Name: Aislamiento de leucocitos infiltrantes de ratón Piel Usando enzimática Digest y Separación de degradado (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-25T18:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 11 s
Description: Aprende a aislar leucocitos infiltrantes de piel de ratón mediante digestión enzimática y separación por gradiente de densidad. Este método económico permite estudiar mecanismos celulares en dermatitis atópica.

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Los Institutos Nacionales de Salud (NIH R15 NS067536-01A1 a DC), la Asociación Nacional de vulvodinia (premio a DC), y Macalester College apoyaron este trabajo. CB recibió una beca del Programa de Beckman estudiosos Macalester College, financiado por la Fundación Mabel Beckman Arnold y. BTF y TM son compatibles con JDRF 2-2011-662. Agradecemos al Dr. Jason Schenkel y el Dr. Juliana Lewis para el asesoramiento técnico, y todos los miembros actuales y anteriores del laboratorio Chatterjea por su ayuda y apoyo.

Nota: los ratones 8-12 semanas de edad Hembra ND4 Swiss Webster, convencionalmente alojados con libre acceso a los alimentos y el agua, fueron utilizados para estos estudios El protocolo experimental utilizado (B13S1) fue aprobado por IACUC de Macalester College.. 1. Sensibilización y Desafío con oxazolona <ol><li> Día 0 <ol><li> Preparar cámara de anestesia mediante la adición de 3 ml de isoflurano a las toallas absorbentes colocados debajo de la malla en la parte inferior de un 4 L frasco de vidrio con tapa. Para los ratones hembra ND4 utiliza aquí, el tiempo en la cámara es de 30-60 seg hasta que el sujeto es anestesiado adecuadamente; optimizar la administración de anestesia se utiliza para la cepa de ratón. </li><li> Afeitarse la espalda de cada ratón anestesiado y flanquear usando un cortador de pelo animal. </li></ol></li><li> Día 1 <ol><li> Hacer una solución 2% de 4-etoximetilen-2-fenil-2-oxazolin-5-ona (Ox) en etanol absoluto, y se incuba a 50 ° C durante 15 min en un plato giratorio en una incubadora. </li><li> Brevemente anestesiarratones utilizando anestesia con isoflurano como se describe en 1.1.1 y aplique 100 l de 2% de buey a la afeitada de vuelta en varias aplicaciones de serie de unos 20 l cada uno. Espere 5-10 segundos entre las aplicaciones de serie de la solución a secar. </li><li> Tenga cuidado de no derramar la solución Buey 2% en regiones distintas de la parte posterior, y esperar a que la solución se seque entre aplicaciones. </li></ol></li><li> Días 5-7 <ol><li> Hacer una solución 1% de (Ox) en etanol absoluto, y se incuba a 50 ° C durante 15 min en un plato giratorio en una incubadora. </li><li> Suavemente pero con firmeza inmovilizar el ratón en el pescuezo de la base del cuello y la cola con el abdomen hacia arriba y el cuello ligeramente inclinada hacia abajo (similar a una retención para una inyección intraperitoneal) y aplicar 100 l de 1% Ox al flanco afeitado en varias aplicaciones de serie y tomarse el tiempo para secar la piel después como se ha descrito anteriormente. </li><li> Para los ratones de control, aplicar 100 l de vehículo absoluta etanol para el flan afeitadok. </li></ol></li></ol> 2. Flanco Piel Cosecha <ol><li> La eutanasia ratones utilizando la inhalación de dióxido de carbono, y extirpar con cuidado el área deseada de la piel del flanco (~ 25 mm x 25mm de la piel) con 10 cm tijeras quirúrgicas. </li><li> Usando una cuchilla quirúrgica limpia, nítida, raspar el exceso de grasa y tejido conectivo de la piel flanco. </li><li> Coloque 3 piezas de piel flanco de 3 ratones en un