Endodérmico primario de células epiteliales Cultura de la membrana del saco vitelino de embriones de codorniz japonesa

El objetivo general de este procedimiento de explante ex vivo es mejorar la recolección y ampliar la aplicación de células epiteliales endodérmicas aviares para estudiar la función de enzimas y proteínas en la mediación de la utilización de nutrientes por embriones aviares. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre la utilización de lípidos durante la embriogénesis aviar, como la forma en que los lípidos del vitelo se empaquetan y transportan desde el vitelo al embrión durante las etapas finales del desarrollo. La principal ventaja de esta técnica es que podemos obtener con éxito células epiteliales endodérmicas funcionales a partir de la membrana del saco vitelino de codorniz japonesa, las cuales pueden utilizarse como un modelo para estudiar el desarrollo embrionario aviar.

Comience preparando una solución de PBS 10x según se describe en el protocolo escrito. Diluya esta solución madre de uno a diez para preparar PBS 1x, que se utilizará para lavar la membrana del saco vitelino durante la disección del endodermo. Para preparar el medio de crecimiento para las células epiteliales endodérmicas, o EEC, primero suplemente el DMEM/F-12 con 10% de suero de ternera recién nacida y 1% de solución de penicilina-estreptomicina-anfotericina.

A continuación, introduzca la sonda de un pH-metro en el DMEM previamente preparado. Añada tres gotas de HCl normal al medio hasta que el pH se haya ajustado a 7,2. Después de recolectar aproximadamente dos docenas de huevos de codorniz fertilizados, colóquelos verticalmente en recipientes para huevos de forma que sus extremos anchos, no afilados, donde se localizan las celdas de aire, queden orientados hacia arriba.

Luego, transfiera los huevos a una incubadora bien ventilada ajustada a 37 grados Celsius. Después de cinco días de incubación, examine los huevos con un candil para huevos. Si los embriones se han desarrollado normalmente, espere ver una estructura circular de vasos capilares debajo de la cámara de aire.

Seleccione un huevo que muestre un desarrollo normal de capilares y limpie la cáscara con agua fresca y etanol al 75 %. A continuación, abra la cáscara del huevo desde la posición de la cámara de aire utilizando tijeras. Use pinzas para ayudar suavemente a verter el contenido del huevo en una placa de cultivo vacía de 10 cm.

Luego, use tijeras para separar el embrión, la yema y cualquier albúmina de la membrana del saco vitelino, que se abrevia como MSV. Una vez aislada, lave la MSV tres veces con PBS 1x y, a continuación, transfiérala a un nuevo plato de 10 cm que contenga PBS. Posteriormente, coloque el plato bajo un microscopio estereoscópico.

Luego, proceda a eliminar cualquier resto de clara de huevo, que está adyacente a la capa externa de ectodermo del MVS, con tijeras. Continúe utilizando pinzas para levantar el ectodermo translúcido y el mesodermo estructural de los capilares de color rojo desde el borde del mesodermo en la membrana del saco vitelino. A continuación, desprenda suavemente juntos el ectodermo y el mesodermo para aislar la capa celular de endodermo subyacente.

Luego, con un par de pinzas, sostenga firmemente la capa de células endodérmicas amarillas de la membrana. Con otro par, agarre el mesodermo capilar y proceda a separar el mesodermo del borde de unión entre el mesodermo y el endodermo. Utilizando un par de tijeras, corte la capa restante de endodermo amarillo y transfiérala a la placa de cultivo de seis centímetros llena con medio de crecimiento.

Utilizando un gotero, transfiera el endodermo de color amarillo claro desde la placa de cultivo de seis centímetros a un tubo cónico de 15 mL después de la recopilación del medio salino de Yolk (YSM), y añádale 15 mL de medio de crecimiento previamente preparado. Coloque el tubo cónico en un baño de agua a 37 grados Celsius hasta que se completen todas las recopilaciones de tejido. Comience disolviendo 6,5 unidades de colagenasa tipo IV en 10 mL de DMEM.

A continuación, centrifugue los tubos que contienen endodermo a 130 ×g durante tres minutos a temperatura ambiente. Tras la centrifugación, aspire el medio y utilice una pipeta para transferir todas las muestras de endodermo a una placa de cultivo de seis centímetros. Luego, agregue un mililitro de solución de colágeno a la placa.

