Name: La proteína c-Fos detección inmunohistoquímico: una herramienta útil como marcador de vías centrales implicados en las respuestas fisiológicas específicas En Vivo y Ex Vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 44 s
Description: Aprende la detección inmunohistoquímica de la proteína c-FOS para evaluar la actividad neuronal en tejidos cerebrales. Este método permite identificar poblaciones neuronales activas y mapear regiones implicadas en respuestas fisiológicas específicas.

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La Universidad Paris 13 apoyó este trabajo. La ASPT contó con el apoyo de una beca de la Universidad Paris 13 y de la "Association Française pour le Syndrome d'Ondine". FJ contó con el apoyo de una beca GR-Ex del Laboratorio de Excelencia. El GR-Ex (ref ANR-11-LABX-0051) está financiado por el programa "Investissement d'avenir" de la Agencia Nacional de Investigación de Francia (ref ANR-11-IDEX-0005-02).

Nota: La detección de c-fos es un procedimiento normalizado que implica varios pasos (Figura 1). Todos los experimentos se realizaron en ratas o ratones. Los protocolos experimentales fueron aprobados por el Comité de Ética en el experimento con animales Charles Darwin (ce5 / 2011/05), realizado de conformidad con la Directiva del Consejo Comunidades Europeas de 22 de septiembre, 2010 (2010/63 / UE) para el cuidado de los animales, y realizarse de conformidad con las leyes francesas para el cuidado de animales. 1. Preparación de soluciones <ol><li> Preparar tampón de fosfato de sodio 0,2 M: añadir 6,24 g de NaH 2 PO 4 * 2 H 2 O y 22,56 g de Na 2 HPO 4 * H2O a 1 l de agua destilada mientras se agita. </li><li> Preparar 4% de paraformaldehído (PFA): se añaden 20 g de PFA a 150 ml de agua destilada. Calentar la solución a 80 ° C mientras se agitaba. Para borrar la solución, reduzca el fuego y añadir 1 ó 2 gotas de NaOH 1 N para ayudar al paraformaldehído se disuelve. Completa a 250 mlcon agua destilada y añadir 250 ml de tampón fosfato 0,2 M (pH 7,4). Almacenar a 4 ° C. Tome el cuidado apropiado cuando se usan estos reactivos. Manipular con guantes, bata de laboratorio y gafas de seguridad a una campana química. Nota: Preparar PFA al 4% en el día antes de que las perfusiones. Determinar el volumen de 4% PFA como una función de la edad, el número y especies de animales. </li><li> Preparar la solución de crioprotector: En 250 ml de solución salina tamponada con fosfato 0,2 M, mezclar 5 g de polivinilpirrolidona, 150 g de sacarosa y 2,5 g de cloruro de sodio. Después de la disolución completa, añadir 150 ml de etilenglicol y ajustar a 500 ml con agua destilada. Almacenar la solución crioprotectora a 4 ° C. </li><li> Preparar solución salina 0,1 M tamponada con fosfato (PBS): añadir 18 g de NaCl a agua destilada 1 L mientras se agita. Después de la disolución completa, añadir 1 L 0,2 M de tampón de fosfato de sodio. </li><li> Preparar Phosphate Buffered Saline suplementado con 0,3% de Triton X100 (PBST): Añadir 3 ml de Triton X100 a 997 ml de PBS. </li><li> Preparar 0,05 M tampón Tris (pH 7,6): añadir 3,03 g de Tris-hidrocloruro y 0,70 g de Tris-base a 500 ml de agua destilada mientras se agitaba. </li><li> Preparar un 2% de suero de cabra en PBST: para una placa, preparar 30 ml de solución. Añadir 600 l de suero de cabra al 30 ml de PBST y mezclar bien. Añadir 2,5 ml por pocillo. Nota: El suero utilizado debe provenir de especies utilizadas para la producción de anticuerpo secundario </li><li> Preparar anticuerpo policlonal de conejo contra la proteína c-FOS (1: 4000, SC-52) en PBST con albúmina de suero bovino (0,25%). Para una placa, preparar 30 ml de solución. Añadir 75 mg de albúmina de suero bovino a 30 ml PBST y mezclar bien. A continuación, añadir 7,5 l de anticuerpo policlonal de conejo contra la proteína c-Fos. </li><li> Preparar anticuerpo de cabra biotinilado anti-conejo (1: 500) en PBST con albúmina de suero bovino (0,25%). Para una placa, preparar 30 ml de solución. Añadir 75 mg de albúmina de suero bovino a 30 ml PBST y mezclar bien. Luego añade60 l de anticuerpo anti-conejo de cabra biotinilado. </li><li> Preparar avidina-biotina-peroxidasa (1: 250) en (solución ABC) PBST. Para una placa, preparar 30 ml de solución. Añadir 120 l de reactivo A y 120 l de reactivo B y 30 ml de PBST y mezclar