Name: -DamID siguientes: Genoma de toda la cartografía de la proteína-ADN Interacciones de alto rendimiento de secuenciación de fragmentos de ADN adenina-metilado (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-27T18:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Aprende el método DamID-seq para mapear interacciones proteína-ADN en células animales con alta resolución mediante secuenciación masiva. Esta técnica mejora el análisis de organización nuclear y regulación transcripcional.

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Agradecemos al Dr. Bas van Steensel por proporcionar los vectores de expresión de mamíferos DamID. Agradecemos al Centro de Análisis del Genoma de Yale y al Núcleo de Genómica del Centro de Células Madre de Yale por su asesoramiento sobre la preparación de bibliotecas de NGS y la implementación de la secuenciación de ADN de alto rendimiento. Este trabajo contó con el apoyo de la financiación inicial de la Facultad de Medicina de Yale, una subvención para el desarrollo científico de la Asociación Americana del Corazón (12SDG11630031) y una subvención inicial de Connecticut Innovations, Inc. (13-SCA-YALE-15).

<ol><li>van Steensel, B., Delrow, J., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+profiling+using+targeted+DNA+adenine+methyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Chromatin profiling using targeted DNA adenine methyltransferase.</a> Nat Genet. 27, 304-308 (2001).</li>
<li>van Steensel, B., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+in+vivo+DNA+targets+of+chromatin+proteins+using+tethered+dam+methyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Identification of in vivo DNA targets of chromatin proteins using tethered dam methyltransferase.</a> Nat Biotechnol. 18, 424-428 (2000).</li>
<li>Fu, A. Q., Adryan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scoring+overlapping+and+adjacent+signals+from+genome-wide+ChIP+and+DamID+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biosyst%22%5BJournal%5D)">Scoring overlapping and adjacent signals from genome-wide ChIP and DamID assays.</a> Mol Biosyst. 5, 1429-1438 (2009).</li>
<li>Guelen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Domain+organization+of+human+chromosomes+revealed+by+mapping+of+nuclear+lamina+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Domain organization of human chromosomes revealed by mapping of nuclear lamina interactions.</a> Nature. 453, 948-951 (2008).</li>
<li>Kalverda, B., Pickersgill, H., Shloma, V. V., Fornerod, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleoporins+directly+stimulate+expression+of+developmental+and+cell-cycle+genes+inside+the+nucleoplasm%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Nucleoporins directly stimulate expression of developmental and cell-cycle genes inside the nucleoplasm.</a> Cell. 140, 360-371 (2010).</li>
<li>Kubben, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+lamin+A-+and+progerin-interacting+genome+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Mapping of lamin A- and progerin-interacting genome regions.</a> Chromosoma. 121, 447-464 (2012).</li>
<li>Steglich, B., Filion, G. J., van Steensel, B., Ekwall, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inner+nuclear+membrane+proteins+Man1+and+Ima1+link+to+two+different+types+of+chromatin+at+the+nuclear+periphery+in+S.+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleus%22%5BJournal%5D)">The inner nuclear membrane proteins Man1 and Ima1 link to two different types of chromatin at the nuclear periphery in S. pombe.</a> Nucleus. 3, 77-87 (2012).</li>
<li>Harr, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+targeting+of+chromatin+to+the+nuclear+lamina+is+mediated+by+chromatin+state+and+A-type+lamins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Directed targeting of chromatin to the nuclear lamina is mediated by chromatin state and A-type lamins.</a> J Cell Biol. 208, 33-52 (2015).</li>
<li>Gonzalez-Aguilera, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+links+emerin+to+neuromuscular+junction+activity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis links emerin to neuromuscular junction activity in Caenorhabditis elegans.</a> Genome Biol. 15, R21(2014).</li>
<li>Wu, F., Yao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+compartmentalization+at+the+nuclear+periphery+characterized+by+genome-wide+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Spatial compartmentalization at the nuclear periphery characterized by genome-wide mapping.</a> BMC Genomics. 14, 591(2013).</li>
