Name: La mejora en 2D y 3D de la piel In Vitro Uso de modelos macromoleculares hacinamiento (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Aprende a mejorar modelos de piel 2D y 3D mediante hacinamiento macromolecular para ingeniería tisular. Este método acelera la generación de matrices celulares y culturas organotípicas maduras para aplicaciones en regeneración dérmica.

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Este trabajo fue apoyado por el Consejo de Investigación Biomédica, Singapur a través del apoyo central al Instituto de Biología Médica y la subvención SPF2013/005. M.R. fue apoyado por una beca del Comité de Investigación de la Facultad de NUS (Ingeniería en Medicina) (M.R.) R-397-000-081-112, y el Programa de Ingeniería de Tejidos de la NUS (NUSTEP). Los autores quieren agradecer a la profesora Irene Leigh por proporcionar el anticuerpo colágeno VII. El trabajo de microscopía electrónica se llevó a cabo en la Unidad de Microscopía Electrónica de la Universidad Nacional de Singapur.

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</ol>

Los autores no tienen intereses contradictorios que divulgar.

La matriz extracelular mejorada se obtiene tras la introducción de aglomeradores macromoleculares en el cultivo celular, debido al efecto de volumen excluido que aumenta la escisión de propéptidos por proteinasas. Esto da como resultado que la matriz extracelular, en particular el colágeno, se procese más rápido y se deposite en la superficie del cultivo. Mientras que otros grupos han obtenido capas gruesas de células de fibroblastos, implicó un tiempo de cultivo de varias semanas20. Por el contrario, la MMC d...

La piel forma una barrera protectora mediante la prevención de la pérdida de agua y la entrada de patógenos. Se compone de tres componentes principales; la dermis ricos del estroma 1, una epidermis estratificada 2,3,4 encima de ella, y de la unión dermo-epidérmica de entre 5,6. La dermis se componen en gran parte de colágeno y fibras elásticas y está escasamente poblada con fibroblastos 7. En contraste, la epidermis rica en células se compone de varias capas de queratinocitos. Los queratinocitos de la capa más interna son proliferativa y proporcionan nuevas células basales que se renuevan y sustituyen a los queratinocitos de diferenciación terminal que se mueven constantemente a la capa más externa de la piel y han perdido sus núcleos y el material citoplasmática, lo que resulta en una capa córnea que se somete descamación. La unión dermoepidérmica, un tipo específico de la membrana basal, es una estructura compleja compuesta de moléculas de la matriz de interconexión, que tetheRS de la epidermis a la dermis. fibras de colágeno I de la dermis se entrelazan con las fibrillas de colágeno VII que se anclan en el colágeno IV densa rica lámina de anclaje. filamentos de anclaje (5 laminina, colágeno XVII y integrinas), a su vez conectan la lámina densa con hemidesmosomas de queratinocitos basales. queratinocitos basales (estrato basale) tienen la capacidad de proliferar y renovar, así como diferenciar y estratificar para formar las capas suprabasales; estrato espinoso, estrato granuloso, y, finalmente, el estrato córneo, que representa la superficie de contacto de la piel con el medio ambiente. En ruta desde la capa basal a la capa córnea, los queratinocitos cambian los patrones de expresión de citoqueratinas y finalmente se someten a apoptosis y encierran a sí mismos en cornified sobres, cascos de proteínas específicas que se reticulan covalentemente por la actividad de transglutaminasa. La recreación de la piel y sus capas in vitro, incluyendo las estructuras complejas de la<html> unión dermo-epidérmica y dérmica de la matriz extracelular, y emular el proceso de queratinización, tiene intrigado a los científicos durante mucho tiempo y bioingenieros como una tarea difícil. Ha habido avances significativos en la ingeniería de tejidos de la piel, por ejemplo, la extracción con éxito de células de la piel a partir de biopsias de pacientes y la generación de cultivos organotípicos piel utilizando células de la piel derivados del paciente 8. Sin embargo, permanecen sin resolver los problemas relativos a la pobre secreción de proteínas de matriz extracelular por las células de la piel a sí mismos y que resulta en modelos de piel sub-óptimos. Además, el tiempo requerido para generar la piel de co-cultivo organotípicos 3D utilizando los protocolos actuales varía entre cuatro a ocho semanas, un periodo de tiempo que potencialmente podría acortarse con la incorporación de Crowders macromoleculares. La reducción de tiempo de cultivo ahorra costes de reactivos, reduce la incidencia de la senescencia celular y reduce el tiempo de espera del paciente se debe utilizar el producto en la clínica. t &quot;&gt; Macromolecular hacinamiento (MMC) implica la introducción de macromoléculas específicas para el medio de cultivo para generar efectos de volumen excluido. Estos afectan a las tasas de reacción enzimática, incluyendo la escisión proteolítica de procolágeno que llega tarde bajo condiciones de cultivo estándar acuosas 9-13. Bajo MMC, reacciones enzimáticas se aceleró sin aumentar la cantidad de reactivos 14,15 resultantes en, en el caso de la escisión de procolágeno, un aumento de la cantidad de colágeno I moléculas en cultivos de hacinamiento, en comparación con los controles con poca gente 10. como la conversión de procolágeno a colágeno permite la formación de colágeno asambleas, los fibroblastos cultivados con MMC durante 48 horas produjeron significativamente más colágeno I en comparación con los cultivos de fibroblastos con poca gente supervisados ​​por hasta cuatro semanas 11,16,17. además de los efectos sobre las actividades enzimáticas que afectan a la formación, la estabilización y la remodelación de la MEC, MMC también se ha demostrado para mejorar directamente y modular colágenola formación de fibras 18,19. Presentamos aquí un método para mejorar la producción de la matriz extracelular (ECM) por células de la piel, en particular, fibroblastos dérmicos y queratinocitos epidérmicos. Además, se muestra que la ECM enriquecido producido bajo MMC en monocapas se puede descelularizados y se utiliza como matriz derivada de células puro (CDM). Utilizamos un enfoque no convencional para visualizar y apreciar plenamente el ECM depositado por las células de piel cultivados con MMC. microscopía de interferencia de reflexión se utiliza normalmente para el estudio de las interacciones célula-matriz o puntos de contacto de célula a vidrio. Esta técnica se utilizó en nuestro sistema para ver la cantidad total de matriz depositada en la superficie de vidrio. microscopía de interferencia de reflexión se acopló con inmunotinción fluorescente para obtener la mayor cantidad de información en términos de composición de la matriz extracelular y el patrón, en presencia y ausencia de MMC. Organotypic piel co-cultivos es un método clásico para modelar la piel in vitro en un contexto tridimensional. Mientras bidimensionales co-cultivos pueden proporcionar información importante, es limitado en la traducción de estos datos y la aplicación de nuevo a un entorno in vivo, que es inherentemente una estructura tridimensional. queratinocitos de la piel, en particular, están polarizados y contienen segmentos apical y basal, que son esenciales para la homeostasis y la adhesión celular. Además, la expresión de proteínas típicas suprabasal en los queratinocitos por encima de la capa basal, tales como la queratina 1, la queratina 10 y filagrina sólo está presente en el curso de la estratificación y la diferenciación terminal de los queratinocitos. A medida que la diferenciación terminal apenas está presente en los cultivos típicos de una sola capa, la expresión de proteínas suprabasal normalmente no se logra en este sistema de cultivo. Por lo tanto, los cultivos organotípicos comienzan sumergidas en medio de cultivo, pero luego se levantan a una interfaz aire-líquido para conducir keratinocyte diferenciación. Esto resulta en la expresión de marcadores de estratificación, incluso cornificación y generalmente mejor reflexión de la fisiología epidérmica. Mientras que otros grupos han generado previamente la piel organotípicos co-cultivos con éxito, el establecimiento de una zona de unión dermo-epidérmica funcional ha sido un problema. A continuación, presentamos un nuevo método para cultivar piel organotípicos co-cultivos con una membrana basal mejorada, en un marco de tiempo condensado y sin comprometer la madurez de estas construcciones. Esto proporcionaría miméticos de la piel para el modelado in vitro, el estudio de la biología de la piel y una variedad de ensayos de cribado.