bien. Nota: La solución de ABC se debe preparar al menos 30 minutos antes de su uso. </li><li> Prepare la solución de sustrato. Inmediatamente antes de su uso, preparar la solución de la siguiente manera (para una placa): añadir 20 mg de sulfato de amonio níquel y 10 mg de tetrahidrocloruro de 3,3-diaminobencidina a 50 ml de tampón Tris. Filtrar y protegerlo de la luz. Añadir 2,0 ml por pocillo. En la solución restante (25 ml) añadir 17 l de H 2 O 2 (H 2 O 2 solución al 30% en H2O). Añadir 2,0 ml por pocillo. Nota: El cuidado apropiado debe tener cuidado al utilizar estos reactivos. Manipular con guantes y batas de laboratorio. </li></ol> 2. c-fos Inducción y procesamiento de tejidos in vivo Nota: Los experimentos se realizaron en ratas (Sprague Dawley) o ratones (C57BL / 6). <ol><li> Colocar los animales en una caja hermética ventilado con un hipóxica (O 2 8% N equilibrado 2) o hipercápnica (CO 2 4%, O 2 21% N equilibrado 2) mezcla de gas durante 2 horas (Figura 2A). </li><li> Anestesiar al animal con inyección intraperitoneal de pentobarbital (100 mg / kg). Perfundir el transcardially animal con PFA al 4% 20. Manipular con guantes de uso y cuidado a una campana química. </li><li> Después de la perfusión, diseccionar el cerebro 20 y sumergirlo en 7 ml de PFA al 4% en un tubo de 15 ml durante 48 horas a 4 ° C. A continuación, retire el cerebro de la PFA y sumergirse por completo en la solución de crioprotector. Almacenar a -18 ° C (Figura 3). Desechar el resto del cuerpo del animal por el PA de residuos de procesamiento apropiadoThway. Nota: crioprotección es un paso entre la fijación de PFA y la congelación. Se reduce la formación de cristales de hielo en las células con una solución cuya congelación será en forma amorfa. Las muestras fijas deben ser impregnadas en la solución crioprotectora (preparado en la etapa 1.3) durante al menos 24 horas a 4 ° C. Manipular con cuidado y guantes bajo el capó química. </li></ol> 3. inducción de c-fos y Tejidos de procesamiento Ex Vivo Nota: Los experimentos se realizaron en ratas recién nacidas o ratones solamente. <ol><li> Aislar el SNC como se describe por Suzue 19. Colocar en una cámara de registro y superfuse continuamente con fluido cerebroespinal artificial a una velocidad de 7,5 ml / min a 26 ° C 21 (LCRa: en mM: 130,0 NaCl, 5,4 KCl, 0,8 CaCl 2, 1,0 MgCl 2, 26,0 NaHCO 3, 30,0 D-glucosa; saturada con O 2 y se ajustó a pH 7,4 por gaseamiento con 95% O 2 y 5% De CO 2) (Figura 2B). </li><li> Sustituir el LCRa con un LCRa (misma composición burbujeado con 95% N 2 y 5% de CO 2, pH 7,4) desoxigenada por hipoxia o por un LCRa acidificada (estándar LCRa con NaHCO3 reducido a 10,0 mM, burbujeado con 95% de O 2 y 5% de CO 2) para la hipercapnia. Aplicar la estimulación de 30 min (Figura 2B). </li><li> Ex vivo, después de que el período de inducción, transfiera el SNC de ratones o ratas recién nacidas en 2,5 ml de PFA al 4% en un tubo de 2,5 ml durante 48 horas y se almacena a -18 ° C en una solución crioprotectora para su uso posterior (Figura 3). Nota: Ex vivo, no es necesario para perfundir los animales. Un estudio anterior sugiere que las pequeñas muestras que miden menos de 10 mm de diámetro puede ser fijado por simple difusión 22. Una tasa de cotización de penetración (distancia, en mm, para la difusión fijador en el tejido) para aldehído es 2 o 3 mm / hr. </li&gt; </ol> 4. Tallo Cerebral Seccionamiento Nota: A partir de este paso a la final, el protocolo es estrictamente el mismo para in vivo y ex vivo inducciones. <ol><li> Antes de cortar, coloque un individuo bien insertar en una placa de 12 pocillos y añadir 2,5 ml de PBS en cada pocillo. </li><li> Hacer secciones coronales seriadas (40 micras) del tronco cerebral con un criostato y recogerlas en la placa de 12 pocillos. Para todo el tronco cerebral de adultos, que cerca de 70 rebanadas (Figura 3). Nota: Es posible sección de tejido de varios animales en paralelo en un plato. </li></ol> 5. Procedimientos inmunohistológicos (Tabla 1) Nota: Durante todo el procedimiento, las secciones se mantienen en los insertos así. <ol><li> Día 1 - destrucción endógena actividad de la peroxidasa, no específica bloqueo sitio de unión, y la incubación con el anticuerpo primario (Figura 4) <ol><li> lavarlas secciones durante 10 minutos con 0,1 M PBS a temperatura ambiente (2,5 ml por pocillo). Repetir 3 veces. </li><li> Suprimir la actividad peroxidasa endógena por incubación de las secciones coronales de 30 min a TA con peróxido de hidrógeno H 2 O 2, 3% en PBS 0,1 M (2,5 ml por pocillo). </li><li> Lavar las secciones durante 10 minutos con 0,1 M PBS a temperatura ambiente (2,5 ml por pocillo). Repetir 3 veces. </li><li> Bloquear el sitio de unión no específica mediante la incubación de las secciones coronales de 1 hr a RT con suero de cabra (2%) en PBST. </li><li> Incubar las secciones coronales de 48 horas a 4 ° C con un anticuerpo policlonal de conejo contra la proteína c-FOS (1: 4000, sc-52,) en PBST con albúmina de suero bovino (0,25%) (2,5 ml por pocillo). </li></ol></li><li> Día 3 - incubación con el anticuerpo y el desarrollo de una reacción de color secundaria (Figura 4) <ol><li> Lavar las secciones durante 10 minutos con PBS 0,1 M a temperatura ambiente (2,5 ml por pocillo). Repetir 3 veces. </li><li> incubar lasecciones coronales de 1 hora a TA con un anticuerpo biotinilado de cabra anti-conejo (1: 500) en PBST con albúmina de suero bovino (0,25%) (2,5 ml por pocillo). Nota: El investigador también puede utilizar un anticuerpo secundario acoplado a una sonda fluorescente en esta etapa. En este caso, detenga el protocolo en esta etapa y examinar directamente usando un microscopio de fluorescencia. </li><li> Lavar las secciones durante 10 min con PBST a TA (2,5 ml por pocillo). Repetir 3 veces. </li><li> Incubar las secciones coronales de 1 hr con una avidina-biotina-peroxidasa (1: 250) en PBST (2,5 ml por pocillo). </li><li> Lavar las secciones durante 10 min con PBST a TA (2,5 ml por pocillo). Repetir 2 veces. </li><li> Lavar las secciones durante 10 min con 0,05 M Tris-tampón a RT (2,5 ml por pocillo). Repetir 2 veces. </li><li> Incubar las secciones coronales con 0,02% tetrahidrocloruro de 3,3-diaminobencidina, sulfato de amonio níquel 0,04% y peróxido de hidrógeno 0,01% en M tampón Tris 0,05 (pH 7,6) unat RT (2,0 ml por pocillo). En la solución restante (25 ml) añadir 17 l de H 2 O 2 (H 2 O 2 solución al 30% en H2O) (2,0 ml por pocillo). Nota: El investigador debe determinar los tiempos de desarrollo bajo microscopio de luz. Sin embargo, de 5 a 10 minutos proporciona una buena intensidad de la tinción. </li><li> Cuando la intensidad de la tinción es óptima (controlada bajo microscopio de luz, véase la Figura 5 y la Figura 6), se detiene la reacción por lavado de las secciones durante 10 minutos con PBS 0,1 M a temperatura ambiente (2,5 ml por pocillo). Repetir 4 veces. A continuación, lavar las secciones con agua destilada. </li></ol></li><li> Muestreo de montaje (manejar con cuidado y guantes bajo el capó química) <ol><li> secciones de montaje en serie de diapositivas y secar al aire. Para ello, se extendió cuidadosamente las secciones con el fin rostro-caudal con los cepillos en las diapositivas. etiquetar claramente las diapositivas de acuerdo a las muestras. </li><li> Deshidratar con Al absolutahol: sumergir los portaobjetos durante 30 segundos a temperatura ambiente en un baño de alcohol absoluto. Repetir dos veces. </li><li> Claro con xileno: sumergir los portaobjetos en baño de xileno durante 3 minutos a temperatura ambiente. Repetir dos veces. </li><li> Cubreobjetos los portaobjetos con medio de montaje. Para ello, aplicar 5 gotas de medio de montaje de la diapositiva y luego aplicar el cristal de la cubierta por la expulsión de las burbujas de aire. Deje secar al aire durante 48 horas. </li></ol></li></ol> 6. datos y análisis estadístico <ol><li> Examinar secciones bajo un microscopio de luz. Contar visualmente neuronas FLI a gran aumento (200x) utilizando puntos de referencia estándar de 23,24. La tinción puntiforme c-Fos se localiza en los núcleos de neuronas. </li><li> Para cada área analizada, contar el número de células c-fos-positivo por sección y comparar el número promedio entre las condiciones de control y estimulados. Dependiendo de la normalidad de los datos, usar la prueba t de Student para datos independientes o la prueba de Mann-Whitney. Las diferencias se consideraron significativas si P0; 0,05. Trazar la distribución de las neuronas FLI en un dibujo (100 aumentos) utilizando un tubo dibujo adjunto al microscopio y se fotografiaron con una cámara digital (Figura 5). </li></ol>