<li>Filion, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+protein+location+mapping+reveals+five+principal+chromatin+types+in+Drosophila+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Systematic protein location mapping reveals five principal chromatin types in Drosophila cells.</a> Cell. 143, 212-224 (2010).</li>
<li>Vogel, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+heterochromatin+proteins+form+large+domains+containing+KRAB-ZNF+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Human heterochromatin proteins form large domains containing KRAB-ZNF genes.</a> Genome Res. 16, 1493-1504 (2006).</li>
<li>Venkatasubrahmanyam, S., Hwang, W. W., Meneghini, M. D., Tong, A. H., Madhani, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide%2C+as+opposed+to+local%2C+antisilencing+is+mediated+redundantly+by+the+euchromatic+factors+Set1+and+H2A.Z%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genome-wide, as opposed to local, antisilencing is mediated redundantly by the euchromatic factors Set1 and H2A.Z.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 16609-16614 (2007).</li>
<li>Shimbo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MBD3+localizes+at+promoters%2C+gene+bodies+and+enhancers+of+active+genes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">MBD3 localizes at promoters, gene bodies and enhancers of active genes.</a> PLoS Genet. 9, e1004028(2013).</li>
<li>Orian, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+binding+by+the+Drosophila+Myc%2C+Max%2C+Mad%2FMnt+transcription+factor+network%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Genomic binding by the Drosophila Myc, Max, Mad/Mnt transcription factor network.</a> Genes Dev. 17, 1101-1114 (2003).</li>
<li>Artegiani, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tox%3A+a+multifunctional+transcription+factor+and+novel+regulator+of+mammalian+corticogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Tox: a multifunctional transcription factor and novel regulator of mammalian corticogenesis.</a> EMBO J. , (2014).</li>
<li>Schuster, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DamID+in+C.+elegans+reveals+longevity-associated+targets+of+DAF-16%2FFoxO%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">DamID in C. elegans reveals longevity-associated targets of DAF-16/FoxO.</a> Mol Syst Biol. 6, 399(2010).</li>
<li>Bianchi-Frias, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hairy+transcriptional+repression+targets+and+cofactor+recruitment+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Hairy transcriptional repression targets and cofactor recruitment in Drosophila.</a> PLoS Biol. 2, e178(2004).</li>
<li>Woolcock, K. J., Gaidatzis, D., Punga, T., Buhler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dicer+associates+with+chromatin+to+repress+genome+activity+in+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Dicer associates with chromatin to repress genome activity in Schizosaccharomyces pombe.</a> Nat Struct Mol Biol. 18, 94-99 (2011).</li>
<li>Luo, S. D., Shi, G. W., Baker, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+targets+of+the+D.+melanogaster+DSXF+protein+and+the+evolution+of+sexual+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Direct targets of the D. melanogaster DSXF protein and the evolution of sexual development.</a> Development. 138, 2761-2771 (2011).</li>
<li>Germann, S., Gaudin, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+in+vivo+protein-DNA+interactions+in+plants+by+DamID%2C+a+DNA+adenine+methylation-based+method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Mapping in vivo protein-DNA interactions in plants by DamID, a DNA adenine methylation-based method.</a> Methods Mol Biol. 754, 307-321 (2011).</li>
<li>Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Arabidopsis+LHP1+protein+colocalizes+with+histone+H3+Lys27+trimethylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The Arabidopsis LHP1 protein colocalizes with histone H3 Lys27 trimethylation.</a> Nat Struct Mol Biol. 14, 869-871 (2007).</li>
<li>Orian, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+profiling%2C+DamID+and+the+emerging+landscape+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Chromatin profiling, DamID and the emerging landscape of gene expression.</a> Curr Opin Genet Dev. 16, 157-164 (2006).</li>
<li>Vogel, M. J., Peric-Hupkes, D., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+in+vivo+protein-DNA+interactions+using+DamID+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Detection of in vivo protein-DNA interactions using DamID in mammalian cells.</a> Nat Protoc. 2, 1467-1478 (2007).</li>
<li>Greil, F., Moorman, C., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DamID%3A+mapping+of+in+vivo+protein-genome+interactions+using+tethered+DNA+adenine+methyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">DamID: mapping of in vivo protein-genome interactions using tethered DNA adenine methyltransferase.</a> Methods Enzymol. 410, 342-359 (2006).</li>