Con tijeras curvas, proceda a cortar el endodermo recolectado de cuatro embriones de codorniz en rebanadas de aproximadamente dos a tres milímetros de tamaño. Posteriormente, recolecte las rebanadas en un tubo cónico de 50 mL y añádales nueve mililitros de solución fresca de colagenasa, que ya se encuentra dentro del tubo cónico de 50 mL. Para mejorar la proliferación celular durante la etapa de explante, coloque el tubo en un baño de agitación ajustado a 37 grados Celsius.

Luego, incubar el tubo cónico durante 30 minutos para digerir parcialmente el tejido con colagenasa. La digestión proteolítica parcial es el paso más importante para mejorar la recolección de células del endodermo del saco vitelino. Nuestros datos muestran una mejora significativa en la tasa de éxito del cultivo celular y la proliferación celular mediante el procedimiento de digestión con colagenasa.

Tras la digestión con colagenasa, centrifugar el tejido a 130 veces g durante tres minutos a temperatura ambiente y luego eliminar la fracción sobrenadante con una pipeta. Proceder a lavar el sedimento resuspendiéndolo en 20 mL de DMEM. Centrifugar el tubo como se describió anteriormente, luego eliminar el sobrenadante y resuspender el sedimento en 12 mL de medio de crecimiento.

Luego, agregue suavemente 500 microlitros de la suspensión a cada pocillo de una placa de 24 pocillos. Incube los explantes de endodermo durante dos días a 37 grados Celsius en 5%CO2. Durante este tiempo, espere que las células proliferen a partir de los tejidos.

A continuación, incubar las células durante otros dos días. Luego, someterlas a un ensayo de viabilidad celular y visualizar los resultados utilizando un lector de placas. Posteriormente, realizar RT-qPCR para evaluar los niveles de expresión de marcadores de interés en las EEC y verificar el tamaño del producto de RT-qPCR mediante electroforesis en gel, como se describe en el protocolo del texto.

En comparación con los explantes no tratados, aquellos parcialmente digeridos con colagenasa mostraron una proliferación celular significativamente mayor, como se muestra en estas gráficas y se determinó mediante una prueba t pareada, lo que demuestra el éxito del sistema de cultivo. Para evaluar los efectos de otras enzimas, se realizaron ensayos de viabilidad celular en tejidos tratados con colagenasa y dispasa o con colagenasa sola. Durante los primeros cinco días de incubación, el crecimiento celular fue similar en ambas condiciones.

Sin embargo, desde el día seis hasta el nueve, solo las EEC tratadas con colagenasa proliferaron de manera constante, lo que sugiere que la digestión parcial con esta enzima mejora el crecimiento y debería usarse preferentemente. Cuando se visualizaron las EEC cultivadas, mostraron características similares a las de adipocitos, como grandes gotas lipídicas circulares, tal como se muestra aquí. Dichas células también fueron positivas para la tinción con rojo Oil O, que se utiliza típicamente para identificar adipocitos.

Apoyando estos datos morfológicos, la PCR cuantitativa en tiempo real reveló que las EEC cultivadas muestran altos niveles de SOAT1, una proteína que sintetiza ésteres de colesterol a partir de colesterol. Esto sugiere además que las EEC cultivadas presentan las características fisiológicas adecuadas de adipocitos. Importante, cuando las EEC fueron expuestas a IBMX y forskolina, factores que aumentan los niveles de adenosina monofosfato cíclico, o cAMP, y cultivadas durante 24 horas, ambos tratamientos estimularon la expresión de SOAT1, lo que sugiere posibles mecanismos de regulación de SOAT1 y utilización de lípidos en el YSM.

Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en aproximadamente cuatro horas, durante las cuales se pueden recolectar al menos tres muestras. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar métodos como el de SOAT1 u otros ensayos de actividad enzimática, así como una confirmación visual similar. Dicho ensayo puede ayudar a responder preguntas adicionales, como en qué forma ciertas proteínas y macronutrientes participan en las etapas posteriores del desarrollo embrionario.

Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la utilización de nutrientes en embriones exploraran el posible mecanismo mediante el cual los nutrientes son utilizados y transportados en un modelo embrionario aviar. Después de ver este video, usted debería ser capaz de aprender cómo recolectar tejidos endodérmicos de embriones aviares, y también saber cómo cultivar células EEC para estudiar el transporte y la utilización de nutrientes embrionarios utilizando el modelo aviar.