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<li>Bodineau, L., Cayetanot, F., Frugiere, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fos+study+of+ponto-medullary+areas+involved+in+the+in+vitro+hypoxic+respiratory+depression%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Fos study of ponto-medullary areas involved in the in vitro hypoxic respiratory depression.</a> Neuroreport. 12, 3913-3916 (2001).</li>
<li>Takakura, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+chemoreceptor+inputs+to+retrotrapezoid+nucleus+%28RTN%29+CO2-sensitive+neurons+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Peripheral chemoreceptor inputs to retrotrapezoid nucleus (RTN) CO2-sensitive neurons in rats.</a> J Physiol. 572, 503-523 (2006).</li>
<li>Mulkey, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+control+by+ventral+surface+chemoreceptor+neurons+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Respiratory control by ventral surface chemoreceptor neurons in rats.</a> Nat Neurosci. 7, 1360-1369 (2004).</li>
<li>Finley, J. C., Katz, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+central+organization+of+carotid+body+afferent+projections+to+the+brainstem+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">The central organization of carotid body afferent projections to the brainstem of the rat.</a> Brain Res. 572, 108-116 (1992).</li>
<li>Bodineau, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Data+supporting+a+new+physiological+role+for+brain+apelin+in+the+regulation+of+hypothalamic+oxytocin+neurons+in+lactating+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Data supporting a new physiological role for brain apelin in the regulation of hypothalamic oxytocin neurons in lactating rats.</a> Endocrinology. 152, 3492-3503 (2011).</li>
<li>Okada, Y., Chen, Z., Jiang, W., Kuwana, S., Eldridge, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical+arrangement+of+hypercapnia-activated+cells+in+the+superficial+ventral+medulla+of+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol+%281985%29%22%5BJournal%5D)">Anatomical arrangement of hypercapnia-activated cells in the superficial ventral medulla of rats.</a> J Appl Physiol (1985). 93, 427-439 (2002).</li>
<li>Saadani-Makki, F., Frugiere, A., Gros, F., Gaytan, S., Bodineau, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+adenosinergic+A1+systems+in+the+occurrence+of+respiratory+perturbations+encountered+in+newborns+following+an+in+utero+caffeine+exposure.+a+study+on+brainstem-spinal+cord+preparations+isolated+from+newborn+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Involvement of adenosinergic A1 systems in the occurrence of respiratory perturbations encountered in newborns following an in utero caffeine exposure. a study on brainstem-spinal cord preparations isolated from newborn rats.</a> Neuroscience. 127, 505-518 (2004).</li>
<li>Morgan, J. I., Cohen, D. R., Hempstead, J. L., Curran, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+patterns+of+c-fos+expression+in+the+central+nervous+system+after+seizure%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mapping patterns of c-fos expression in the central nervous system after seizure.</a> Science. 237, 192-197 (1987).</li>
<li>Sagar, S. M., Sharp, F. R., Curran, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+c-fos+protein+in+brain%3A+metabolic+mapping+at+the+cellular+level%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Expression of c-fos protein in brain: metabolic mapping at the cellular level.</a> Science. 240, 1328-1331 (1988).</li>
<li>Herdegen, T., Kovary, K., Leah, J., Bravo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+temporal+and+spatial+distribution+of+JUN%2C+FOS%2C+and+KROX-24+proteins+in+spinal+neurons+following+noxious+transsynaptic+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Specific temporal and spatial distribution of JUN, FOS, and KROX-24 proteins in spinal neurons following noxious transsynaptic stimulation.</a> J Comp Neurol. 313, 178-191 (1991).</li>
<li>Marina, N., Morales, T., Diaz, N., Mena, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suckling-induced+activation+of+neural+c-fos+expression+at+lower+thoracic+rat+spinal+cord+segments%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Suckling-induced activation of neural c-fos expression at lower thoracic rat spinal cord segments.</a> Brain Res. 954, 100-114 (2002).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

