Name: Endodérmico primario de células epiteliales Cultura de la membrana del saco vitelino de embriones de codorniz japonesa (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 53 s
Description: Aprende a cultivar células epiteliales endodérmicas primarias de membranas de saco vitelino de codorniz japonesa. Este método permite estudiar la utilización de lípidos y el transporte de nutrientes en embriones aviares.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Los fondos para el desarrollo del protocolo actual se apoya particularmente &quot;Objetivo para el Plan Universitario Top&quot; de la Universidad Nacional de Taiwán, Taiwán (donación ID-104R350144), así como el Ministerio de Ciencia y Tecnología de Taiwán (Identificación subvención: MAS 104 -2313-B-002-039-MY3). Agradecemos especialmente el Centro de Biotecnología de la Universidad Nacional de Taiwán para proporcionar una sala de los animales y el espacio de laboratorio para el estudio actual.

NOTA: Este procedimiento es una modificación de un protocolo de cultivo de pollo modelo desarrollado por Bauer et al 2013 y Nakazawa et al, 2011. 2.9.. 1. Preparar saludable embrionarias Día 5 Los embriones de codorniz japonesa <ol><li> Coloca 1 hombres y 3 mujeres sexualmente maduras codorniz japonesa juntos en la misma jaula. Suministro de alimento y agua ad libitum. Ajustar la luz en la sala de los animales a 14 horas de luz y 10 horas de oscuridad. </li><li> Recoger los huevos fertilizados en bolsas de plástico cada día por la tarde y mantenerlos en un 16 ° C refrigerador para retardar la tasa de crecimiento de los embriones. </li><li> Después de recoger un número suficiente de huevos dentro de un período de dos semanas, se incuban los huevos fertilizados en una incubadora a 37 ° con una buena ventilación durante cinco días. </li></ol> 2. Preparar medio basal y soluciones de lavado <ol><li> Utilice DMEM / F-12 medio (ajustado a pH 7,2) como el medio de crecimiento, y la completarácon el nuevo 10% de suero de ternero recién nacido (NBCS) y 1% de Pen-Strep Ampho. Solución (PSA; penicilina, 10 5 unidades / L; estreptomicina, 100 mg / l; anfotericina B, 0,25 mg / L). </li><li> Preparar la solución salina tamponada con fosfato (PBS) a una concentración 10 veces para el almacenamiento; utilizar la solución de PBS 1x (que contiene NaCl, 137.93 mM; KCl, 2.667 mM; KH 2 PO 4, 1.471 mM; Na 2 HPO 4 7H 2 O, 8,06 mM; ajustar el pH a 7,2) para lavar y humedecer la membrana del saco vitelino, mientras separar el endodermo de yema de huevo y albúmina. </li><li> Utilice medio DMEM (ajustado a pH 7,2) para volver a suspender gránulos endodermo. </li></ol> 3. Recogida de EECs primaria de YSMs codorniz japonesa <ol><li> Incubar los huevos recogidos durante 5 días (paso 1.3). Examinar los huevos por un candler huevo para confirmar el desarrollo embrionario normal. NOTA: En el día embrionario 5, el límite de YSM mesodermo es muy clara y las 3 capas embrionarias son menos ligada estrechamente juntos, por lo que es fácil de obendodermo Tain. Utilice sólo los huevos que presentan un desarrollo normal circulación capilar para las colecciones YSM. </li><li> Limpiar la cáscara de los huevos con cuidado con el agua dulce y el 75% de etanol. Abrir la cáscara de huevo de la posición de la cámara de aire por un par de tijeras, pelar suavemente y recoger toda la YSM con fórceps y colocar en una placa de cultivo de 10 cm llena de 37 ° C 1x PBS. </li><li> El uso de un par de tijeras eliminar el embrión, yema y clara de huevo, y suavemente lavar el YSM con 1x PBS tres veces y coloque YSM en solución PBS en una placa de cultivo de 10 cm. </li><li> El uso de fórceps y un par de tijeras para quitar el ectodermo de YSM. Utilice 2 pinzas, una para sujetar firmemente la capa de células endodérmico, y el otro para sujetar el mesodermo capilar. </li><li> Bajo un microscopio de disección, separar y separar el endodermo del borde del mesodermo en la dirección hacia el embrión. Recoger el endodermo de color amarillo claro en 50 ml tubos de centrifugación mediante un gotero y colocar en 15 ml de medio de cultivo en un wat 37 ° Cer baño hasta que se completen todas las colecciones de tejidos. </li></ol> 4. La digestión del endodermo rebanadas por digestión con colagenasa <ol><li> Recién disolver 6,5 unidades de colagenasa tipo IV en 10 ml de DMEM. </li><li> Centrifugar los tubos de 50 ml (3.4) a 130 xg durante 3 min a TA. Aspirar el medio y lugar todo el endodermo en una placa de cultivo de 6 cm con una pipeta. Añadir 1 ml de solución de colagenasa a esta placa de cultivo. </li><li> Cortar el endodermo recogido de 2 embriones de codorniz con un par de tijeras curvas hasta que el tamaño de cada rebanada es de aproximadamente 2 a 3 mm. Use un gotero, recoger todas las rodajas en un tubo de centrífuga de 50 ml a lo largo con 9 ml de solución de colagenasa fresco. </li><li> Digerir el tejido con colagenasa durante 30 min en un baño de