La mejora en 2D y 3D de la piel In Vitro Uso de modelos macromoleculares hacinamiento

El objetivo general de este procedimiento es mejorar la deposición de la matriz extracelular y mejorar los modelos actuales de piel en 2D y 3D utilizando el apiñamiento macromolecular. El hacinamiento mejora la generación de matrices derivadas de células y cultivos organotípicos maduros en un marco de tiempo condensado. Este método puede responder a preguntas clave en el campo de la ingeniería de tejidos, ya que ofrece formas mejoradas de generar matrices extracelulares derivadas de células para la bioingeniería de la piel y otros tejidos.

La principal ventaja de esta técnica es que las matrices derivadas de células y las construcciones organotípicas de la piel se pueden generar en un marco de tiempo significativamente condensado cuando se aplica el aglomeramiento macromolecular a estos cultivos. La técnica de microscopía de reflexión de interferencia permite visualizar la deposición total de la matriz extracelular sin necesidad de tinción de anticuerpos. Las aplicaciones de estas técnicas se extenderán desde estudios de la deposición de matriz extracelular por células de la piel hasta terapias mejoradas para heridas, especialmente con la generación de mejores equivalentes cutáneos y el cultivo de tejidos para injertos.

Para empezar, siembre 50.000 fibroblastos primarios, queratinocitos primarios, o un cocultivo de ambos, en un mililitro de pocillo medio pro, en los pocillos de una placa de 24 pocillos. Deje que las células se adhieran en una incubadora de dióxido de carbono al 5% a 37 grados centígrados durante la noche. Luego, deseche el medio viejo y reemplácelo con un mililitro de medio fresco que contenga aglomerantes macromoleculares y ácido ascórbico 100 micromolares.

Incubar los cultivos durante seis días, cambiando el medio cada dos días. Llevar a cabo inmunofluorescencia y Western blot de acuerdo con el protocolo de texto. Para hacer y usar una matriz derivada de células, después de cultivar las células durante seis días con aglomeradores moleculares y ácido ascórbico como se acaba de demostrar, descelularice las capas celulares para obtener una matriz derivada de células usando primero 1X PBS para lavar las capas celulares dos veces.

Aspire el PBS y luego agregue 250 microlitros de desoxicolato de sodio al 0,5% e incube en hielo durante 10 minutos. Aspire el lisado celular, luego agregue 250 microlitros adicionales de desoxicolato de sodio al 0,5% y repita la incubación y aspiración de 10 minutos dos veces más. Use agua destilada para lavar la matriz derivada de células dos veces.

Aspire el agua y luego agregue 1X PBS. Guarde la matriz a cuatro grados centígrados durante un máximo de una semana. Para preparar una suspensión celular secundaria, aspire el PBS de la matriz y siembre 50.000 queratinocitos encima de la estera F, por ejemplo.

Deje que las células se adhieran durante la noche. Para llevar a cabo la microscopía de reflexión de interferencia, o RIM, en una matriz derivada de células, realice la adquisición de imágenes utilizando un microscopio confocal de acuerdo con el protocolo de texto. Para fundir un gel de colágeno con fibroblastos encapsulados en un inserto de cultivo celular, alícuota 10 mililitros de colágeno de cola de rata tipo uno en un vaso de precipitados frío.

Añadir un mililitro de DMEM frío y 0,5 mililitros de hidróxido de sodio molar para neutralizar el colágeno ácido. A continuación, añada 0,5 mililitros de suspensión de fibroblastos. Con una pipeta fría, divida uniformemente los 12 mililitros de solución en insertos de cultivo celular en una placa de cultivo de seis pocillos.