C-fos es un gen temprano inmediato, y la detección de su producto, la proteína c-FOS, se utiliza clásicamente para identificar poblaciones neuronales implicados en las respuestas respiratorias específicas in vivo y ex vivo 11,13,25,28 16-18, 27,32,33. Los pasos críticos dentro del protocolo Tenga cuidado durante la etapa de perfusión. La solución PFA 4% debe estar bien preparado y...

El gen c-fos se identificó por primera vez a principios de 1980 1,2 y su producto se caracterizó en 1984 como una proteína nuclear que tiene propiedades de gen activador de 3,4. Participa en los mecanismos a largo plazo asociados con la estimulación de las neuronas. De hecho, los cambios en la actividad neuronal conducen a segundo mensajero de señalización cascadas que inducen la expresión del gen temprano inmediato c-fos, que induce la producción del factor de transcripción c-FOS. Este último inicia la expresión de los genes tardíos y por lo tanto participa en las respuestas de adaptación del sistema nervioso a muchos tipos diferentes de estímulos 4. Por lo tanto, desde el final de 1980 5,6, detección de la proteína c-FOS se ha utilizado con frecuencia para estudiar los efectos de factores exógenos sobre la transcripción de genes en general 4 y sobre la actividad del sistema nervioso central (CNS) para trazar las vías neuronales involucrados en diferentes fisiológicacondiciones al. La expresión basal c-fos se ha estudiado en diversas especies, incluyendo ratones, rata, gato, mono, y humano 4. De este modo, la cinética de su expresión es relativamente bien conocidos. La activación de la transcripción es rápida (5-20 min) 7,8, y la acumulación de ARNm alcanza un máximo entre 30 y 45 min después del comienzo de la estimulación 9 y disminuye con una corta vida media de 12 min. La síntesis de la proteína c-FOS sigue la acumulación de ARNm y se pudo detectar mediante inmunohistoquímica en 20 a 90 minutos después de la estimulación 6. Análisis de la expresión de c-fos se utiliza clásicamente en estudios in vivo para identificar la red central de la respiración que participan en las respuestas ventilatorias a la hipoxia o hipercapnia 10-14. Más recientemente, esta herramienta también se utilizó en las preparaciones del tronco cerebral ex vivo para explorar adaptaciones de red respiratorias centrales a la hipoxia o hypercapnia 15-18. De hecho, estas preparaciones generan una actividad rítmica clásica asimilada a la unidad central de la respiración 19. Por lo tanto, este tipo de preparación tiene la ventaja de ser completamente deafferented, y por lo tanto, los resultados con respecto a la expresión de c-fos sólo reflejan las consecuencias de una estimulación central sin ninguna intervención de las estructuras periféricas. La detección c-FOS podría hacerse por métodos inmunohistoquímicos o immunohistofluorescence. inmunodetección indirecta requiere el uso de un anticuerpo primario contra c-FOS y un anticuerpo secundario dirigido contra la especie en la que se produjo el anticuerpo primario. Para el método de inmunohistoquímica, el anticuerpo secundario se conjuga con una enzima (peroxidasa, por ejemplo) que actúa sobre un sustrato (H 2 O 2 para la peroxidasa). El producto de la reacción enzimática se desarrolla por un cromógeno (tetrahydrochlorid 3,3-diaminobencidinae), que tiñe y se puede observar en el microscopio de luz. La reacción podría ser reforzado con sulfato de amonio níquel. Estos métodos permiten la detección de sustancias activas neuronas durante diferentes retos fisiológicos y, por tanto, la identificación y / o la cartografía de las vías periféricas y centrales que participan en las respuestas fisiológicas consecutivos.