agua agitando 37 ° C a 175 rpm. Esta digestión parcial con colagenasa se utiliza para mejorar la proliferación de las células del explante. </li><li> Centrifugar a 130 xg durante 3 min a temperatura ambiente y eliminar suavemente la fracción sobrenadante usando una pipeta. Lavar el pellet mediante suspensión en 20 ml de DMEM y eliminar la fracción de sobrenadante después de la centrifugación 130 x g durante 3 min. </li><li> Vuelva a suspender el sedimento con 12 ml de medio de cultivo (DMEM / F12 con 10% NBCS y 1% PSA) y sembrar con cuidado e igualmente en una placa de 24 pocillos (de cada solución de células bien con 500 l). </li><li> Incubar explantes de tejido a 37 ° C en 5% de CO2 en aire durante 2 días para permitir que las células proliferan de los tejidos. </li><li> Se incuban las células durante otros 2 días y caracterizar para la viabilidad celular por un protocolo de ensayo de viabilidad celular. 15 NOTA: Living células mantienen un ambiente reductor en el citosol. La resazurina, el ingrediente activo, es un compuesto permeable no tóxico, célula que es de color azul y virtualmente no fluorescente. Cuando se añade a los cultivos celulares, resazurina a resorufina es reducida en el citosol por las enzimas mitocondriales. Resorufina es de color rojo y altamente fluorescente. Las células viables se convierten continuamente la resazurina a resorufina, increAsing la fluorescencia general y el color del medio de cultivo células de los alrededores. </li><li> Realizar endodermo células epiteliales RNA total aislamiento, transcripción inversa y cuantitativa en tiempo real PCR de la expresión de ARNm del gen marcador tal como se describe. 16,17 <ol><li> Utilice PCR transcriptasa inversa para detectar SOAT1 mRNA (sentido: 5&#39;-GAAGGGGCCTATCTGGAACG-3 &#39;; antisentido: 5&#39;-ATCTGCACGTGACATGACCA-3&#39;; producto de PCR = 168 pb) como un marcador específico de las células de la CEE. Utilice β-actina mRNA (sentido: 5&#39;-TGGTGAAGCTGTAGCCTCTC-3 &#39;; antisentido: 5&#39; GTGATGGACTCTGGTGATGG-3 &#39;; producto de PCR = 151 pb) como un gen de mantenimiento y control interno. </li><li> Utilice electroforesis en gel para detectar el tamaño del producto de RT-qPCR. Preparar 1% gel de agarosa, y mezclar 10 l producto qPCR con 2 l de colorante de carga. Cargar 10 mezcla l en cada pocillo en el gel de agarosa al 1%, y ejecutar el gel por 100 V durante 30 min. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Abeyrathne, E. D., Lee, H. Y., Ahn, D. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Egg+white+proteins+and+their+potential+use+in+food+processing+or+as+nutraceutical+and+pharmaceutical+agents--a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Poult+Sci%22%5BJournal%5D)">Egg white proteins and their potential use in food processing or as nutraceutical and pharmaceutical agents--a review.</a> Poult Sci. 92 (12), 3292-3299 (2013).</li>
<li>Bauer, R., Plieschnig, J. A., Finkes, T., Riegler, B., Hermann, M., Schneider, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+developing+chicken+yolk+sac+acquires+nutrient+transport+competence+by+an+orchestrated+differentiation+process+of+its+endodermal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The developing chicken yolk sac acquires nutrient transport competence by an orchestrated differentiation process of its endodermal epithelial cells.</a> J Biol Chem. 288 (2), 1088-1098 (2013).</li>
<li>Ding, S. T., Nestor, K. E., Lilburn, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+concentration+of+different+lipid+classes+during+late+embryonic+development+in+a+randombred+turkey+population+and+a+subline+selected+for+increased+body+weight+at+sixteen+weeks+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Poult+Sci%22%5BJournal%5D)">The concentration of different lipid classes during late embryonic development in a randombred turkey population and a subline selected for increased body weight at sixteen weeks of age.</a> Poult Sci. 74 (2), 374-382 (1995).</li>
<li>Ding, S. T., Lilburn, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+developmental+expression+of+acyl-coenzyme+A%3A+cholesterol+acyltransferase+in+the+yolk+sac+membrane%2C+liver%2C+and+intestine+of+developing+embryos+and+posthatch+turkeys%5BTitle%5D)+AND+%22Poult+Sci%22%5BJournal%5D)">The developmental expression of acyl-coenzyme A: cholesterol acyltransferase in the yolk sac membrane, liver, and intestine of developing embryos and posthatch turkeys.</a> Poult Sci. 79 (10), 1460-1464 (2000).</li>
<li>Ding, S. T., Lilburn, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ontogeny+of+fatty+acid-binding+protein+in+turkey+%28Meleagridis+gallopavo%29+intestine+and+yolk+sac+membrane+during+embryonic+and+early+posthatch+development%5BTitle%5D)+AND+%22Poult+Sci%22%5BJournal%5D)">The ontogeny of fatty acid-binding protein in turkey (Meleagridis gallopavo) intestine and yolk sac membrane during embryonic and early posthatch development.</a> Poult Sci. 81 (7), 1065-1070 (2002).</li>