<li>de Wit, E., Greil, F., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+HP1+binding+in+Drosophila%3A+developmental+plasticity+and+genomic+targeting+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Genome-wide HP1 binding in Drosophila: developmental plasticity and genomic targeting signals.</a> Genome Res. 15, 1265-1273 (2005).</li>
<li>DamID mammalian vectors. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://research.nki.nl/vansteensellab/Mammalian_plasmids.htm">http://research.nki.nl/vansteensellab/Mammalian_plasmids.htm</a> (2015).</li>
<li>Illumina TruSeq adaptors & PCR primers. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://ethanomics.wordpress.com/chip-seq-library-construction-using-the-illumina-truseq-adapters/">https://ethanomics.wordpress.com/chip-seq-library-construction-using-the-illumina-truseq-adapters/</a> (2015).</li>
<li>Optimization of PCR cycles for NGS. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://ethanomics.wordpress.com/ngs-pcr-cycle-quantitation-protocol/">https://ethanomics.wordpress.com/ngs-pcr-cycle-quantitation-protocol/</a> (2015).</li>
<li>Bernstein, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NIH+Roadmap+Epigenomics+Mapping+Consortium%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">The NIH Roadmap Epigenomics Mapping Consortium.</a> Nat Biotechnol. 28, 1045-1048 (2010).</li>
<li>Encode Project Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+user%27s+guide+to+the+encyclopedia+of+DNA+elements+%28ENCODE%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">A user's guide to the encyclopedia of DNA elements (ENCODE).</a> PLoS Biol. 9, e1001046(2011).</li>
<li>Asp, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+remodeling+of+the+epigenetic+landscape+during+myogenic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genome-wide remodeling of the epigenetic landscape during myogenic differentiation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, E149-E158 (2011).</li>
<li>Hoppe, P. S., Coutu, D. L., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+technologies+sharpen+up+mammalian+stem+cell+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-cell technologies sharpen up mammalian stem cell research.</a> Nat Cell Biol. 16, 919-927 (2014).</li>
<li>Avital, G., Hashimshony, T., Yanai, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+is+believing%3A+new+methods+for+in+situ+single-cell+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Seeing is believing: new methods for in situ single-cell transcriptomics.</a> Genome Biol. 15, 110(2014).</li>
<li>Navin, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+genomics%3A+one+cell+at+a+time%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Cancer genomics: one cell at a time.</a> Genome Biol. 15, 452(2014).</li>
<li>Saliba, A. E., Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA-seq%3A+advances+and+future+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA-seq: advances and future challenges.</a> Nucleic Acids Res. 42, 8845-8860 (2014).</li>
<li>Nagano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+Hi-C+reveals+cell-to-cell+variability+in+chromosome+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell Hi-C reveals cell-to-cell variability in chromosome structure.</a> Nature. 502, 59-64 (2013).</li>
<li>Kind, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+dynamics+of+genome-nuclear+lamina+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell dynamics of genome-nuclear lamina interactions.</a> Cell. 153, 178-192 (2013).</li>
<li>Southall, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-type-specific+profiling+of+gene+expression+and+chromatin+binding+without+cell+isolation%3A+assaying+RNA+Pol+II+occupancy+in+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Cell-type-specific profiling of gene expression and chromatin binding without cell isolation: assaying RNA Pol II occupancy in neural stem cells.</a> Dev Cell. 26, 101-112 (2013).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Si las proteínas marcadas con Dam conservan las funciones de las proteínas endógenas debe examinarse antes de un experimento DamID-seq. La localización subcelular de las proteínas de la envoltura nuclear marcadas con Dam siempre debe determinarse y compararse con la de las proteínas endógenas. Para estudiar los factores de transcripción, se sugiere examinar si la proteína de fusión Dam puede rescatar las funciones de la proteína endógena en la regulación de la expresión génica. Esta prueba funcional se puede realizar en ...