<table><tbody><tr><td>Placa de cultivo celular 12 pocillos</td><td>Costa</td><td>35/3</td><td></td></tr><tr><td>15 mm Insertos Netwell con malla membrana</td><td>de poliéster Corning</td><td>3477</td><td>Los insertos de pocillos de 15 mm de diámetro tienen 74&micro; m Fondos de malla de poliéster unidos a inserciones de poliestireno</td></tr><tr><td>Anticuerpo primario (anticuerpo policlonal de conejo contra la proteína c-Fos)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-52</td><td></td></tr><tr><td>Vectastain Elite ABC KIT&nbsp;</td><td>Laboratorios de vectores</td><td>PK-6101</td><td></td></tr> <tr><td>(Anticuerpo secundario IgG de conejo)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4*2H2O</td><td>Sigma</td><td>71505</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>NaOH 0.1N</td><td>Sigma</td><td>43617</td><td></td></tr><tr><td>Polivinilo-Pirrolidona</td><td>Sigma</td><td>PVP-360</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Sigma</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Etilenglicol</td><td>Sigma</td><td>33068</td><td></td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Trisma HCl</td><td>Sigma</td><td>T5941</td><td></td></tr><tr><td>Trisma Base</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>3.3-diaminobenzidina tetraclorhidrato &nbsp;</td><td>Rockland</td><td>DAB50</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de níquel y amonio</td><td>Alfa Aesar</td><td>12519</td><td></td></tr><tr><td>H2O2</td><td>Sigma</td><td>H1009</td><td></td></tr><tr><td>Xileno</td><td>Sigma</td><td>33817</td><td></td></tr><tr><td>Entellan Neo</td><td>Merck Millipore</td><td>107961</td><td></td></tr><tr><td>Slide&nbsp;</td><td>Thermo-scientific</td><td>1014356190</td><td>Superfrost ultraplus</td></tr><tr><td>Cubierta de vidrio</td><td>Thermoscientific Q10143263NR1</td><td></td><td>24 x 60mm</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr></tbody></table>

la proteína c-fos detección inmunohistoquímico: una herramienta útil como marcador de vías centrales implicados en las respuestas fisiológicas específicas<em&gt; en vivo</em&gt; y<em&gt; ex vivo</em

The c-FOS Protein Immunohistological Detection: A Useful Tool As a Marker of Central Pathways Involved in Specific Physiological Responses In Vivo and Ex Vivo