<li>Kanai, M., Soji, T., Sugawara, E., Watari, N., Oguchi, H., Matsubara, M., Herbert, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Participation+of+endodermal+epithelial+cells+on+the+synthesis+of+plasma+LDL+and+HDL+in+the+chick+yolk+sac%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">Participation of endodermal epithelial cells on the synthesis of plasma LDL and HDL in the chick yolk sac.</a> Microsc Res Tech. 35 (4), 340-348 (1996).</li>
<li>Mobbs, I. G., McMillan, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+endodermal+epithelium+of+the+chick+yolk+sac+during+early+stages+of+development%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Anat%22%5BJournal%5D)">Structure of the endodermal epithelium of the chick yolk sac during early stages of development.</a> Am J Anat. 155 (3), 287-309 (1979).</li>
<li>Mobbs, I. G., McMillan, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport+across+endodermal+cells+of+the+chick+yolk+sac+during+early+stages+of+development%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Anat%22%5BJournal%5D)">Transport across endodermal cells of the chick yolk sac during early stages of development.</a> Am J Anat. 160 (3), 285-308 (1981).</li>
<li>Nakazawa, F., Alev, C., Jakt, L. M., Sheng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yolk+sac+endoderm+is+the+major+source+of+serum+proteins+and+lipids+and+is+involved+in+the+regulation+of+vascular+integrity+in+early+chick+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Yolk sac endoderm is the major source of serum proteins and lipids and is involved in the regulation of vascular integrity in early chick development.</a> Dev Dyn. 240 (8), 2002-2010 (2011).</li>
<li>Noble, R. C., Cocchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+metabolism+and+the+neonatal+chicken%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Lipid metabolism and the neonatal chicken.</a> Prog Lipid Res. 29 (2), 107-140 (1990).</li>
<li>Shand, J. H., West, D. W., McCartney, R. J., Noble, R. C., Speake, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+esterification+of+cholesterol+in+the+yolk+sac+membrane+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Lipids%22%5BJournal%5D)">The esterification of cholesterol in the yolk sac membrane of the chick embryo.</a> Lipids. 28 (7), 621-625 (1993).</li>
<li>Speier, J. S., Yadgary, L., Uni, Z., Wong, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+of+nutrient+transporters+and+digestive+enzymes+in+the+yolk+sac+membrane+and+small+intestine+of+the+developing+embryonic+chick%5BTitle%5D)+AND+%22Poult+Sci%22%5BJournal%5D)">Gene expression of nutrient transporters and digestive enzymes in the yolk sac membrane and small intestine of the developing embryonic chick.</a> Poult Sci. 91 (8), 1941-1949 (2012).</li>
<li>Walzem, R. L., Hansen, R. J., Williams, D. L., Hamilton, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+Induction+of+VLDLy+Assembly+in+Egg-Laying+Hens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nutr%22%5BJournal%5D)">Estrogen Induction of VLDLy Assembly in Egg-Laying Hens.</a> J Nutr. 129 (2), 467S-472S (1999).</li>
<li>Yoshizaki, N., Soga, M., Ito, Y., Mao, K. M., Sultana, F., Yonezawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-step+consumption+of+yolk+granules+during+the+development+of+quail+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Two-step consumption of yolk granules during the development of quail embryos.</a> Dev Growth Differ. 46 (3), 229-238 (2004).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22alamarBlue+Cell+Viability+Assay+Protocol%22">alamarBlue Cell Viability Assay Protocol</a>. , Source: 
 <a target="_blank" href="https://www.lifetechnologies.com/us/en/home/references/protocols/cell-and-tissue-analysis/cell-profilteration-assay-protocols/cell-viability-with-alamarblue.html#4">https://www.lifetechnologies.com/us/en/home/references/protocols/cell-and-tissue-analysis/cell-profilteration-assay-protocols/cell-viability-with-alamarblue.html#4</a> (2008).</li>
<li>Lin, H. Y., Chen, C. C., Chen, Y. J., Lin, Y. Y., Mersmann, H. J., Ding, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+Amelioration+of+High-Fat+Diet-Induced+Fatty+Liver+by+Docosahexaenoic+Acid+and+Lysine+Supplementations%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Enhanced Amelioration of High-Fat Diet-Induced Fatty Liver by Docosahexaenoic Acid and Lysine Supplementations.</a> Biomed Res Int. 2014 (1), 310981(2014).</li>
<li>Lin, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adiponectin+receptor+1+regulates+bone+formation+and+osteoblast+differentiation+by+GSK-3%CE%B2%2F%CE%B2-Catenin+signaling+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Adiponectin receptor 1 regulates bone formation and osteoblast differentiation by GSK-3β/β-Catenin signaling in mice.</a> Bone. 64, 147-154 (2014).</li>
</ol>