Incubar el gel a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante una hora. Una vez que el gel se haya solidificado, sumérjalo en medio fibroblasto o FM. Luego, después de incubarlo durante 24 horas, aspire el FM. Utilice cuatro mililitros de medio fresco que contenga aglomerantes macromoleculares para reemplazar el antiguo FM agregando dos mililitros al interior del inserto de cultivo celular y dos mililitros al exterior del inserto de cultivo celular. Después de una incubación de 24 horas, utilice un agente tramposo al 0,125% de tripsina para intentar sonizar los queratinocitos.

Golpee suavemente los lados del matraz para desalojar las células y agregue un medio que contenga suero para neutralizar la tripsina. Después de contar las células, prepare una suspensión de queratinocitos. A continuación, aspire el medio de los insertos de cultivo celular y agregue los queratinocitos a la parte superior del gel.

Incuba el gel durante una hora. Después de que los queratinocitos se hayan adherido a la superficie del gel, use dos mililitros de KSFM o CTN-57 medio libre de suero para sumergir la célula dentro del inserto de cultivo en gel y agregue dos mililitros de FM al exterior del inserto de cultivo celular. Después de una incubación de 24 horas, deseche el medio viejo y reemplácelo con medio fresco que contenga aglomerantes macromoleculares.

Después de siete días en el cultivo sumergido, para elevar el cultivo a una interfaz aire-líquido, transfiera el inserto de cultivo a una placa de pocillo profundo. Agregue 10 mililitros de medio de estratificación al exterior del inserto de cultivo celular, manteniendo seco el interior del inserto. Finalmente, incubar los cultivos y cambiar el medio cada tres días durante 14 días.

Coseche y procese de acuerdo con el protocolo de texto. Como se muestra aquí, el hacinamiento macromolecular permitió que los fibroblastos depositaran más matriz extracelular o MEC en comparación con los cultivos de control. Tras la secularización, se evidenció que los fibroblastos eran los principales depositarios de colágeno uno, colágeno cuatro y fibronectina.

Esta figura demuestra que fueron los fibroblastos y no los queratinocitos los principales depositantes de colágeno siete, y este es el primer informe de deposición exitosa de colágeno siete in vitro. Usando RIM, se capturó la extensión completa de la matriz derivada de la célula. Una superposición de la imagen de RIM con tinción de anticuerpos muestra la cantidad relativa de ese componente de ECM en relación con la cantidad total de ECM.

En un modelo de piel in vitro en 3D, el apiñamiento macromolecular o MMC, acortó el tiempo de cultivo de cinco semanas a tres, para obtener un cocultivo de piel organotípica madura. Como se observa aquí, mediante tinción H y E, a las tres semanas, el cultivo con MMC consistió en una epidermis pleuriestratificada y una dermis de cresta estromol. Además, se detectó una inmunitud intensa y continua con colágeno siete en la unión dermalepidérmica de cultivos celulares apiñados en comparación con una inmunotinción de colágeno siete débil y puntual en cultivos de control.

La microscopía electrónica de transmisión también muestra la presencia de fibrillas de anclaje en cultivos organotípicos generados con MMC, mostrando colágeno funcional siete. Las matrices derivadas de células podrían utilizarse con fines de siembra de células secundarias como un andamiaje alternativo, ya que se mantiene la complejidad de la matriz extracelular y es producida por las propias células. Los cultivos organotípicos de piel, que se generan bajo apiñamiento macromolecular, podrían utilizarse como un modelo de piel 3D mejorado, ya que contiene una dermis de cresta estromal, una unión dermalepidérmica principal y una epidermis pleuriestratida.

Los cultivos organotípicos, o equivalentes a la piel, generados con aglomeradores macromoleculares también se pueden utilizar para el injerto de piel porque tienen una unión dermalepidérmica mejor desarrollada, lo que probablemente mejore el éxito del injerto. Además de mejorar la deposición de la matriz extracelular, el apiñamiento macromolecular se puede aplicar a otros sistemas in vitro para mejorar las reacciones con una tasa limitada, sin tener que aumentar la cantidad de reactivos. Por ejemplo, las reacciones en cadena de la polimerasa.