Identificación de Kinesin-1 Cargos El uso de microscopía de fluorescencia

El objetivo general de esta metodología es identificar las cargas de Kinesina-1 mediante microscopía de fluorescencia. Este método nos ayuda a responder preguntas clave en el campo de los motores moleculares, como qué cargas transportan las quinesinas y las miosinas. La principal ventaja de esta técnica es que los mutantes negativos dominantes KIF5B pueden ayudarnos a identificar visualmente esta carga mediante microscopía fluorescente.

Para empezar, para obtener imágenes de células vivas o de fluorescencia indirecta a 40X o menos, alimente de 0,2 a 0,3 millones de células HeLa en un mililitro de medio completo en cada pocillo de una placa de seis pocillos. Cultive las células a 37 grados centígrados con un cinco por ciento de dióxido de carbono. Para estudios de inmunofluorescencia indirecta con aumentos superiores a 40X, en una cabina de bioseguridad para evitar la contaminación, use alcohol absoluto para lavar los cubreobjetos y colóquelos en los pocillos de una placa de seis pocillos para que se sequen al aire.

Cuando los cubreobjetos se hayan secado, colóquelos en los pocillos y siembre de 0,2 a 0,3 millones de células en un mililitro de DMEM completo en cada pocillo de la placa. Cultive las células durante la noche. Al día siguiente, dentro de un gabinete de bioseguridad, use 0,1 mililitros de medio de transfección para diluir 0,6 microgramos de un plásmido de expresión KIF5B de tipo silvestre o sin motor marcado con tdTomato con o sin un plásmido que exprese una proteína de carga candidata.

En otro tubo de microcentrífuga de 1,6 mililitros, agregue 1,8 microlitros del reactivo de transfección a 0,1 mililitros de medio de transfección. A continuación, incubar a temperatura ambiente durante cinco minutos. A continuación, añada 0,1 mililitros del reactivo de transfección diluido a las muestras de ADN diluidas.

Invierta los tubos para mezclar el contenido y gire hacia abajo durante cinco segundos. A continuación, incubar las muestras a temperatura ambiente durante 45 minutos. Durante el período de incubación para la formación del complejo de transfección, use PBS para lavar las células tres veces.

A continuación, añada 0,8 mililitros de medio de transfección precalentado a cada pocillo y devuelva las placas a la incubadora. Después de que el reactivo de transfección diluido se haya incubado durante 45 minutos, agregue 0,2 mililitros de la solución gota a gota en cada pocillo de la placa. Balancee suavemente la placa de seis pocillos durante cinco segundos y devuélvala a la incubadora de 37 grados centígrados durante seis a ocho horas.

A continuación, utilice DMEM completo para sustituir el medio. Para llevar a cabo la obtención de imágenes de células vivas después de 16 horas adicionales de incubación, añada la tinción intercalante de ADN Hoechst 33342 al medio hasta una concentración final de 1 micromolar e incube las células a 37 grados centígrados durante 10 minutos. A continuación, utilizando un objetivo 40X, examine las células para la expresión de proteínas fluorescentes.

Para realizar inmunofluorescencia indirecta en células que se han incubado con reactivo de transfección:Después de preparar el paraformaldehído de acuerdo con el protocolo de texto, use PBS a temperatura ambiente para lavar las células girando la placa de seis pocillos durante cinco segundos. Agregue un mililitro de paraformaldehído al 4% y PBS recién preparados por pocillo e incube a temperatura ambiente durante 30 minutos. A continuación, utilice PBS para lavar las células una vez girando la placa y deseche la solución.

A continuación, agregue un mililitro de 0.1%Triton-X 100 en PBS a cada pocillo e incube a temperatura ambiente durante 30 minutos para permeabilizar las células. Luego use PBS para lavar las celdas cuatro veces, desechando la solución después de cada lavado. Agregue anticuerpos primarios e incube las células a temperatura ambiente con balanceo durante cuatro horas.

Después de la incubación, use PBS para lavar las células cuatro veces girando la placa. A continuación, añadir un mililitro de colorante fluorescente conjugado con anticuerpos secundarios e incubar en la oscuridad a temperatura ambiente con balanceo durante dos horas. Después de lavar las celdas cuatro veces con PBS, agregue un mililitro de DAPI e incube en la oscuridad a temperatura ambiente durante diez minutos.

Si usa cubreobjetos con las muestras, aplique 10 microlitros de solución de montaje en el centro del portaobjetos del microscopio y monte un cubreobjetos sobre la solución de montaje. Luego incube en la oscuridad a temperatura ambiente durante la noche. Al día siguiente, use esmalte de uñas para sellar los bordes e incube en la oscuridad en una campana extractora durante la noche.

Para llevar a cabo la microscopía de fluorescencia, utilice un objetivo 40X con los juegos de filtros para DAPI, CFP, FITC y Cy3 cuando corresponda. Como se demostró aquí, el KIFB de tipo salvaje expresado exógenamente apareció de manera homogénea en el citoplasma, mientras que el c-MYC apareció principalmente en el núcleo. Sin embargo, el mutante KIF5B sin motor formó agregados en el citoplasma y esto condujo a la agregación de c-MYC.

Además, el KIF5B sin motor también indujo la agregación del c-MYC endógeno y el factor de transcripción p53, lo que indica que c-MYC y p53 son ambas cargas de Kinesin-1 y KIF5B regula la localización subcelular de ambas proteínas endógenas. Esta figura ilustra que el movimiento de los factores de transcripción por KIF5B parece ser específico porque la expresión del mutante KIF5B sin motor no afectó la localización subcelular de c-Fos ni hizo que se agregara. Estos datos revelan que el método demostrado en este video permite la identificación de alta especificidad de las cargas de Kinesin-1.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar que las quinesinas son las más adecuadas para las células que tienen mucho volumen de citoplasma, por lo que se puede observar fácilmente la agregación en el citoplasma. Después de este desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de los motores moleculares construyeran mutantes negativos dominantes similares de otras kinesinas y miosinas con el fin de identificar sus cargas particulares. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo usar el mutante negativo dominante de un motor molecular para identificar esta carga, utilizando microscopía fluorescente.

No olvide que trabajar con feno, bromuro de etidio y paraformaldehído puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones para evitar el contacto directo de la piel con ellos mientras se realiza este procedimiento. Gracias por mirar. Buena suerte con tu experimento.