-DamID siguientes: Genoma de toda la cartografía de la proteína-ADN Interacciones de alto rendimiento de secuenciación de fragmentos de ADN adenina-metilado

El objetivo general de este protocolo es detectar secuencias genómicas de ADN asociadas con proteínas de interés en células animales mediante secuenciación de alto rendimiento. Esta técnica puede ayudar a responder preguntas clave en el estudio de la organización nuclear y la transcripción o regulación en células de mamíferos, como la identificación de regiones genómicas asociadas con el amiloide nuclear o con factores de transcripción específicos. Las principales ventajas de esta técnica son que la secuenciación de alto rendimiento proporciona una resolución más alta que el activo DamID original, utilizando microarrays de ADN, y que esta técnica permite el análisis cruzado con nuestros datos de secuenciación de alto rendimiento.

La demostración del procedimiento estará a cargo de Brennan Olson, un técnico de nuestro laboratorio. Para comenzar, siga el protocolo de texto para clonar el gen de interés en el vector DamID. A continuación, genere stocks lentivirales que expresen DamV5 POY y V5-Dam utilizando un sistema de expresión lentiviral.

Cotransfectar el vector DamID con los plásmidos de empaquetamiento lentiviral siguiendo el procedimiento de transfección directa de acuerdo con el protocolo del fabricante. Asegúrese de incluir un paso de filtración con un filtro de PVDF de cero coma cuatro, cinco micras. Ahora, prepárese para infectar las células con el lentivirus.

Con un día de anticipación, pase las células adheridas en placas de seis pocillos. Continúe usando antibióticos. El objetivo es tener un 50% de confluencia al día siguiente para la infección.

Al día siguiente, retire los sobrenadantes lentivirales DamV5 POY y V5-Dam congelados del congelador y colóquelos en un baño de agua a 37 grados centígrados para descongelar. En las placas de cultivo, retire el medio de crecimiento y reemplácelo con medio mililitro de medio de crecimiento fresco sin antibióticos. Luego, cargue los pozos con un mililitro de lentivirus descongelado.

Cargue dos pozos con V5-Dam, dos pozos con DamV5 POY y dos pozos sin lentivirus como control negativo. Agite la solución en las celdas y devuelva la placa a la incubadora. 24 horas después, reemplace las suspensiones virales en las células con dos mililitros de medio de crecimiento sin antibióticos.

Luego, continúe la incubación durante 48 horas más. Dos días después, complete este proceso siguiendo el protocolo de texto para aislar el ADN genómico, lo que debería llevar aproximadamente una hora. Luego, amplifique los fragmentos de ADN metilado de adenina del ADN genómico.

Este proceso tarda entre dos y tres días, y los detalles se tratan en el protocolo de texto. Para este procedimiento, primero fragmente el ADN metilado de adenina amplificado. Antes de usar la fragmentasa de ADN, es importante medir primero su fuerza para determinar el tiempo de digestión adecuado.

Utilice cualquier producto de metil PCR purificado disponible para esta prueba de diagnóstico. Comience por configurar una mezcla maestra compuesta por seis microgramos de ADN, 12 microlitros de tampón 10X Fragmentase y llénela con agua hasta 114 microlitros. A continuación, agita el caldo de fragmentasa durante tres segundos y añade seis microlitros a la mezcla maestra para un total de 120 microlitros.

A continuación, haz un vórtice de la mezcla maestra durante tres segundos. Ahora, llene cinco tubos de reacción con 20 alícuotas de microlitros de mezcla maestra e incube los seis tubos a 37 grados centígrados. Retire un tubo después de cinco minutos y agregue cinco microlitros de EDTA para detener la reacción.

Haga esto cada 10 minutos hasta que se recojan todos los tubos de reacción. Ahora, analice 12 coma cinco microlitros de cada tubo, lo que corresponde a aproximadamente medio microgramo de ADN, y la misma cantidad de ADN no digerido en un gel de agorosa. A partir del gel, determine el tiempo mínimo necesario para digerir la mayor parte del frotis hasta alrededor de cero punto dos kilobases.