Muchos estudios tratan de identificar y mapear las regiones del cerebro implicadas en las regulaciones fisiológicas específicas. Los c-fos proto-oncogén, un gen temprano inmediato, se expresa en neuronas en respuesta a diversos estímulos. El producto de proteína se puede detectar fácilmente con técnicas inmunohistoquímicas que conducen a la utilización de la detección de c-FOS para mapear grupos de neuronas que muestran cambios en su actividad. En este artículo, nos hemos centrado en la identificación de poblaciones neuronales del tronco cerebral implicados en la adaptación ventilatoria a la hipoxia o hipercapnia. Se describieron dos enfoques para identificar poblaciones neuronales implicadas en vivo en animales y ex vivo en las preparaciones del tronco cerebral deafferented. En vivo, los animales fueron expuestos a mezclas de gases con hipercapnia o hipoxia. Ex vivo, preparaciones deafferented fueron perfundidas con hipoxia o hipercapnia líquido cefalorraquídeo artificial. En ambos casos, ya sea de control o en los animales in vivo ex preparaciones in vivo se mantuvieron en condiciones de normoxia y normocápnicos. La comparación de estos dos enfoques permite la determinación del origen de la activación es decir, neuronal, periférico y / o central. In vivo y ex vivo, se recogieron brainstems, se fijaron, y cortados en secciones. Una vez que se prepararon secciones, la detección inmunohistoquímica de la proteína c-FOS se hizo con el fin de identificar los grupos de tronco cerebral de células activadas por estímulos hipóxicos o hipercapnia. Las células marcadas se contaron en estructuras respiratorias del tronco cerebral. En comparación con la condición de control, la hipoxia o hipercapnia aumentado el número de células marcadas c-fos en varios sitios del tronco cerebral específicas que son, pues, constitutiva de las vías neuronales implicados en la adaptación de la unidad central de la respiración.

La detección de c-fos es una herramienta útil que permite la identificación de grupos de células activadas en condiciones específicas, tales como la hipoxia e hipercapnia vivo (Figura 2A) en o en situaciones que imitan estas condiciones ex vivo (Figura 2 B). En vivo, recién nacido, joven , o roedores adultos se colocaron en una caja hermética en que el medio gaseoso es continuamente renovada por una mezcla de gases con...

Aquí, presentamos un protocolo basado en la detección inmunohistológica de proteínas c-FOS, una técnica clásica utilizada para la identificación de poblaciones neuronales involucradas en respuestas fisiológicas específicas in vivo y ex vivo.

La proteína c-Fos detección inmunohistoquímico: una herramienta útil como marcador de vías centrales implicados en las respuestas fisiológicas específicas<em&gt; En Vivo</em&gt; y<em&gt; Ex Vivo</em

Many studies seek to identify and map the brain regions involved in specific physiological regulations. The proto-oncogene c-fos, an immediate early gene, ...

El objetivo general de esta detección inmunohistoquímica contra la proteína c-FOS es evaluar la actividad neuronal en tejidos cerebrales. Este método puede ayudar a responder nuestras preguntas clave en el campo de la neurofisiología, como la cartografía cerebral y la identificación de regiones cerebrales implicadas en regulaciones fisiológicas específicas. La principal ventaja de esta técnica es que el gen c-FOS presenta una baja expresión en ausencia de estimulación, lo que permite una cuantificación más sencilla de la actividad neuronal en nuestra simulación experimental.Para comenzar este procedimiento, lave los cortes coronales del bulbo raquídeo durante 10 minutos con PBS 0,1 molar a temperatura ambiente. Repita el lavado tres veces. A continuación, suprima la actividad de peroxidasa endógena incubando los cortes con peróxido de hidrógeno al 3 % en PBS 0,1 molar durante 30 minutos a temperatura ambiente.Luego, lave las secciones durante 10 minutos con PBS 0,1 molar a temperatura ambiente y repita tres veces. Bloquee los sitios de unión no específicos incubando las secciones coronales con suero de cabra al 2% en PBST durante una hora a temperatura ambiente. Posteriormente, inc

the-c-fos-protein-immunohistological-detection-useful-tool-as-marker

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Este protocolo describe cómo la imagen de interacciones proteína-proteína mediante un ensayo basado en la proximidad FRET.

Imágenes de interacciones proteína-proteína In vivo</em

El protocolo de inmunofluorescencia indirecta descrito en este artículo permite la detección y la localización de las proteínas en la glándula mamaria del ratón. Un método completo se da para preparar muestras de glándula mamaria, para llevar a cabo la inmunohistoquímica, a la imagen las secciones de tejido mediante microscopía de fluorescencia, y para reconstruir imágenes.