No hay intereses financieros contrapuestos u otros conflictos de intereses. No obtuvimos ningún financiamiento de ninguna empresa privada.

Debido a que el sistema de cultivo anterior tiene un éxito limitado, se necesita un mejor sistema de cultivo. El endodermo codorniz japonesa YSM requiere tratamiento con enzimas proteolíticas tales como la colagenasa para aflojar las uniones célula-célula para lograr un mayor crecimiento en los explantes ex-vivo. Nuestros datos muestran que el número de células del tratamiento de digestión parcial fueron mayores que a partir del cultivo de tejido no digerido después de la siembra durante 2 días (Figura 1).</stro...

El principal recurso alimenticio del embrión aviar es yema de huevo, compuesta de 33% de lípidos, 17% de proteína, y 1% de cenizas. 1 Durante el desarrollo embrionario, la membrana del saco vitelino (YSM) crece de dentro de la cavidad abdominal embrionario y cubre gradualmente la yema superficie. Comenzando en el día embrionario 2, la expresión de genes asociados con el metabolismo de los lípidos y la angiogénesis se incrementa gradualmente en YSM, y el YSM se desarrolla lentamente proyecciones vellosidades como 8,9. Estas proyecciones aumentan la absorción de los nutrientes de la yema para apoyar el desarrollo embrionario. El YSM es un tejido extraembrionario que contiene tres capas germinales, el endodermo, mesodermo y ectodermo. 14 del ectodermo del saco vitelino se enfrenta a la albúmina y enlaces con la membrana vitelina para cubrir suavemente el saco vitelino. Las células epiteliales del endodermo se enfrentan directamente hacia la yema de huevo y sirven como portales de utilización de nutrientes. 6 A medida que se expande la YSM, células epiteliales endodérmico (EEC) puede ser dividido por Shapcorreo y funcionalidad en dos grupos, el área de vitelina y vascular del área. 7 vitelina Area se compone de células endodérmicas y está distante del embrión; área vasculosa se compone de células mesodérmicas y cubre EECs diferenciados con vasos sanguíneos y tejidos conectivos. Por el día embrionario 5, la yema está totalmente cubierto por el ectodermo y el endodermo de YSM y el área vascular ha crecido rápidamente. El YSM absorbe, recompone y libera lípidos (como yema de derivados de lipoproteínas de muy baja densidad) y las proteínas en el sistema circulatorio embrionario. 9, 2 Por lo tanto, se estableció una codorniz sistema de cultivo celular primario japonés embrionario endodérmico epitelial, para estudiar los mecanismos de lípidos utilización en YSM durante el desarrollo embrionario aviar. Lípidos tales como triacilglicerol, lecitina, fosfolípidos y ésteres de colesterol (CE) son las fuentes primarias de energía para los embriones de aves. En las primeras etapas de desarrollo, lípidos de la yema son composed de sólo el 1,3% del CE y se eleva al 10-15% a medio plazo del desarrollo embrionario aviar 3, 11 éster de colesterol. Se sintetiza a partir del colesterol por esterol O-aciltransferasa 1 (SOAT1) en YSM embrión aviar. 4 La forma de almacenamiento de colesterol es CE, CE se realiza en las lipoproteínas, y lipoproteínas son transportados por la circulación a los tejidos. 13 Una semana antes de la eclosión hay un rápido crecimiento de los embriones de aves. Aproximadamente el 68% de los contenidos de lípidos restantes en la yema son absorbidos durante esta etapa. 