tubo cónico de 50 ml que contiene 10 ml de HBSS RT [con rojo de fenol, sin calcio o magnesio, 5 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), 10 mM 4- (2-hidroxietil) -1- ácido piperazinetanosulfónico (HEPES), y suero bovino fetal al 10% (FBS)]. </li></ol> 3. Pre-digestión del tejido Lavadora <ol><li> Colocar el tubo que contiene fragmentos de piel en una placa giratoria para 30 min en una incubadora no gaseados seco mantenido a 37 ° C. </li><li> Vortex vigorosamente durante 10 segundos al final del periodo de incubación. </li><li> Cuele el contenido del tubo a través de un m 70colador para desechar el tampón de lavado y recoger el tejido. Un único tamiz puede ser reutilizado durante todo el procedimiento dentro de un grupo de tratamiento biológico. </li><li> El uso de un par de fórceps, transferir la piel flanco desde el colador en un nuevo tubo cónico de 50 ml que contiene 10 ml de fresco, medios de comunicación RT HBSS (que contienen EDTA, HEPES, FBS y como se describe anteriormente). </li><li> Con un par 12.5 cm de tijeras de disección quirúrgicos inmersos en el tubo, pelos en cada pieza de piel del flanco de manera que la pieza media del tejido es de aproximadamente 2,2 mm x 2,2 mm en la zona. </li><li> Colocar el tubo que contiene fragmentos de piel en una placa giratoria para 30 min en una incubadora no gaseados seco mantenido a 37 ° C. </li><li> Vortex vigorosamente durante 10 segundos al final de la incubación </li></ol> 4. La digestión de colagenasa de la piel <ol><li> Cuele el contenido del tubo a través de un colador de 70 micras, recoger y transferir las piezas de piel flanco en un nuevo tubo cónico de 50 ml que contiene 10 ml fresh, medios RT HBSS suplementado con 0,7 mg / ml de colagenasa D. </li><li> Colocar el tubo que contiene medio de la digestión y fragmentos de piel en una placa giratoria para 30 min en una incubadora no gaseados seco mantenido a 37 ° C. </li><li> Contenidos vórtice de tubo vigorosamente durante 10 segundos al final de la incubación. </li><li> Filtrar contenido del tubo a través de un colador de 70 micras en un nuevo tubo cónico de 50 ml; mantener el flujo a través que contiene el tejido digerido y deseche el filtro y el flanco restos de piel. </li><li> Lavar el flujo a través en 50 ml de HBSS medios de comunicación, centrifugar durante 5 min a 350 g y decantar el sobrenadante. </li></ol> 5. Densidad centrifugación en gradiente <ol><li> Utilizando una pipeta serológica, añadir 3 ml RT 67% centrifugación en gradiente de densidad media en 1X tampón fosfato salino (PBS) en un nuevo tubo cónico de 15 ml para cada muestra. </li><li> Resuspender el sedimento celular en 5 ml RT 44% de densidad de centrifugación en gradiente de medios de comunicación en HBSS con rojo fenol. </li><li> CaballeroLy capa de 5 ml de los medios de centrifugación en gradiente de densidad 44% que contiene las células en la parte superior del gradiente de densidad de centrifugación de la muestra los medios de comunicación 67% usando una pipeta serológica. Asegúrese de ajustar la pipeta a la velocidad más baja y coloque la pipeta a lo largo de la pared del tubo cónico. Tenga cuidado de no mover, alterar, o invertir el gradiente. </li><li> Aceleración de Ajuste a la posición más baja, desenganchar el freno, y centrifugar el gradiente a 931 xg durante 20 minutos a temperatura ambiente asegurándose de que la centrífuga es equilibrada. </li><li> Después de la centrifugación, retire con cuidado el gradiente de la centrífuga, y transportar suavemente a la mesa de laboratorio sostiene el tubo en posición vertical. Usando