Inmunofluorescencia indirecta en secciones congeladas de ratón Glándula Mamaria

El objetivo de este estudio es identificar las redes cerebrales relacionadas con la recompensa distribuidos por delinear una técnica fiable inmunohistoquímico mediante la activación celular de c-fos para medir los cambios simultáneos en las vías de la dopamina y sitios de terminal después de la novela de la ingestión de grasa y azúcar en ratas.

Detección simultánea de c-Fos activación de sitios de recompensa dopaminérgico mesolímbico y mesocortical Siguiendo Naive La ingestión de azúcar y grasa en ratas

Aquí se presenta un protocolo de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) para estudiar las alteraciones moleculares en Fos-expresión de conjuntos neuronales a partir de tejido cerebral en fresco y congelados. El uso de tejido congelado permite el aislamiento FACS de muchas áreas del cerebro a través de múltiples sesiones para maximizar el uso de sujetos animales valiosos.

La fluorescencia de células activadas (FACS) y análisis de expresión génica de las neuronas que expresan Fos-Fresco y de tejido congelado de cerebro de rata

En este trabajo describimos un método inmunoquímico sensible para mapear la distribución espacial de los derivados de oxidación de 5mC basado en el uso de anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa y la amplificación de la señal de tiramida.

La detección de formas modificadas de la citosina Uso Sensitive Inmunohistoquímica

Isoeléctrica capilar es una técnica basada en anticuerpos, ultrasensible, alto rendimiento, permitiendo la caracterización detallada de las proteínas y sus isoformas de muestras biológicas muy pequeñas. A continuación describe un protocolo para la detección y cuantificación de proteínas específicas y sus isoformas de manera automatizada y robotizada.

Detección altamente sensible y cuantitativa de las proteínas y sus isoformas por método capilar isoeléctrica

Aquí se presentan los protocolos para la caracterización inmunohistoquímica y la localización del péptido de orexina, los receptores de orexina y los receptores endocannabinoides en el intestino y los cerebros de los modelos de pez cebra adultos normales e inducidos por la dieta (DIO) utilizando modelos de pez cebra adultos que utilizan modelos de pez cebra adultos que utilizan modelos de pez cebra adultos que utilizan modelos de pez cebra adultos que utilizan modelos de pez cebra adultos...

Identificación de receptores de orexina y endocannabinoides en peces cebra adultos mediante métodos de inmunoperoxidasa e inmunofluorescencia

Los cambios morfológicos ocurren en las células de fibroblastos inmune sensibles después de la activación y promueven alteraciones en el reclutamiento celular. Utilización de imágenes de 2 fotones junto con una proteína específica de fibroblastos de ingeniería genética 1 (FSP1)-cre; tdTomato floxed-stop-floxed (TB/TB) línea de ratón y verde fluorescently etiquetado lipopolysaccharide-FITC, podemos ilustrar la absorción altamente específica de lipopolisacárido en fibroblastos dérmicos y cambios...

In Vivo 2-Color 2-Photon Imaging of Genetically-Tagged Reporter Cells in the Skin

Aquí, presentamos un protocolo que utiliza colorantes de infrarrojo cercano junto con inmunohistoquímica y escaneo de alta resolución para analizar las proteínas en las regiones cerebrales.

Uso de fluorescencia de infrarrojo cercano y escaneo de alta resolución para medir la expresión de proteína en el cerebro de roedores

Se empleó la hibridación multiplex in situ (ISH) para visualizar simultáneamente las transcripciones de dos receptores acoplados a la proteína G y un factor de transcripción en todo el complejo ganglionar vago del ratón adulto. Este protocolo podría utilizarse para generar mapas precisos de los perfiles transcripcionales de las neuronas aferentes vagales.

Detección de la expresión del receptor acoplado a la proteína G en neuronas aferentes vagas de ratón mediante hibridación multiplex in situ

Aprende la detección inmunohistoquímica de la proteína c-FOS para evaluar la actividad neuronal en tejidos cerebrales. Este método permite identificar poblaciones neuronales activas y mapear regiones implicadas en respuestas fisiológicas específicas.

La proteína c-Fos detección inmunohistoquímico: una herramienta útil como marcador de vías centrales implicados en las respuestas fisiológicas específicas En Vivo y Ex Vivo (Video) | JoVE Journal

La proteína c-Fos detección inmunohistoquímico: una herramienta útil como marcador de vías centrales implicados en las respuestas fisiológicas específicas

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