Aislamiento de leucocitos infiltrantes de ratón Piel Usando enzimática Digest y Separación de degradado

El objetivo general de este procedimiento es aislar los leucocitos infiltrantes de la piel mediante la digestión enzimática y la separación en gradiente de densidad. Este método se puede aplicar a la investigación de los mecanismos celulares y moleculares en muchos modelos murinos de patologías de la piel, incluida la dermatitis atópica. Aunque este método puede proporcionar información sobre la biología de los leucocitos infiltrantes de la piel, también se puede aplicar a la investigación de otras poblaciones de células residentes.

Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades con la recolección de la piel, que incluye la eliminación completa del exceso de tejido adiposo y conectivo. La demostración visual de este método es fundamental, ya que la recolección de piel y el manejo del gradiente de densidad son difíciles de aprender y requieren precisión y práctica. En el momento apropiado después del tratamiento, use tijeras quirúrgicas de 10 centímetros para extirpar cuidadosamente un área de 25 por 25 milímetros de piel afeitada del flanco de un ratón Swiss-Webster hembra ND4 adulto de ocho a doce semanas de edad.

Use una cuchilla quirúrgica limpia y afilada para raspar el exceso de grasa y tejido conectivo de la piel, luego transfiera la piel a un tubo cónico de 50 mililitros que contenga 10 mililitros de HBSS a temperatura ambiente suplementado con EDTA, HEPES y FBS, y predigiera el tejido en una placa giratoria durante 30 minutos en un recipiente seco y sin gas. Incubadora de 37 grados centígrados. Al final de la incubación, agite el tubo vigorosamente durante diez segundos y filtre la suspensión de tejido a través de un colador de 70 micras. A continuación, use un par de pinzas para transferir las piezas de piel del flanco del colador a un nuevo tubo de 50 mililitros que contenga diez mililitros de medios HBSS frescos a temperatura ambiente, suplementados con EDTA, HEPES y FBS, luego use un par de tijeras de disección quirúrgica de 12,5 centímetros para picar cada pieza de piel del flanco de modo que la pieza promedio de tejido tenga un tamaño aproximado de 2,2 por 2,2 milímetros.

Cuando se hayan picado todas las piezas, regrese el tubo a la placa giratoria para otra incubación de 30 minutos. Agite el tubo vigorosamente durante 10 segundos al final de la incubación y filtre el contenido a través del colador de 70 micras. Recoja los trozos restantes de piel del flanco en un nuevo tubo de 50 mililitros que contenga 10 mililitros de HBSS suplementado con 0,7 miligramos por mililitro de colagenasa D, y regrese el tubo a la placa giratoria para otra incubación de 30 minutos.

Después de otros 10 segundos de vórtice, filtre el contenido del tubo nuevamente, esta vez descartando los desechos en el colador, luego llene el tubo con hasta 50 mililitros de HBSS, EDTA, HEPES, FBS, gire las células y decante el sobrenadante. Agregue tres mililitros de medio de centrifugación de gradiente de densidad del 67 por ciento a temperatura ambiente en PBS a un nuevo tubo cónico de 15 mililitros y vuelva a suspender el pellet de celda en cinco mililitros de medio de centrifugación de gradiente de densidad del 44 por ciento a temperatura ambiente en HBSS con rojo fenol. Ajustando la pipeta a la velocidad más baja, coloque la pipeta en el lateral del tubo y coloque suavemente las células sobre el medio de centrifugación con gradiente de densidad del 67 por ciento.

Al trabajar con gradientes de densidad, tenga cuidado de evitar la formación de burbujas y minimizar las interrupciones en la interfaz del degradado. A continuación, separe las células, utilizando una pipeta de transferencia de cinco mililitros para recoger las células en la interfaz al final de la centrifugación. Dado que la superposición suave del gradiente y la extracción cuidadosa de la interfaz de los gradientes son pasos críticos, es aconsejable practicar la estratificación del medio de centrifugación en gradiente de densidad y la eliminación de la interfaz con la suspensión de los esplenocitos murinos antes de intentar el procedimiento con las células experimentales de interés.

Finalmente, lavar las células recolectadas en PBS helado suplementado con FBS en un tubo cónico de 15 mililitros y contar el número de células viables por exclusión de azul de tripano. La expresión superficial de CD4 y CD8-alfa no se ve afectada por la digestión de la colagenasa D, ya que se detecta el mismo número de células CD4 positivas y CD8-alfa positivas con o sin digestión enzimática. Además, la digestión de la colagenasa D no muestra ningún efecto sobre la densidad superficial de los marcadores de activación de células T CD44 y CD62L en las células T CD4 positivas.

Después de la separación por gradiente, se aíslan alrededor de 250 células inmunitarias viables por milímetro cuadrado de tejido de flanco de ratones desafiados por oxazolona, o ratones desafiados por buey, frente a solo cuatro células inmunitarias viables por milímetro cuadrado de tejido en ratones desafiados por vehículos, previamente sensibilizados con Ox.El 95 por ciento de las células individuales de dispersión lateral y hacia adelante bajas en ratones desafiados por Ox, y el 71 por ciento de estas células en controles desafiados por vehículos son células vivas CD45 positivas. lo que equivale a un aumento de aproximadamente 67 veces en la población de células inmunitarias CD45 positivas infiltrantes en la piel del flanco después de tres desafíos diarios con Buey. De hecho, el desafío con el buey da como resultado la infiltración pronunciada de células T y neutrófilos en la piel del flanco, con el 42 por ciento de las células CD45 positivas vivas únicas en los animales tratados con Ox, neutrófilos positivos aparentes para Gr-1 y aproximadamente el 84 por ciento de células T positivas para CD3 que expresan CD8-alfa, o CD4, en comparación con los animales de control tratados con etanol. Una vez dominada, esta técnica se puede completar en unas tres horas si se realiza correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar manejar el gradiente de densidad con cuidado. No olvide utilizar siempre un medio de centrifugación de gradiente de densidad a temperatura ambiente al realizar este procedimiento. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como el análisis de citometría de flujo, la clasificación de células, la transferencia de células o el cultivo celular in vitro para evaluar el fenotipo y la función de los leucocitos infiltrantes de la piel.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar los leucocitos infiltrantes de la piel mediante la digestión enzimática y la centrifugación en gradiente de densidad.