una pipeta de transferencia de plástico de 5 ml, retire la capa de células en la interfase de los 44% y 67% de gradiente de densidad media de centrifugación y la transferencia a un nuevo tubo cónico de 15 ml. Si la interfaz no está visible, simplemente quite unos 2 ml de líquido en el 67% -44% del límite. </li><li> Llene el tubo cónico que contiene células de la interface con 2% de FBS en 1X PBS enfriado en hielo, las células de centrifugación durante 5 minutos a 350 xg, y decantar el sobrenadante. Nota: Esta es la primera vez que las células se pueden enfriar / mantenidos en frío, ya pasos de digestión son a 37 ° C y los pasos de los medios de gradiente de densidad de centrifugación son a RT. Las células pueden ser resuspendidas en un 1: 1 Trypan azul de dilución y el recuento de viabilidad y la información se puede obtener en este punto. </li></ol> 6. Bloqueo y tinción para el Análisis de citometría de flujo <ol><li> Bloquear RII / III receptores en las células para prevenir la tinción de anticuerpos no específicos. Para los experimentos descritos aquí, hacer mezclas de reacción de anticuerpos en PBS con 2% de FBS que contiene 1: 100 dilución de anticuerpo no conjugado contra CD16 / 32 (2.4G2) para atar y bloquean los receptores RII / III. </li><li> Se incuban las células bloqueadas con mezclas de reacción adecuados de anticuerpos contra CD3ɛ (145-2C11), CD4 (RM4-5), CD8a (53-6,7), CD11b (M1 / 70), CD11c (N418), CD44 (IM7), CD45 ( 30-F11), CD45R(RA3-6B2), CD62L (MEL-14), y Ly-6G / Ly-6C (Gr-1) (RB6-8C5), así como Brilliant Violet 510 mancha en vivo / muerto para identificar las células muertas. Utilice todos los anticuerpos ya sea a la dilución recomendada por los fabricantes o previamente optimizado por los investigadores. Para los experimentos descritos aquí, utilizar todos los anticuerpos a 1: 100 dilución. </li><li> Lavar las células y resuspender en 50 l de PBS 1X tampón de tinción con 2% de FBS. Mantenga en hielo hasta que los datos de fluorescencia se pueden adquirir en un citómetro de flujo. Nota: Es importante tener parámetros de compensación pre-optimizados con un tejido linfoide y un antígeno de superficie celular común (como CD4 o CD8) antes de la adquisición de los datos de fluorescencia. </li><li> Para aumentar el número de células para análisis de citometría de flujo aguas abajo, adquirir datos de las muestras enteras de células teñidas. </li></ol> 7. Analizar citometría de flujo de datos mediante los métodos estándar para lograr los pasos descritos a continuación <ol><li> En primer lugar, la puerta en la región de linfocitos de la dispersión frontal(área) por dispersión lateral (área) trama. </li><li> A continuación, seleccione las células individuales utilizando el dispersión frontal (ancho) por dispersión lateral (ancho), para evitar el análisis de dobletes. Esto también se puede lograr con una altura de dispersión hacia adelante por la altura dispersión lateral trama. </li><li> Entonces, la puerta en el linaje (CD11b, CD11c y CD45R / B220) -negativo y CD3 positivos acontecimientos, para excluir a los macrófagos, las células células dendríticas, y B, respectivamente, y confine analiza al compartimento de células T, si el objetivo es, como en este caso, para evaluar la infiltración de células T. </li><li> A continuación, la puerta en las células vivas que excluyen la mancha en vivo / muerto. </li><li> Por último, la puerta en la población celular de interés (ver sección de resultados representativos). </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen intereses financieros o de otro tipo para revelar.