ADN metiltransferasa identificación adenina (DamID) 1,2 es un método para detectar la proteína-DNA in vivo y es un enfoque alternativo a la cromatina immunoprecipitation (CHIP) 3. Se utiliza una cantidad relativamente baja de células y no requiere la reticulación química de la proteína con el ADN o un anticuerpo altamente específico. Este último es particularmente útil cuando la proteína diana está vagamente o indirectamente asociada con el ADN. DamID ha sido utilizado con éxito para mapear los sitios de unión de una variedad de proteínas, incluyendo proteínas de la envoltura nuclear, la cromatina asociada 4-10 11-13 proteínas, enzimas modificadoras de la cromatina 14, factores de transcripción y co-factores 15-18 y maquinarias RNAi 19. El método es aplicable en múltiples organismos incluyendo S. cerevisiae 13, S. pombe 7, C. elegans 9,17, D. melanogaster 5,11,18,20, A. thaliana 21,22, así como de ratón y células humanas líneas 6,8,10,23,24. El desarrollo del ensayo DamID se basó en la detección específica de fragmentos de ADN adenina-metilado en células eucariotas que carecen de adenina endógena metilación 2. Una proteína de fusión expresada, que consiste en la proteína de unión a ADN de interés y E. ADN metiltransferasa coli adenina (Dam), puede metilar la base adenina en las secuencias GATC que están en proximidad espacial (más significativamente dentro de 1 kb y hasta aproximadamente 5 kb) a los sitios de unión de la proteína en el genoma 2. Los fragmentos de ADN modificados se pueden amplificar específicamente y se hibridaron a microarrays para detectar los sitios de unión genómicas de la proteína de interés 1,25,26. Este método original DamID estaba limitada por la disponibilidad de microarrays y la densidad de sondas predeterminados. Por ello, hemos integrado secuenciación de alto rendimiento ena DamID 10 y designado el método DamID-ss. El gran número de cortos lee genera a partir DamID-ss permite la localización precisa de la proteína-DNA del genoma de ancho. Encontramos que DamID-ss proporciona una mayor resolución y un rango dinámico más amplio que DamID de microarrays para el estudio de la lámina genoma nuclear (NL) 10 asociaciones. Este método mejorado permite sondear asociaciones NL dentro de las estructuras de genes 10 y facilita las comparaciones con otros datos de secuenciación de alto rendimiento, tales como chip-ss y ARN-ss. El protocolo DamID-ss aquí descrito fue desarrollado inicialmente para el mapeo de asociaciones del genoma NL 10. Hemos generado una proteína de fusión mediante la inmovilización del ratón o Lamin B1 humano a E. coli DNA metiltransferasa adenina y se prueba el protocolo en 3T3 fibroblastos embrionarios de ratón, ratón C2C12 mioblastos 10 y IMR90 fibroblastos de pulmón fetal humano (datos no publicados). En este protocolo, empezamos con constructing vectores y expresar proteínas de fusión Dam-atados por la infección lentiviral en células de mamíferos 24. A continuación, se describen los protocolos detallados de amplificación de fragmentos de ADN adenina-metilado y la preparación de bibliotecas de secuenciación que deberían ser aplicables en otros organismos.