Utilízalo como el tiempo máximo de digestión. Ahora, configure la fragmentación real, como la prueba previa, y detenga las digestiones en seis puntos de tiempo espaciados uniformemente, incluidos cinco minutos, y calcule el tiempo máximo. Después de la digestión, extraiga las seis digestiones y purifíquelas con un kit de purificación PCR o perlas de inmovilización reversibles en fase sólida.

Diluir el ADN purificado en unos 15 microlitros de tampón EB. Los siguientes pasos son reparar los extremos del ADN fragmentado, agregar salientes de adenina, ligar los adaptadores de secuenciación y convertir los adaptadores en forma de Y en ADN bicatenario. Todos estos pasos se detallan en el protocolo de texto y no deberían tardar más de dos días en completarse.

Después de ligar los adaptadores de secuenciación al ADN fragmentado y convertir los adaptadores en forma de Y en ADN bicatenario, seleccione los fragmentos del tamaño deseado. Comience preparando un gel de agorosa al dos por ciento en TAE y, tomando precauciones, agregue bromuro de etidio hasta una concentración final de 500 nanogramos por mililitro. Haga suficientes carriles para todas las muestras y dos escaleras para que estén bordeadas por carriles vacíos.

Ahora, agregue ocho microlitros de tinte de carga a 10 microlitros de cada eluido de ADN y prepare la escalera de 1 Kb Plus con tinte de carga 6X y agua en una proporción de uno a uno a cuatro. A continuación, cargue los carriles de gel en el siguiente orden: escalera de ADN, eluidos de ADN y otra escalera de ADN. Una vez cargado, haga funcionar el gel a 120 voltios por 60 minutos.

Más tarde, póngase gafas de seguridad y un protector facial para ver brevemente el gel con luz ultravioleta. Revise las escaleras de ADN para ver si el gel se ha agotado lo suficiente como para que se puedan extirpar tres rodajas de gel entre 300 y 400 pares de bases. A continuación, corte las bandas entre 300 y 400 pares de bases de cada carril, siempre utilizando una cuchilla nueva para cada carril.

Retire la menor cantidad posible de gel para que cada corte de gel tenga idealmente menos de 100 microlitros, y transfiera cada uno a su propio tubo de microfuga. A continuación, extraiga el ADN de las rodajas de gel de acuerdo con el protocolo de texto. Continúe siguiendo el protocolo de texto sobre cómo enriquecer los fragmentos modificados del adaptador de secuenciación a partir del ADN extraído.

A continuación, obtenga un análisis de alta calidad del ADN purificado por un bioanalizador y, si cumple con las expectativas, envíelo para su secuenciación. Los lentivirus se diseñaron para expresar una proteína de fusión Dam-V5-lamina B1, que se verificó que estaba colocalizada con la proteína endógena lamina B1 mediante tinción de aminofluorescencia. Este lentivirus y un lentivirus de control que expresa la proteína de fusión Dam-V5 se utilizaron para infectar mioblastos C2C12 de ratón.

El ADN se recolectó y amplificó para obtener fragmentos metilados de adenina, como se describe, y luego se secuenció. A continuación, se construyeron mapas de interacción del genoma NL para el cromosoma uno. Una pista muestra las proporciones log2 RPKM.

La otra pista muestra los dominios asociados a la lámina en negro. Estas son áreas que están significativamente más asociadas con la lamina B1 de la presa que con la presa de control. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en dos semanas, si se realiza correctamente.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo detectar secuencias de ADN asociadas con proteínas de interés mediante secuenciación de alto rendimiento, acoplada a DamID. No olvide que trabajar con bromuro de etidio y luces ultravioleta puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones como esperar a que el gel se enfríe antes de agregar bromuro de etidio y usar protección para los ojos y un protector facial mientras se realiza este procedimiento.