La caracterización de los cambios en los leucocitos de la piel-residente en modelos de roedores de enfermedades de la piel tales como dermatitis atópica o psoriasis es importante para la comprensión de las conexiones mecánicas entre la afluencia de células inflamatorias y patología de la enfermedad. Aquí se describe una técnica económica para aislar leucocitos de tejidos de la piel con el equipo básico que se encuentra en la mayoría de los laboratorios de investigación biomédica. Esta relativamente rápida técnica evita ...

No se encontraron enfermedades de la piel que van desde dermatitis de contacto, eczema, psoriasis, celulitis, infecciones por hongos y abscesos a los cánceres de piel no melanoma de estar entre las 50 enfermedades más prevalentes en todo el mundo, y la cuarta causa mundial de enfermedades no mortales en 2010 1. Por consiguiente, la investigación de los mecanismos moleculares y celulares que subyacen a diversas patologías de la piel es un área necesaria y activa de investigación. Modelos de roedores han sido notablemente útil en la comprensión de las condiciones inflamatorias de la piel tales como dermatitis atópica 2, 3 psoriasis, o infección Staphylococcus aureus 4. Protocolos de bajo costo, eficientes y simples para la digestión enzimática de tejido de la piel del ratón pueden proporcionar preparaciones de células que se pueden utilizar para una variedad de aplicaciones posteriores para entender mejor la fisiopatología de enfermedades de la piel. Aquí, un método sencillo y económico se describe, por digestión enzimática de la piel del ratónel tejido de la piel y el aislamiento de leucocitos infiltrantes que puede ser utilizado para el cultivo celular, la transferencia adoptiva in vivo, análisis citométrico de flujo y clasificación o estudios de expresión génica. El objetivo general de este procedimiento consiste en preparar una suspensión de células de leucocitos infiltrantes de piel con la viabilidad celular alta y reducir al mínimo los costos normalmente asociados con kits de reactivos de encargo y disociadores mecánicos. Métodos de disociación del tejido de la piel existentes 5-7 pueden resultar en una baja viabilidad celular y la superficie de la integridad marcador, o requerir kits enzimáticos personalizados y costosas máquinas de disociación de tejidos 8-11. Mientras que la digestión de los tejidos de la piel de oreja de ratón es razonablemente frecuente 12-13 de la digestión de tejidos de la piel altamente queratinizado (por ejemplo, desde el flanco) puede resultar en preparaciones de células contaminadas con grandes cantidades de escombros no celular. En un estudio reciente, Zaid y colegas digeridos ratón piel flanco durante 90 minutos en 2,5 mg / ml de dispasa, Folloconducido por 45 min en 3 mg / ml de colagenasa 7. En otro estudio, estos investigadores utilizaron múltiples incubaciones con una digestión combinada de 2,5 hr, incluyendo el uso de tripsina / EDTA, colagenasa III, y dispasa 5. No se recomienda el uso de tripsina durante la digestión enzimática de la piel, como se ha demostrado que el tratamiento con tripsina de diferentes fabricantes para afectar apreciablemente la integridad de las proteínas de la superficie celular en células de mamífero 14-15. Además, dispasa puede tener efectos significativos sobre las capacidades proliferativas de células CD4 y CD8a T y afectar a la abundancia de superficie de al menos 20 moléculas, incluyendo T común marcadores de activación celular, tales como CD62L 16. Otros protocolos utilizan RPMI 1640 en el medio de la digestión 6. Sin embargo, la presencia de Mg2 + y Ca2 + en medio RPMI puede causar la agregación extensa celular 17. Un protocolo ideal para la disociación del tejido debe aspirar a la viabilidad celular alta, bajaniveles de agregación celular, y un daño mínimo a proteínas de la superficie celular. Preparaciones de células del estroma de los ganglios linfáticos de alta calidad se han cumplido con los protocolos que utilizan incubaciones enzimáticas más cortos, Ca 2+ y Mg 2+ medios de comunicación libres, y evitar la tripsina y Dispasa 18. Sin embargo, los protocolos de este tipo no se han establecido para la disociación de la piel entera de ratón. Aquí, un protocolo se describe a disociar, aislar y enriquecer los leucocitos infiltrantes de la piel de la piel del flanco del ratón alergeno-desafió. Brevemente, piel extirpada se pre-incubó en solución salina equilibrada de Hank (HBSS) con suero bovino fetal al 10% durante 1 hora para suavizar el tejido para la digestión y eliminar cualquier exceso de piel o tejido graso muerto. Esto es seguido por una etapa de digestión enzimática 30 min con 0,7 mg / ml de colagenasa D. colagenasa D tiene efectos mínimos sobre la densidad de marcadores de superficie celular, y ningún efecto sobre la proliferación de células T in vitro 16,18, por lo que esmuy adecuado para aplicaciones que implican la caracterización de proteínas de la superficie. Después de la digestión enzimática, se utilizó centrifugación en gradiente de densidad discontinuo para eliminar las células epiteliales y los restos de la suspensión de una sola célula y enriquecer para las células hematopoyéticas. Es importante destacar que este procedimiento evita costosos reactivos separación celular magnética basada en la columna de disociación y máquinas de tejido 8-11, y se puede realizar con el equipo y los materiales encontrados en un laboratorio de investigación básica biomédica. Aquí se utiliza este protocolo para aislar los leucocitos de la piel flanco desafiado tres veces con la oxazolona hapteno (buey) en ratones ND4 suizos previamente sensibilizados (adaptado de 19). Las células se analizaron mediante citometría de flujo multiparamétrica. Esta técnica produjo una suspensión de células con los desechos mínimo y&gt; 95% de viabilidad de los linfocitos aislados que fueron analizados por el flujo multi-paramétrico citometría para medir la infiltración de linfocitos y neutrófilos T en el sk afectadaen.