10 El mecanismo por el cual la yema de los lípidos se utilizan pueden ser aclaradas por un modelo de investigación CEE. Un protocolo de cultivo CEE pollo se estableció para lograr este objetivo de investigación. 2, 9 Sin embargo, debido a la baja tasa de éxito de explantes de tejido, se necesita un procedimiento de cultivo celular CEE mejorada para estudiar la función de ciertas enzimas y proteínas en la mediación de la utilización de nutrientes por embriones de aves durante el desarrollo.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>Gibco de Life technologies</td><td>12800-017 10 X 1 L</td><td>Para lavar los pellets de EECs</td></tr><tr><td>D-MEM/F-12</td><td>Gibco de Life technologies</td><td>12400-024 10 X 1 L</td><td>Como medio basal en el cultivo de EECs NBCS</td></tr><tr><td></td><td>Gibco de Life technologies</td><td>16010-159</td><td>Como suero de suministro en el cultivo de EECs</td></tr><tr><td>Pen-Strep Ampho. Solución</td><td>BI (Industrias Biológicas)</td><td>03-033-1B 100 ml</td><td>Para atenuar la posible infección&nbsp;</td></tr><tr><td>Colagenasa Tipo IV</td><td>Gibco de Life technologies</td><td>17104-019 1 g</td><td>&nbsp; La colagenasa es una proteasa con especificidad para el enlace entre un aminoácido neutro (X) y la glicina en la secuencia Pro-XGly-Pro. Como proteasa para la disociación de las células del tejido primario.</td></tr><tr><td>placa de 24 pocillos</td><td>FALCON&reg; </td><td>REF-353047</td><td>Para conectar y extender</td></tr><tr><td>tubos de centrífuga PP de 50 ml Corning</td><td>&reg; CentriStarTM</td><td>430829</td><td>Para el transporte de membranas y la digestión enzimática</td></tr><tr><td>50 ml Tubo de fondo cónico con tapón</td><td>PRO TECH</td><td>CT-50-PL-TW</td><td>Para el transporte de membranas y la digestión enzimática</td></tr><tr><td>Baño de agitación recíproca</td><td>DEAGLE</td><td>SB302</td><td>Para una mejor digestión enzimática en membranas</td></tr></tbody></table>

endodérmico primario de células epiteliales cultura de la membrana del saco vitelino de embriones de codorniz japonesa

Primary Endodermal Epithelial Cell Culture from the Yolk Sac Membrane of Japanese Quail Embryos

Hemos establecido un modelo de cultivo de células epiteliales endodérmico (CEE) para el estudio de la función de ciertas enzimas y proteínas en la mediación de la utilización de nutrientes por los embriones de aves durante el desarrollo. Fertilizados huevos de codorniz japonesa se incubaron a 37 ° C durante 5 días y luego la yema se recogieron membranas de la bolsa (YSM) para establecer el sistema de cultivo CEE. Se aislaron la capa endodermo embrionario de YSM, y en rodajas la membrana en 2 - 3 mm piezas y se digirió parcialmente con colagenasa antes de la siembra en placas de cultivo de 24 pocillos. El EECs proliferan fuera del tejido y están listos para estudios de cultivo celular. Hemos encontrado que la EECs tenía características típicas de YSM in vivo, por ejemplo, la acumulación de gotitas de lípidos, esteroles expresión de O-aciltransferasa y la lipoproteína lipasa. El tratamiento de digestión parcial aumentó significativamente la tasa de éxito de la cultura CEE. Utilizando el EECs, hemos demostrado que la expresión de SOAT1 estaba regulado por el cAMP dependent proteína quinasa A vía relacionada. Este sistema de cultivo de codorniz japonesa CEE primaria es una herramienta útil para estudiar el transporte de lípidos embrionario y para aclarar el papel de los genes implicados en la mediación de la utilización de nutrientes en los ADM durante el desarrollo embrionario aviar.