<table><tbody><tr><td>Sistemas de expresión lentiviral ViraPower</td><td>Life Technologies</td><td>K4950-00, K4960-00, K4970-00, K4975-00, K4980-00, K4985-00, K4990-00, K367-20, K370-20 y K371-20</td><td></td></tr><tr><td>Gateway BP Clonasa II Enzyme Mix</td><td>Life Technologies</td><td>11789-020</td><td></td></tr><tr><td>Gateway LR Clonasa II Enzyme Mix</td><td>Life Technologies</td><td>11791-020</td><td></td></tr><tr><td>DNeasy Blood & Kit de pañuelos (250)</td><td>QIAGEN</td><td>69506 o 69504&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Gateway pDONR 201</td><td>Life Technologies</td><td>11798-014</td><td></td></tr><tr><td>293T</td><td>cells American Type Culture Collection</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25300054">Trypsin-EDTA (0.05%), rojo de fenol</a></td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, alta glucosa, piruvato</td><td>Life Technologies</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Sigma</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td></td><td></td><td>marca no crítica</td></tr><tr><td>Marca EDTA</td><td></td><td></td><td>no crítica</td></tr><tr><td>200 Proof EtOH</td><td></td><td></td><td>marca no crítica</td></tr><tr><td>Marca de isopropanol</td><td></td><td></td><td>no crítica</td></tr><tr><td>Marca de acetato</td><td></td><td></td> de sodio <td>no crítica</td></tr><tr><td>DpnI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0176</td><td>suministrado con</td></tr><tr><td>adaptadores tampón DamID "AdRt" y "AdRb"</td> <td>secuencias integradas de DNA Technologies</td><td></td><td>disponibles en ref. 24; sin fosforilación del extremo 5' o 3' para evitar la autoligadura.</td></tr><tr><td>T4 ADN ligasa</td><td>Roche Life Science</td><td>10481220001</td><td>suministrado con tampón</td></tr><tr><td>DpnII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0543</td><td>suministrado con tampón</td></tr><tr><td>DamID DamID AdR_PCRSecuencias</td> <td>integradas de tecnologías</td><td></td><td>de ADN disponibles en ref. 24</td></tr><tr><td>Juego de soluciones de desoxinucleótidos (dNTP)</td><td>New England Biolabs</td><td>N0446</td><td>100 mM de dATP, dCTP, dGTP y dTTP</td></tr><tr><td>Ventaja 2&nbsp; Mezcla de polimerasa</td><td>Clontech</td><td>639201</td><td>suministra con tampón</td></tr><tr><td>1Kb Plus DNA Ladder</td><td>Life Technologies</td><td>10787018</td><td>1.0 y micro; g/&micro; l</td></tr><tr><td>Kit de purificación de PCR QIAquick</td><td>QIAGEN</td><td>28104 o 28106</td><td></td></tr><tr><td>Kit de purificación de PCR MinElute</td><td>QIAGEN</td><td>28004 o 28006</td><td>para un volumen de elución de menos de 30 y micro; l</td></tr><tr><td>Perlas SPRI / Agencourt AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td>aplican mezcla adicional y más tiempo de elución si es inferior a 40 y micro; l se utiliza tampón de elución</td></tr><tr><td>Tampón EB</td><td>QIAGEN</td><td>19086</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext dsDNA Fragmentasa</td><td>New England Biolabs</td><td>M0348</td><td>suministrado con tampón</td></tr><tr><td>T4 Tampón de reacción de ADN ligasa</td><td>New England Biolabs</td><td>B0202</td><td></td></tr><tr><td>T4 ADN polimerasa</td> New <td>England Biolabs</td><td>M0203</td><td></td></tr><tr><td>ADN polimerasa I, fragmento grande (Klenow)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0210</td><td></td></tr><tr><td>T4 Ponirueotida quinasa</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201</td><td></td></tr><tr><td>Fragmento de Klenow (3' &#8594; 5' exo-)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0212</td><td>suministrado con</td></tr><tr><td>adaptadores de secuenciación tampón</td><td>Secuencias integradas de DNA Technologies</td><td></td><td>disponibles en ref. 28</td></tr><tr><td>Kit de ligadura rápida</td><td>New England Biolabs</td><td>M2200</td><td>utilizado en 3.4.3; suministrado con tampón de reacción de ligadura rápida y cebador de secuenciación rápida de ADN ligasa T4</td></tr> 1 <tr><td>y 2</td> secuencias <td>integradas de DNA Technologies</td><td></td><td>disponibles en ref. 28</td></tr><tr><td>KAPA HiFi PCR Kit KAPA</td><td>Biosystems</td><td>KK2101 o KK2102</td><td>suministrado con KAPA HiFi DNA Polymerase, 5x KAPA HiFi Fidelity Buffer y 10 mM dNTP mix</td></tr><tr><td>agarosa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4679</td><td></td></tr><tr><td>bromuro de</td> <td>etidioSigma Aldrich</td><td>E1510-10ML</td><td>10 mg/ml</td></tr><tr><td>QIAquick Kit de extracción de gel</td><td>QIAGEN</td><td>28704 o 28706</td><td></td></tr><tr><td>iTaq Universal SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1725121 o 1725122</td><td></td></tr><tr><td>marca de espectrofotómetro</td><td></td><td></td><td>no crítica</td></tr><tr><td>0.45 &#956; m PVDF Marca del filtro</td><td></td><td></td><td>no crítico</td></tr><tr><td>25 ml Marca Seringe</td><td></td><td></td><td>no crítico</td></tr><tr><td>10 cm Placas de cultivo de</td><td></td><td></td> tejidos <td>marca no crítica</td></tr><tr><td>Placas de cultivo de tejidos de 6 pocillos</td><td></td><td></td><td>marca no crítica</td></tr><tr><td>Termociclador S1000</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C1000 Touch Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td></td><td>para qPCR</td></tr><tr><td>Marca del mezclador</td><td></td><td></td> de vórtice <td>no crítica</td></tr><tr><td>Calentador de bloque seco o marca del termomezclador</td><td></td><td></td><td>no crítica</td></tr><tr><td>Marca de</td><td></td><td></td> microcentrífuga <td>no crítica</td></tr><tr><td>Sistema de electroforesis de gel con fuente de</td><td></td><td></td> alimentación <td>marca no crítica</td></tr><tr><td>Soporte magnético</td><td></td><td></td><td>para la purificación del ADN con perlas de SPRI; debe contener tubos de 1,5-2 ml; marca no crítica</td></tr><tr><td>Transiluminador</td><td></td><td></td> UV <td>marca no crítica</td></tr><tr><td>Sistema de electroforesis E-gel</td><td>Life Technologies</td><td>G6400, G6500, G6512ST</td><td></td></tr></tbody></table>