<table><tbody><tr><td>HBSS con rojo fenol, sin calcio, sin magnesio, líquido</td><td>Sigma Aldrich</td><td>55021C</td><td>Mantener estéril hasta el día de su uso.</td></tr><tr><td>HEPES, &ge; 99,5% (valoración)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>EDTA solución salina disódica</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7889</td><td>Mantener estéril hasta el día de su uso.</td></tr><tr><td>Suero Fetal Bovino, USDA, Inactivado por Calor, Premium Select</td><td>MidSci</td><td>S01520HI</td><td>Mantener estéril hasta el día de su uso.</td></tr><tr><td>Percoll, pH 8.5-9.5 (25&grados; C)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>P1644</td><td>Mantener estéril. Percoll debe hacerse isotónico con PBS estéril 10X antes de su uso.</td></tr><tr><td>Kit combinado de recortadora</td><td>Kent Scientific</td><td>CL9990-1201&nbsp;</td><td>Use la recortadora más grande para afeitar el flanco y la espalda.</td></tr><tr><td>4-etoximetileno-2-fenil-2-oxazolina-5-ona</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E0753-10G</td><td>se disuelve en 100% EtOH a 50 grados; C durante 15 minutos en un plato giratorio.</td></tr><tr><td>Anti-ratón purificado CD16/CD32 (2.4G2)</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>70-0161</td><td>Anticuerpo utilizado para bloquear la unión de anticuerpos no específicos durante la tinción de anticuerpos para la citometría de flujo</td></tr><tr><td>anti-CD3&epsilon;-BV650 (145-2C11)</td><td>Becton Dickinson</td><td>564378</td><td>Anticuerpo utilizado para teñir células para citometría</td></tr><tr><td>de flujo anti-CD4-APC-eFluor780 (RM4-5)</td><td>eBioscience</td><td>47-0042-80</td><td>Anticuerpo utilizado para teñir células para el flujo citometría</td></tr><tr><td>anti-CD8&alpha;-BV785 (53-6.7)</td><td>BioLegend</td><td>100749</td><td>Anticuerpo utilizado para teñir células para citometría</td></tr><tr><td>de flujo anti-CD11b-eFluor450 (M1/70)</td><td>eBioscience</td><td>48-0112-80</td><td>Anticuerpo utilizado para teñir células para citometría de flujo</td></tr><tr><td>anti-CD11c-eFluor450 (N418)</td><td>eBioscience</td><td>48-0114-80</td><td>Anticuerpo utilizado para teñir células para citometría</td></tr><tr><td>de flujo anti-CD44-BV711 (IM7)</td><td>Becton Dickinson</td><td>563971</td><td>Anticuerpo utilizado para teñir células para citometría de flujo</td></tr><tr><td>anti-CD45-FITC (30-F11)</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>35-0451-U025</td><td>Anticuerpo utilizado para teñir células para citometría</td></tr><tr><td>de flujo anti-CD45R-eFluor450 (RA3-6B2)</td><td>eBioscience</td><td>48-0452-80</td><td>Anticuerpo utilizado para teñir células para citometría</td></tr><tr><td>de flujo anti-CD62L-PerCP-Cy5.5 (MEL-14)</td><td>BioLegend</td><td>104431</td><td>Anticuerpo utilizado para teñir células para citometría de flujo</td></tr><tr><td>anti-Ly-6G/Ly-6C (Gr-1)-PE (RB6-8C5)</td><td>BioLegend</td><td>108407</td><td>Anticuerpo utilizado para teñir células para citometría de flujo</td></tr><tr><td>Ghost Dye-BV510</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>13-0870-T100</td><td>Colorante de viabilidad para citometría de flujo</td></tr><tr><td>LSR Fortessa</td><td>Becton Dickinson</td><td>N/A</td><td>Analizador de células (18 parámetros)</td></tr><tr><td>Colagenasa D de Clostridium histolyticum</td><td>Roche Applied Science</td><td>11088858001</td><td>Enzima liofilizada alícuota a 5 mg/ml en HBSS con rojo fenol, sin calcio y sin magnesio en alícuotas de 1 mL.&nbsp; Almacene inmediatamente a -20 grados; C durante un máximo de seis meses.</td></tr><tr><td>ND4 Ratones hembra suizos</td><td>Harlan</td><td>0-32</td><td>de 8-12 semanas de edad; alojados convencionalmente con acceso gratuito a alimentos y agua y utilizados de acuerdo con las pautas de IACUC de Macalester College.</td></tr></tbody></table>

aislamiento de leucocitos infiltrantes de ratón piel usando enzimática digest y separación de degradado

Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

La disociación de la piel murina en una suspensión unicelular es esencial para el análisis celular posterior, como la caracterización de las células inmunitarias infiltrantes en modelos de inflamación de la piel en roedores. Aquí, describimos un protocolo para la digestión de la piel de ratón en una solución rica en nutrientes con colagenasa D, seguida de la separación de células hematopoyéticas utilizando un gradiente de densidad discontinuo. Las células así obtenidas se pueden utilizar para estudios in vitro, transferencia in vivo y otros análisis celulares y moleculares posteriores, incluida la citometría de flujo. Este protocolo es una alternativa eficaz y económica a los costosos disociadores mecánicos, las columnas de separación especializadas y los métodos de digestión más duros basados en tripsina y dispasa, que pueden comprometer la viabilidad celular o la densidad de las proteínas de superficie relevantes para la caracterización fenotípica o la función celular. Como se muestra aquí en nuestros datos representativos, este protocolo produjo células altamente viables, contenía subconjuntos específicos de células inmunitarias y no tuvo ningún efecto sobre la integridad de las proteínas marcadoras de superficie comunes utilizadas en el análisis de citometría de flujo.

La colagenasa D tratada esplenocitos muestran niveles similares de CD4 y CD8 α en las células T en comparación con los controles tratados con los medios En primer lugar, cualquier efecto potencial de colagenasa D sobre la frecuencia y la superficie abundancia de linaje y activación marcadores en subconjuntos de células T se evaluaron utilizando el tejido linfoide secundario como un control. Una suspensión de esplenocitos se obtuvo...

Este protocolo describe la digestión enzimática de la piel de ratón en un medio rico en nutrientes seguida de una separación en gradiente para aislar leucocitos. Las células así derivadas se pueden utilizar para diversas aplicaciones posteriores. Se trata de una alternativa eficaz, económica y mejorada a las máquinas de disociación de tejidos y a los protocolos más estrictos de digestión de tejidos basados en tripsina y dispasas.

Aislamiento de leucocitos infiltrantes de ratón Piel Usando enzimática Digest y Separación de degradado

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...

