga clic en Intro.

Diríjase a la sección denominada Ensayo 1. En la sección Nombre, complete el ensayo y haga clic en Intro. En el cuadro etiquetado Tipo ubicado debajo, haga clic en el menú desplegable, seleccione Canal 1 Desconocido y pulse Intro.

Diríjase a la sección denominada Ensayo 2. En la sección Nombre, complete el ensayo y haga clic en Intro. En el cuadro etiquetado Tipo ubicado debajo, haga clic en el menú desplegable, seleccione Canal 2 Desconocido y pulse Intro.

Toda la información de los pasos anteriores ahora está presente en el pocillo A1. Asigne nombre a todos los pocillos subsiguientes que contengan gotas. Para ahorrar tiempo total de configuración, haga clic en mayúsculas o control para seleccionar varios pocillos simultáneamente. Cuando la representación digital de la placa refleje la placa física, presione Aceptar en la parte inferior derecha del menú.

En el nuevo menú que aparece en la parte superior del esquema de la placa, bajo Plantilla, elija Guardar como y asigne un nombre y guarde la placa. A la izquierda de la pantalla, haga clic en Ejecutar y seleccione el Conjunto de colorantes adecuado en la ventana emergente Opciones de ejecución. La recopilación de datos se iniciará y se mostrará en tiempo real en el software.

Cuando el lector haya terminado y aparezca un cuadro que indique Ejecución completada, haga clic en Aceptar. Verifique la separación entre las gotas positivas y negativas. Asegúrese de que la fluorescencia en todas las gotas de los pocillos NTC esté cerca de la línea base. Haga clic en el botón etiquetado como Eventos.

En la parte inferior, haga clic en el cuadro denominado Individual y, a la derecha del Histograma presentado, haga clic en el cuadro denominado Total para mostrar el número total de gotas aceptadas por pocillo. Excluya cualquier pocillo que contenga menos de 10 000 gotas manteniendo presionada la tecla de control y haciendo clic en los pocillos que desee excluir. Haga clic en el botón denominado Amplitud 1D para establecer el umbral de fluorescencia aproximadamente a una desviación estándar de las gotas negativas en los pocillos de NTC para ambos objetivos.

En el extremo izquierdo de la pantalla, debajo de Auto Analizar, donde se muestran dos botones de umbral, seleccione el icono de la derecha que tiene una línea horizontal rosa sólida que lo atraviesa. Haga clic en la casilla a la izquierda de Establecer umbral debajo de cada uno de los gráficos de amplitud e ingrese los valores adecuados de umbral de fluorescencia. Las concentraciones objetivo en copias por microlitro de reacción se calculan entonces automáticamente.

Exporte los resultados en un archivo CSV haciendo clic en el botón Exportar en la esquina superior izquierda de la pantalla de Amplitud 1D. En el archivo CSV, multiplique la concentración del objetivo exportada por cuatro para convertirla de copias de objetivo por microlitro de reacción a copias de objetivo por microlitro de plantilla de ADN. Esta figura compara los formatos dúplex y simplex del ensayo de PCR digital.

Los paneles izquierdo y derecho muestran respectivamente la cuantificación de Enterococcus y HF183, junto con los coeficientes de correlación correspondientes entre los resultados de la reacción múltiple y la reacción simple. Las líneas continuas indican las líneas de regresión y el sombreado gris indica los errores estándar correspondientes. Diferentes tipos de muestras están indicados por los símbolos.

Los resultados son altamente consistentes y a menudo indistinguibles, ya sea que Enterococcus y HF183 se midan simultáneamente en una sola reacción o por separado en dos reacciones. El ensayo de PCR digital también puede tolerar inhibidores en concentraciones uno o dos órdenes de magnitud más altas que las toleradas por sus contrapartes de qPCR. Esta figura muestra la cuantificación por qPCR y PCR digital del marcador HF183 en ADN de aguas residuales limpias al que se le añadió ácido húmico en concentraciones crecientes, el cual inhibe la PCR.

La cuantificación esperada de HF183 en ausencia de inhibidores se define como un intervalo de confianza del 95 % entre las dos líneas horizontales punteadas. La PCR digital, indicada por triángulos, continúa proporcionando una cuantificación precisa hasta una concentración de ácido húmico de 15 nanogramos por microlitro de reacción, mientras que la qPCR, indicada por cruces, comienza a subestimar a un nanogramo por microlitro y queda completamente inhibida a cinco nanogramos por microlitro. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar este ensayo de PCR digital por gotas duplex entérico para HF183 u otro ensayo similar utilizando diferentes cebadores y sondas.

Desde el desarrollo de este Ensayo Duplex, publicado en Water Research en 2015, hemos desarrollado y validado una serie de otros ensayos de PCR Digital que tienen como diana bacterias indicadoras fecales generales, marcadores de rastreo microbiano y patógenos transmitidos por el agua. Estos ensayos permiten la cuantificación directa e imparcial de sus dianas y se están convirtiendo en alternativas útiles a los ensayos de PCR cuantitativa (qPCR) en el campo de la evaluación de la calidad del agua.