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DamID-seq: Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions by High Throughput Sequencing of Adenine-methylated DNA Fragments

El ensayo de identificación de ADN adenina metiltransferasa (DamID) es un método poderoso para detectar interacciones proteína-ADN tanto a nivel local como en todo el genoma. Es un enfoque alternativo a la inmunoprecipitación de cromatina (ChIP). Una proteína de fusión expresada que consiste en la proteína de interés y la adenina metiltransferasa del ADN de E. coli puede metilar la base de adenina en motivos GATC cerca de los sitios de interacciones proteína-ADN. Los fragmentos de ADN metilados con adenina pueden amplificarse y detectarse específicamente. El ensayo DamID original detecta las ubicaciones genómicas de los fragmentos de ADN metilados mediante hibridación a micromatrices de ADN, que está limitada por la disponibilidad de micromatrices y la densidad de sondas predeterminadas. En este artículo, informamos sobre el protocolo detallado de integración de la secuenciación de ADN de alto rendimiento en DamID (DamID-seq). El gran número de lecturas cortas generadas a partir de DamID-seq permite detectar y localizar las interacciones proteína-ADN en todo el genoma con alta precisión y sensibilidad. Hemos utilizado el ensayo DamID-seq para estudiar las interacciones genoma-lámina nuclear (NL) en células de mamíferos, y hemos observado que DamID-seq proporciona una alta resolución y un amplio rango dinámico en la detección de interacciones genoma-NL. El enfoque DamID-seq permite sondear las asociaciones NL dentro de las estructuras génicas y comparar los mapas de interacción genoma-NL con otros datos genómicos funcionales, como ChIP-seq y RNA-seq.

La proteína de fusión Dam-V5-LMNB1 se verificó a ser co-localizada con la proteína Lamin B endógeno mediante tinción de inmunofluorescencia (Figura 1). La amplificación por PCR con éxito de fragmentos de ADN adenina-metilado es un paso clave para DamID-ss. Las muestras experimentales deberían amplificar un frotis de 0,2 - 2 kb mientras que los controles negativos (sin DpnI, sin ligasa o sin plantilla PCR) debe...

Se describe en este documento un ensayo mediante el acoplamiento de identificación de ADN metiltransferasa adenina (DamID) a alto rendimiento de secuenciación (DamID-ss). Este método mejorado proporciona una mayor resolución y un rango dinámico más amplio, y permite el análisis de datos DamID-Seq en conjunción con otros datos de secuenciación de alto rendimiento tales como chip-ss, RNA-Seq, etc.

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The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is ...

El objetivo general de este protocolo es detectar secuencias genómicas de ADN asociadas con proteínas de interés en células animales mediante secuenciación de alto rendimiento. Esta técnica puede ayudar a responder preguntas clave en el estudio de la organización nuclear y la transcripción o regulación en células de mamíferos, como la identificación de regiones genómicas asociadas con el amiloide nuclear o con factores de transcripción específicos. Las principales ventajas de esta técnica son que la secuenciación de alto rendimiento proporciona una resolución más alta que el activo DamID original, utilizando microarrays de ADN, y que esta técnica permite el análisis cruzado con nuestros datos de secuenciación de alto rendimiento.La demostración del procedimiento estará a cargo de Brennan Olson, un técnico de nuestro laboratorio. Para comenzar, siga el protocolo de texto para clonar el gen de interés en el vector DamID. A continuación, genere stocks lentivirales que expresen DamV5 POY y V5-Dam utilizando un sistema de expresión lentiviral.Cotransfectar el vector DamID con los plásmidos de empaquetamiento lentiviral siguiendo el procedimiento de transfección directa de acuerdo con el

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Análisis de la interacción de la cromatina por género Secuenciación Paired-End (Chia-PET) es un método...

La cromatina Análisis de Interacción con la etiqueta de secuenciación pareadas final (Chia-PET) para el mapeo de la cromatina y la comprensión de las interacciones Reglamento Transcripción

ADN y las proteínas se marcan secuencia específicamente con afinidad o grupos indicadores fluorescentes usando ADN o de proteínas metiltransferasas y análogos sintéticos de cofactor. Dependiendo de la especificidad de cofactor de las enzimas, aziridina o dobles análogos de cofactores activados se emplean para el etiquetado de uno o dos pasos.