Con el fin de lograr el objetivo de establecer un modelo celular consistente y útil, necesitamos ampliar y estabilizar la tasa de proliferación y el rendimiento de EECs aviar. Se comparó la incubación directa de la endodermo sin digestión con enzimas con endodermo parcialmente digerido con enzimas proteolíticas, tales como la colagenasa o colagenasa plus 0,6 U de dispasa. Dispasa es un amino-endopeptidasa que hidroliza los enlaces peptídicos N-terminal de los residuos de aminoácidos no p...

Para estudiar el mecanismo de utilización de lípidos en las membranas del saco vitelino durante las últimas etapas del desarrollo embrionario de las aves, establecimos un sistema primario de cultivo de células epiteliales endodérmicas embrionarias de codorniz japonesa.

Endodérmico primario de células epiteliales Cultura de la membrana del saco vitelino de embriones de codorniz japonesa

We established an endodermal epithelial cell culture model (EEC) for studying the function of certain enzymes and proteins in mediating nutrient ...

El objetivo general de este procedimiento de explante ex vivo es mejorar la recolección y ampliar la aplicación de células epiteliales endodérmicas aviares para estudiar la función de enzimas y proteínas en la mediación de la utilización de nutrientes por embriones aviares. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre la utilización de lípidos durante la embriogénesis aviar, como la forma en que los lípidos del vitelo se empaquetan y transportan desde el vitelo al embrión durante las etapas finales del desarrollo. La principal ventaja de esta técnica es que podemos obtener con éxito células epiteliales endodérmicas funcionales a partir de la membrana del saco vitelino de codorniz japonesa, las cuales pueden utilizarse como un modelo para estudiar el desarrollo embrionario aviar.Comience preparando una solución de PBS 10x según se describe en el protocolo escrito. Diluya esta solución madre de uno a diez para preparar PBS 1x, que se utilizará para lavar la membrana del saco vitelino durante la disección del endodermo. Para preparar el medio de crecimiento para las células epiteliales endodérmicas, o EEC, primero suplemente el DMEM/F-12 con 10% de suero de ternera recién nacida y 1% de solución de penicilina-estreptomicina-anfotericina.A continuación, introduzca la sonda de un pH-metro en el DMEM previamente preparado. Añada tres gotas de HCl normal al medio hasta que el pH se haya ajustado a 7,2. Después de recolectar aproximadamente dos docenas de huevos de codorniz fertilizados, colóquelos verticalmente en recipientes para huevos de forma que sus extremos anchos, no afilados, donde se localizan las celdas de aire, queden orientados hacia arriba.Luego, transfiera los huevos a una incubadora bien ventilada ajustada a 37 grados Celsius. Después de cinco días de incubación, examine los huevos con un candil para huevos. Si los embriones se han desarrollado normalmente, espere ver una estructura circular de vasos capilares debajo de la cámara de aire.Seleccione un huevo que muestre un desarrollo normal de capilares y limpie la cáscara con agua fresca y etanol al 75 %. A continuación, abra la cáscara del huevo desde la posición de la cámara de aire utilizando tijeras. Use pinzas para ayudar suavemente a verter el contenido del huevo en una placa de cultivo vacía de 10 cm.Luego, use tijeras para separar el embrión, la yema y cualquier albúmina de la membrana del saco vitelino, que se abrevia como MSV. Una vez aislada, lave la MSV tres veces con PBS 1x y, a continuación, transfiérala a un nuevo plato de 10 cm que contenga PBS. Posteriormente, coloque el plato bajo un microscopio estereoscópico.Luego, proceda a eliminar cualquier resto de clara de huevo, que está adyacente a la capa externa de ectodermo del MVS, con tijeras. Continúe utilizando pinzas para levantar el ectodermo translúcido y el mesodermo estructural de los capilares de color rojo desde el borde del mesodermo en la membrana del saco vitelino. A continuación, desprenda suavemente juntos el ectodermo y el mesodermo para aislar la capa celular de endodermo subyacente.Luego, con un par de pinzas, sostenga firmemente la capa de células endodérmicas amarillas de la membrana. Con otro par, agarre el mesodermo capilar y proceda a separar el mesodermo del borde de unión entre el mesodermo y el endodermo. Utilizando un par de tijeras, corte la capa restante de endodermo amarillo y transfiérala a la placa de cultivo de seis centímetros llena con medio de crecimiento.Utilizando un gotero, transfiera el endodermo de color amarillo claro desde la placa de cultivo de seis centímetros a un tubo cónico de 15 mL después de la recopilación del medio salino de Yolk (YSM), y añádale 15 mL de medio de crecimiento previamente preparado. Coloque el tubo cónico en un baño de agua a 37 grados Celsius hasta que se completen todas las recopilaciones de tejido. Comience disolviendo 6,5 unidades de colagenasa tipo