El objetivo general de este procedimiento es aislar los leucocitos infiltrantes de la piel mediante la digestión enzimática y la separación en gradiente de densidad. Este método se puede aplicar a la investigación de los mecanismos celulares y moleculares en muchos modelos murinos de patologías de la piel, incluida la dermatitis atópica. Aunque este método puede proporcionar información sobre la biología de los leucocitos infiltrantes de la piel, también se puede aplicar a la investigación de otras poblaciones de células residentes.Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades con la recolección de la piel, que incluye la eliminación completa del exceso de tejido adiposo y conectivo. La demostración visual de este método es fundamental, ya que la recolección de piel y el manejo del gradiente de densidad son difíciles de aprender y requieren precisión y práctica. En el momento apropiado después del tratamiento, use tijeras quirúrgicas de 10 centímetros para extirpar cuidadosamente un área de 25 por 25 milímetros de piel afeitada del flanco de un ratón Swiss-Webster hembra ND4 adulto de ocho a doce semanas de edad.Use una cuchilla quirúrgica limpia y afilada para raspar el exceso de grasa y tejido conectivo de la piel, luego transfiera la piel a un tubo cónico de 50 mililitros que contenga 10 mililitros de HBSS a temperatura ambiente suplementado con EDTA, HEPES y FBS, y predigiera el tejido en una placa giratoria durante 30 minutos en un recipiente seco y sin gas. Incubadora de 37 grados centígrados. Al final de la incubación, agite el tubo vigorosamente durante diez segundos y filtre la suspensión de tejido a través de un colador de 70 micras. A continuación, use un par de pinzas para transferir las piezas de piel del flanco del colador a un nuevo tubo de 50 mililitros que contenga diez mililitros de medios HBSS frescos a temperatura ambiente, suplementados con EDTA, HEPES y FBS, luego use un par de tijeras de disección quirúrgica de 12,5 centímetros para picar cada pieza de piel del flanco de modo que la pieza promedio de tejido tenga un tamaño aproximado de 2,2 por 2,2 milímetros.Cuando se hayan picado todas las piezas, regrese el tubo a la placa giratoria para otra incubación de 30 minutos. Agite el tubo vigorosamente durante 10 segundos al final de la incubación y filtre el contenido a través del colador de 70 micras. Recoja los trozos restantes de piel del flanco en un nuevo tubo de 50 mililitros que contenga 10 mililitros de HBSS suplementado con 0,7 miligramos por mililitro de colagenasa D, y regrese el tubo a la placa giratoria para otra incubación de 30 minutos.Después de otros 10 segundos de vórtice, filtre el contenido del tubo nuevamente, esta vez descartando los desechos en el colador, luego llene el tubo con hasta 50 mililitros de HBSS, EDTA, HEPES, FBS, gire las células y decante el sobrenadante. Agregue tres mililitros de medio de centrifugación de gradiente de densidad del 67 por ciento a temperatura ambiente en PBS a un nuevo tubo cónico de 15 mililitros y vuelva a suspender el pellet de celda en cinco mililitros de medio de centrifugación de gradiente de densidad del 44 por ciento a temperatura ambiente en HBSS con rojo fenol. Ajustando la pipeta a la velocidad más baja, coloque la pipeta en el lateral del tubo y coloque suavemente las células sobre el medio de centrifugación con gradiente de densidad del 67 por ciento.Al trabajar con gradientes de densidad, tenga cuidado de evitar la formación de burbujas y minimizar las interrupciones en la interfaz del degradado. A continuación, separe las células, utilizando una pipeta de transferencia de cinco mililitros para recoger las células en la interfaz al final de la centrifugación. Dado que la superposición suave del gradiente y la extracción cuidadosa de la interfaz de los gradientes son pasos críticos, es aconsejable practicar la estratificación del medio de centrifugación en gradiente de densidad y la eliminación de la interfaz con la suspensión de los esplenocitos murinos antes de intentar el procedimiento con las células experimentales de interés.Finalmente, lavar las células recolectadas en PBS helado suplementado con FBS en un tubo cónico de 15 mililitros y contar el número de células viables por exclusión de azul de tripano. La expresión superficial de CD4 y CD8-alfa no se ve afectada por la digestión de la colagenasa D, ya que se detecta el mismo número de células CD4 positivas y CD8-alfa positivas con o sin digestión enzimática. Además, la digestión de la colagenasa D no muestra ningún efecto sobre la densidad superficial de los marcadores de activación de células T CD44 y CD62L en las células T CD4 positivas.Después de la separación por gradiente, se aíslan alrededor de 250 células inmunitarias viables por milímetro cuadrado de tejido de flanco de ratones desafiados por oxazolona, o ratones desafiados por buey, frente a solo cuatro células inmunitarias viables por milímetro cuadrado de tejido en ratones desafiados por vehículos, previamente sensibilizados con Ox.El 95 por ciento de las células individuales de dispersión lateral y hacia adelante bajas en ratones desafiados por Ox, y el 71 por ciento de estas células en controles desafiados por vehículos son células vivas CD45 positivas. lo que equivale a un aumento de aproximadamente 67 veces en la población de células inmunitarias CD45 positivas infiltrantes en la piel del flanco después de tres desafíos diarios con Buey. De hecho, el desafío con el buey da como resultado la infiltración pronunciada de células T y neutrófilos en la piel del flanco, con el 42 por ciento de las células CD45 positivas vivas únicas en los animales tratados con Ox, neutrófilos positivos aparentes para Gr-1 y aproximadamente el 84 por ciento de células T positivas para CD3 que expresan CD8-alfa, o CD4, en comparación con los animales de control tratados con etanol. Una vez dominada, esta técnica se puede completar en unas tres horas si se realiza correctamente.Al intentar este procedimiento, es importante recordar manejar el gradiente de densidad con cuidado. No olvide utilizar siempre un medio de centrifugación de gradiente de densidad a temperatura ambiente al realizar este procedimiento. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como el análisis de citometría de flujo, la clasificación de células, la transferencia de células o el cultivo celular in vitro para evaluar el fenotipo y la función de los leucocitos infiltrantes de la piel.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar los leucocitos infiltrantes de la piel mediante la digestión enzimática y la centrifugación en gradiente de densidad.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Un método rápido para obtener la infiltración de leucocitos en el cerebro murino se describe. Este método utiliza un gradiente de Percoll continua y discontinua gradiente de Ficoll para seleccionar y purificar la capa de leucocitos enriquecido. Leucocitos aislados se puede caracterizar por las mediciones de citometría de flujo.