Etiquetado específico de secuencia de ácidos nucleicos y proteínas con metiltransferasas y el cofactor Análogos

La secuenciación de amplicones de bisulfito (BSAS) es un método para cuantificar la metilación de citosina en regiones genómicas específicas de interés. Este método utiliza la conversión de bisulfito emparejada con la amplificación por PCR de las regiones objetivo antes de la secuenciación de próxima generación para producir una cuantificación absoluta de la metilación del ADN a un nivel específico de base.

Dirigida análisis de metilación del ADN mediante secuenciación de próxima generación

La identificación de los blancos directos de moléculas del genoma de metas sigue siendo un reto importante. Para entender cómo las moléculas de unión al ADN involucran el genoma, hemos desarrollado un método que se basa en la reticulación de moléculas pequeñas para aislar la cromatina (cósmica).

Mapeo de todo el genoma de la droga-ADN interacciones en células con COSMIC (reticulación de pequeñas moléculas para aislar la cromatina)

Aquí se presenta un protocolo para investigar la metilación del ADN del genoma de ancho en estudios de cribado de pacientes clínicos a gran escala utilizando la secuenciación Metil-unión de captura de ADN (SEC-MBDCap o MBD-ss) la tecnología y el análisis de tuberías bioinformática posteriores.

Secuenciación de captura de ADN de unión a metil-para tejidos del paciente

Describimos la división endógena de la cromatina junto con la secuenciación de alto rendimiento (ChEC-seq), un método ortogonal de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) para cartografiar los sitios de unión a proteínas del genoma con proteínas de fusión de nucleasa micrococcal (MNasa).

Genoma de todo el mapa de las interacciones Proteína-ADN con ChEC-seq in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Secuenciación profunda de las poblaciones de levaduras seleccionadas para las interacciones 2-híbrido de levadura positivos potencialmente produce una gran cantidad de información sobre la interacción de las proteínas de socio. Aquí, describimos el funcionamiento de herramientas bioinformáticas específico y personalizado software actualizado para analizar los datos de la secuencia de estas pantallas.

Análisis informático de datos de la secuencia de lote levadura híbrida 2 pantallas

La determinación precisa de las ubicaciones de unión a proteínas en todo el genoma es importante para entender la regulación genética. Aquí describimos un método de mapeo genómico que trata el ADN inmunoprecipitado con cromatina con digestión exonucleasa (ChIP-exo) seguido de secuenciación de alto rendimiento. Este método detecta interacciones proteína-ADN con resolución cartográfica de par base cercano y alta relación señal-ruido en las neuronas de mamíferos.

Mapeo de alta resolución de interacciones proteína-ADN en neuronas derivadas de células madre del ratón utilizando inmunoprecipitación de cromatina-exonucleasa (ChIP-Exo)

La interacción de un remodelador de cromatina dependiente de ATP con un ligando de ADN se describe mediante espectroscopia de CD. Los cambios conformacionales inducidos en un promotor génico analizado por los picos generados pueden ser utilizados para comprender el mecanismo de regulación transcripcional.

Espectroscopia de CD para estudiar las interacciones ADN-proteína

El protocolo proporciona instrucciones para modificar el ARN con sulfato de dimetilo para experimentos de perfiles mutacionales. Incluye sondeo in vitro e in vivo con dos métodos alternativos de preparación de bibliotecas.

Sondeo de la estructura del ARN con perfil mutacional de sulfato de dimetilo con secuenciación in vitro y en células

Aquí presentamos un protocolo para evaluar de forma semicuantitativa los niveles globales de m⁶A usando dot blot. El ARN total se extrae, desnaturaliza, se mancha en una membrana de nylon, se sondea con anticuerpo anti-m⁶A y se visualiza mediante quimioluminiscencia. La intensidad de la señal, cuantificada mediante análisis en escala de grises ImageJ, refleja la abundancia relativa de metilación, proporcionando un flujo de trabajo reproducible para la investigación.

Ensayo de blot de punto para detectar niveles globales de modificación del ARN N 6-metiladenosina

Aprende el método DamID-seq para mapear interacciones proteína-ADN en células animales con alta resolución mediante secuenciación masiva. Esta técnica mejora el análisis de organización nuclear y regulación transcripcional.

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