Fagos mediada por la entrega de apuntado sRNA Construye para derribar la expresión génica en E. coli

El objetivo general de este procedimiento es eliminar genes de interés en una población creciente de E. coli. Las eliminaciones de genes se utilizan a menudo para explorar cuestiones básicas de la función de los genes. Estos métodos también pueden tener aplicación en biología sintética.

Por ejemplo, en el silenciamiento de genes no deseados como los factores de virulencia. La principal ventaja de esta técnica es que se puede realizar en cultivos discontinuos de E. coli sin modificación genética previa, con resultados observables a las pocas horas. Para empezar, utilizando un plásmido que contenga un casete de expresión de ARNs diseñado según el protocolo de texto, lleve a cabo la mutagénesis dirigida al sitio en la secuencia identificando primero la secuencia guía de 24 pares de bases en el casete de expresión.

Diseñe y sintetice cebadores directos e inversos con regiones cortas de homología con el casete de ARNs existente, flanqueando la nueva secuencia guía de 24 pares de bases. Preparar un cultivo de cinco mililitros de E. coli en LB y antibióticos portadores del fagémido de expresión de ARNs moltel. Haga crecer las células durante la noche a 37 grados centígrados con agitación.

Después de extraer y purificar el fagémido de ARNs del cultivo, prepare dos reacciones de PCR, utilizando de 10 a 50 veces la cantidad recomendada de molde de ADN para el fagémido de ARNs y la polimerasa de alta fidelidad. Prepare una reacción con el cebador delantero y otra con el reverso. Después de usar condiciones estándar de PCR para ejecutar las reacciones, combine las dos reacciones en un tubo de microcentrífuga.

A continuación, recocer los productos calentándolos a 98 grados centígrados en un baño de agua hirviendo. Apague inmediatamente la fuente de calor y deje que el baño vuelva lentamente a la temperatura ambiente durante las próximas una o dos horas. Para eliminar el ARNs molde no mutado, agregue un microlitro de enzima de restricción DpnI a la mezcla e incube a 37 grados Celsius durante una hora, o durante el tiempo recomendado por el fabricante para una digestión completa.

A continuación, transforme las células de E. coli químicamente competentes con uno a cinco microlitros del producto de PCR recocido. A continuación, aísle las colonias individuales mediante siembra selectiva en placas LB con antibióticos. Verificar la incorporación de la secuencia guía correcta con PCR de colonias.

Utilice una punta de pipeta de 200 microlitros para recolectar una pequeña cantidad de células de una sola colonia transformada. Añadir las células recogidas a 50 microlitros de agua libre de nucleasas en un tubo de microcentrífuga y mezclar mediante pipeteo. Luego, con un termociclador de sobremesa o un baño de agua hirviendo, lise las células calentándolas a 95 grados centígrados durante dos minutos.

Utilizando un microlitro de las células lisadas como molde de ADN, realice la PCR de acuerdo con las condiciones que se muestran aquí. Después de verificar la secuencia guía correcta, inocular un cultivo de cinco mililitros con el clon de ARNs correcto y cultivar las células durante la noche. Al día siguiente, prepare un caldo de glicerol combinando 750 microlitros de cultivo nocturno con 250 microlitros de glicerol al 60% en un criotubo con tapón de rosca.

Para preparar caldos de fagémidos envasados en M13, prepare un cultivo de cinco mililitros durante la noche de E. coli, portador del fagémido de expresión de ARNs. Además, prepare un cultivo nocturno de cinco mililitros de E. coli, portador del plásmido auxiliar M13KO7. Al día siguiente, después de purificar el ADN, co-transforme E. coli químicamente competente con un microlitro de cada uno de los fágemidos de expresión de ARNs y plásmido auxiliar.

Placa en agar LB con antibióticos a seleccionar para ambos constructos. La expresión de fagémidos es una gran carga de aptitud para las células y puede resultar en una disminución de la eficiencia de transformación. Puede ser necesario introducir el plásmido en dos pasos secuenciales de transformación.

Después de incubar las células transformadas durante la noche a 37 grados centígrados, prepare un cultivo de 10 mililitros a partir de una sola colonia de la cepa cotransformada. A la mañana siguiente, centrifugar el cultivo a 3300 x g durante 10 minutos. Recoja el sobrenadante y filtre a través de un filtro de 0,2 micras.

Almacene el filtrado de fagémidos empaquetado a cuatro grados centígrados. Después de preparar las células F + objetivo, de acuerdo con el protocolo de texto, inocule una sola colonia en un cultivo de cinco mililitros de medio LB con antibióticos y crezca durante la noche a 37 grados Celsius con agitación. Al día siguiente, use cinco mililitros de medio LB selectivo para diluir las células F + objetivo de uno a cien, y continúe incubando.

Cultive las células durante unas dos horas hasta que se obtenga una OD600 de 0,3, lo que indica un crecimiento en fase logarítmica. Las células objetivo para el silenciamiento deben estar en fase exponencial cuando la expresión del F pilus silencia para una infección eficiente por fagémidos. Agregue una proporción de uno a cien fagemidos empaquetados en M13 a las células objetivo para lograr una infección de casi el 99% de la población objetivo.

Deje que la infección proceda a 37 grados centígrados agitando durante 30 a 60 minutos. A continuación, ensaye el fenotipo de silenciamiento del ARNs según lo desee. Siguiendo el protocolo demostrado en este vídeo, el casete silenciador de ARNs del plásmido pAB.

001 fue modificado para apuntar a mKate2. Esta figura demuestra que la cepa de E. coli infectada con el fagémido anti-mKate2 no mostró fluorescencia detectable de mKate2 sobre el fondo. Sin embargo, esta cepa expresó GFP, lo que indica una absorción exitosa del fagomido.

En este experimento, una cepa de E. coli con un gen de cloranfenicol acetiltransferasa cromosómicamente integrado, o CAT, se infectó con un fagémido dirigido a CAT, y se probó el silenciamiento del ARNs de la resistencia al cloranfenicol. Las células en las que el fagémido se dirigía a CAT mostraron una supervivencia reducida a bajas concentraciones de cloranfenicol, y casi un 99% de muerte a concentraciones más altas. Por otro lado, las células no infectadas, o las células infectadas con ARNs que silenciaron mKate2, fueron resistentes al cloranfenicol en todas las concentraciones probadas.

Como se muestra aquí, la adición de ampicilina, utilizada para seleccionar solo bacterias portadoras del fagémido, redujo la supervivencia del cloranfenicol a niveles indetectables. El cambio del gen diana del ARNs y la producción de fagemido infectado se pueden realizar en cinco días. No olvide que trabajar con fagos puede ser extremadamente peligroso para otros experimentos en el laboratorio, y siempre se deben tomar precauciones, como el uso de material de laboratorio dedicado, al realizar este procedimiento para evitar la contaminación no deseada.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo diseñar, clonar y producir fagemidos infectados, con un ARNs para derribar cualquier gen de interés en una población de E. coli en crecimiento activo.