El aislamiento de la infiltración de leucocitos cerebro-

Un modo eficaz de aislar los linfocitos de ratón tracto genital se describe. Este método tiene la ventaja de digestión enzimática y separación por gradiente de Percoll para permitir el aislamiento eficiente. Esta técnica es también adaptable a para su uso en otras...

Aislamiento de linfocitos de ratón del tracto genital Mucosa

En este video, demostramos el aislamiento de células mononucleares de lámina propia del tejido colónico murino mediante digestión enzimática utilizando colagenasa E y separación por gradiente de medios de separación por densidad a base de sílice. Las células mononucleares aisladas se pueden utilizar para el análisis posterior.

Aislamiento de células mononucleares Lamina Propria: una técnica de centrifugación en gradiente de densidad basada en sílice para obtener células mononucleares a partir del colon murino

Describimos un protocolo para aislar eficientemente las células T residentes en la piel de biopsias de piel humana. Este protocolo proporciona un número suficiente de linfocitos residentes viables en la piel humana para el análisis de citometría de flujo y el cultivo ex vivo.

El aislamiento de linfocitos de la piel humana para el Análisis y fenotípica<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultivo Celular

La piel alberga una compleja red de células inmunitarias. Describimos una metodología eficiente para la digestión de piel de ratón, procedente de diferentes partes del cuerpo del animal, con el fin de obtener una suspensión unicelular y analizar las diferentes poblaciones de leucocitos residentes en la piel mediante citometría de flujo.

Preparación de suspensiones de una sola célula para el Análisis cytofluorimetric de diferentes regiones de piel de ratón

Describimos aquí un protocolo para aislar células mieloides de la piel del ratón y drenar el ganglio linfático después de la inyección intradérmica de esporozoítos de Plasmodium. La citometría de flujo de las células recolectadas proporciona un ensayo confiable para caracterizar la respuesta inflamatoria de la piel y los ganglios linfáticos de drenaje al parásito.

El aislamiento de las células mieloides de ratón de la piel y el drenaje de ganglios linfáticos Siguiendo intradérmica La inmunización con viva atenuada<em&gt; Plasmodium</emLos esporozoitos&gt;

Aquí describimos un protocolo detallado para el aislamiento de los linfocitos de los sitios inductivos como el tejido linfoide asociado a intestino de Peyer y los ganglios linfáticos mesentéricos drenantes y los sitios efectores incluyendo la lámina propia y la epitelio intestinal del pequeño sistema inmune intestinal.

Aislar los linfocitos desde el sistema de inmune Intestinal pequeño ratón

Este protocolo describe cómo aislar los queratinocitos de la piel de los modelos de ratón, para manchar con anticuerpos etiquetados con metal, y analizar las células manchadas por citometría de masa para perfilar el patrón de expresión de proteínas de interés en las diferentes fases del ciclo celular.

Aislamiento y tinción de queratinocitos de piel de ratón para el análisis específico del ciclo celular de la expresión de proteínacelular espora

El objetivo de este protocolo es aislar las células mononucleares que residen en la lámina propria del colon mediante la digestión enzimática del tejido utilizando la colagenasa. Este protocolo permite el aislamiento eficiente de las células mononucleares, lo que resulta en una suspensión de una sola célula que, a su vez, se puede utilizar para un inmunofenotipado robusto.

Aislamiento de células mononucleares lamina Propria de Colon Murino usando colagenasa E

Este artículo describe un método para el aislamiento basado en perlas magnéticas de células endoteliales murinas de capilares linfáticos dérmicos. Las células endoteliales linfáticas aisladas se pueden utilizar para experimentos in vitro posteriores y análisis de expresión de proteínas.

Aislamiento de células endoteliales linfáticas dérmicas murinas

Este protocolo detalla el aislamiento de poblaciones vivas inmunes y no inmunes del pulmón de ratón en un estado estacionario y después de la infección por influenza. También proporciona estrategias de activación para identificar subconjuntos de células epiteliales y mieloides.

Aislamiento de poblaciones vivas de células mieloides y epiteliales del pulmón de ratón

Aprende a aislar leucocitos infiltrantes de piel de ratón mediante digestión enzimática y separación por gradiente de densidad. Este método económico permite estudiar mecanismos celulares en dermatitis atópica.

Aislamiento de leucocitos infiltrantes de ratón Piel Usando enzimática Digest y Separación de degradado

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