IV en 10 mL de DMEM.A continuación, centrifugue los tubos que contienen endodermo a 130 ×g durante tres minutos a temperatura ambiente. Tras la centrifugación, aspire el medio y utilice una pipeta para transferir todas las muestras de endodermo a una placa de cultivo de seis centímetros. Luego, agregue un mililitro de solución de colágeno a la placa.Con tijeras curvas, proceda a cortar el endodermo recolectado de cuatro embriones de codorniz en rebanadas de aproximadamente dos a tres milímetros de tamaño. Posteriormente, recolecte las rebanadas en un tubo cónico de 50 mL y añádales nueve mililitros de solución fresca de colagenasa, que ya se encuentra dentro del tubo cónico de 50 mL. Para mejorar la proliferación celular durante la etapa de explante, coloque el tubo en un baño de agitación ajustado a 37 grados Celsius.Luego, incubar el tubo cónico durante 30 minutos para digerir parcialmente el tejido con colagenasa. La digestión proteolítica parcial es el paso más importante para mejorar la recolección de células del endodermo del saco vitelino. Nuestros datos muestran una mejora significativa en la tasa de éxito del cultivo celular y la proliferación celular mediante el procedimiento de digestión con colagenasa.Tras la digestión con colagenasa, centrifugar el tejido a 130 veces g durante tres minutos a temperatura ambiente y luego eliminar la fracción sobrenadante con una pipeta. Proceder a lavar el sedimento resuspendiéndolo en 20 mL de DMEM. Centrifugar el tubo como se describió anteriormente, luego eliminar el sobrenadante y resuspender el sedimento en 12 mL de medio de crecimiento.Luego, agregue suavemente 500 microlitros de la suspensión a cada pocillo de una placa de 24 pocillos. Incube los explantes de endodermo durante dos días a 37 grados Celsius en 5%CO2. Durante este tiempo, espere que las células proliferen a partir de los tejidos.A continuación, incubar las células durante otros dos días. Luego, someterlas a un ensayo de viabilidad celular y visualizar los resultados utilizando un lector de placas. Posteriormente, realizar RT-qPCR para evaluar los niveles de expresión de marcadores de interés en las EEC y verificar el tamaño del producto de RT-qPCR mediante electroforesis en gel, como se describe en el protocolo del texto.En comparación con los explantes no tratados, aquellos parcialmente digeridos con colagenasa mostraron una proliferación celular significativamente mayor, como se muestra en estas gráficas y se determinó mediante una prueba t pareada, lo que demuestra el éxito del sistema de cultivo. Para evaluar los efectos de otras enzimas, se realizaron ensayos de viabilidad celular en tejidos tratados con colagenasa y dispasa o con colagenasa sola. Durante los primeros cinco días de incubación, el crecimiento celular fue similar en ambas condiciones.Sin embargo, desde el día seis hasta el nueve, solo las EEC tratadas con colagenasa proliferaron de manera constante, lo que sugiere que la digestión parcial con esta enzima mejora el crecimiento y debería usarse preferentemente. Cuando se visualizaron las EEC cultivadas, mostraron características similares a las de adipocitos, como grandes gotas lipídicas circulares, tal como se muestra aquí. Dichas células también fueron positivas para la tinción con rojo Oil O, que se utiliza típicamente para identificar adipocitos.Apoyando estos datos morfológicos, la PCR cuantitativa en tiempo real reveló que las EEC cultivadas muestran altos niveles de SOAT1, una proteína que sintetiza ésteres de colesterol a partir de colesterol. Esto sugiere además que las EEC cultivadas presentan las características fisiológicas adecuadas de adipocitos. Importante, cuando las EEC fueron expuestas a IBMX y forskolina, factores que aumentan los niveles de adenosina monofosfato cíclico, o cAMP, y cultivadas durante 24 horas, ambos tratamientos estimularon la expresión de SOAT1, lo que sugiere posibles mecanismos de regulación de SOAT1 y utilización de lípidos en el YSM.Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en aproximadamente cuatro horas, durante las cuales se pueden recolectar al menos tres muestras. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar métodos como el de SOAT1 u otros ensayos de actividad enzimática, así como una confirmación visual similar. Dicho ensayo puede ayudar a responder preguntas adicionales, como en qué forma ciertas proteínas y macronutrientes participan en las etapas posteriores del desarrollo embrionario.Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la utilización de nutrientes en embriones exploraran el posible mecanismo mediante el cual los nutrientes son utilizados y transportados en un modelo embrionario aviar. Después de ver este video, usted debería ser capaz de aprender cómo recolectar tejidos endodérmicos de embriones aviares, y también saber cómo cultivar células EEC para estudiar el transporte y la utilización de nutrientes embrionarios utilizando el modelo aviar.

primary-endodermal-epithelial-cell-culture-from-yolk-sac-membrane

Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Este video muestra la nueva cultura, un método por el cual los embriones de pollo se cultivan fuera del huevo hasta por 24 horas. Este método le permite a uno para estudiar el desarrollo temprano (línea primitiva a 14 som.), Un período que corresponde a E7-9 en el ratón. Las aplicaciones de esta técnica incluyen la electroporación, la hibridación in situ e inmunohistoquímica.

Método para la Cultura de primeros embriones del polluelo ex vivo (Nueva Cultura)

En este artículo se proporciona un método para aislar y cultivar la codorniz o pollo...

Aislamiento y cultivo de células embrionarias progenitoras aviar valvular

Un enfoque para el análisis de la migración y el destino final de las aves las células de la cresta neural en la codorniz, pollo embriones quiméricos se describe. Este método es una técnica simple y directa para el seguimiento de las células de la cresta neural durante la migración y la diferenciación que son difíciles de distinguir dentro de un embrión de pollo no manipulado.

Análisis de la migración de la cresta neural y la diferenciación de las especies cruzadas Trasplante

Este artículo proporciona un acercamiento actualizado al sistema clásico de codorniz-gallina de quimera para estudiar la formación del órgano, mediante la combinación de nuevos procedimientos experimentales in vitro e in ovo .

Enfoque de dos pasos para explorar y finales-inicios de la formación de órganos en el modelo aviar: el timo y glándulas paratiroides organogénesis paradigma

Aquí, presentamos un organotypic cultivo protocolo para crecer órganos embrionarios de pollo en vitro. Usando este método, el desarrollo de tejidos de embrión de pollo puede ser estudiado, manteniendo un alto grado de control sobre el ambiente de cultivo.

Cultura Organotypic método para estudiar el desarrollo de tejidos de embrión de pollo

Este artículo proporciona un método para aislar puros tejidos embrionarios de embriones de codorniz y pollo que pueden combinarse para formar ex vivo quimérica órganos.

Aislamiento de los tejidos embrionarios y formación de órganos quiméricas pollo codorniz utilizando el ejemplo de timo

Este protocolo describe el aislamiento de células epiteliales de diferentes regiones anatómicas de la membrana amniótica humana para determinar su heterogeneidad y propiedades funcionales para su posible aplicación en modelos clínicos y fisiopatológicos.

Cultivo In Vitro de Células Epiteliales de Diferentes Regiones Anatómicas de la Membrana Amniótica Humana

Describimos un protocolo simple para desarrollar organoides epiteliales mucociliares a partir de células ectoderm profundas aisladas de embriones Xenopus laevis. Los progenitores multipotentes regeneran precursores de células de copa epitelial y permiten el seguimiento en vivo de la iniciación y progresión de las transiciones celulares en la superficie de los organoides.

Organoides epiteliales mucocilios de células embrionarias de Xenopus: generación, cultura e imágenes en vivo de alta resolución

La membrana corioalantoidea (CAM) del embrión aviar es una herramienta muy útil y aplicable para diversas áreas de investigación. Un modelo especial ex ovo de codorniz japonesa CAM es adecuado para la investigación de tratamientos fotodinámicos.

Membrana corioalantoidea de codorniz: una herramienta para el diagnóstico fotodinámico y la terapia

Este protocolo versátil describe el aislamiento de células de la cresta neural premigratoria (NCC) a través de la escisión de pliegues neurales craneales de embriones de pollo. Tras el recubrimiento y la incubación, las NCC migratorias emergen de los explantes del pliegue neural, lo que permite la evaluación de la morfología celular y la migración en un entorno 2D simplificado.

Preparación y análisis morfológico de cultivos de células de cresta neural craneal de pollo

Aprende a cultivar células epiteliales endodérmicas primarias de membranas de saco vitelino de codorniz japonesa. Este método permite estudiar la utilización de lípidos y el transporte de nutrientes en embriones aviares.

Endodérmico primario de células epiteliales Cultura de la membrana del saco vitelino de embriones de codorniz japonesa

Explorar más videos