<table><tbody><tr><td>Ácido ascórbico</td><td>Wako</td><td>013-12061</td><td>Aditivo para medios de cultivo celular</td></tr><tr><td>Insertos para cultivos celulares&nbsp; (Formato de 6 pocillos)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>657610</td><td>Cultivos organotípicos</td></tr><tr><td>Solución de citrato</td><td>Dako</td><td>S2369</td><td>DakoCytomation Solución de recuperación de dianas Citrato, pH 6 (x10)</td></tr><tr><td>Colágeno (cola de rata)</td><td>Corning</td><td>354236</td><td>Cultivos organotípicos</td></tr><tr><td>CnT-57</td><td>CELLnTEC</td><td>CnT-57 Medios de</td><td>cultivo celular</td></tr><tr><td>DAB Sustrato + kit de cromógeno</td><td>Dako</td><td>K3468</td><td>Histología</td></tr><tr><td>Placa de pocillos profundos (formato de 6 pocillos)</td><td>Corning</td><td>355467</td><td>Cultivos organotípicos</td></tr><tr><td>Reactivo de detección ECL GE</td><td>Healthcare Life Sciences</td><td>RPN2106</td><td>Amersham ECL Reactivo de detección de Western Blotting</td></tr><tr><td>Microscopio electrónico (TEM)</td><td>&nbsp; JEOL&nbsp;</td><td>&nbsp; JEM-1010 (100kV)</td><td>Microscopía electrónica de transmisión</td></tr><tr><td>Medios de fibroblastos (FM)</td><td></td><td></td><td>Alta glucosa-DMEM + 10% Suero fetal bovino + 1% Penicilina Estreptomicina</td></tr><tr><td>Ficoll PM70</td><td>GE Healthcare Ciencias de la Vida</td><td>17-0310-05</td><td>Crowder macromolecular</td></tr><tr><td>Ficoll PM400</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-0300-05</td><td>Crowder macromolecular</td></tr><tr><td>Medios sin suero de queratinocitos (KSFM)</td><td>Life Technologies</td><td>17005-042 Medios de</td><td>cultivo celular</td></tr><tr><td>Tampón de lisis</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>89900</td><td>Tampón de lisis para la extracción de proteínas. A este tampón de lisis se le añadió un inhibidor de la proteasa (Roche, #11836170001).</td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Zeiss</td><td>LSM510</td><td>Canales rojo, verde y azul para visualizar inmunotinciones fluorescentes AF594, AF488 y DAPI (40X mag).</td></tr><tr><td>Medios de montaje (Hydromount)</td><td>National Diagnostics</td><td>HS-106</td><td>Tinción fluorescente</td></tr><tr><td>Medios de montaje (Cytoseal)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>8310-16</td><td>Histología (HRP)</td></tr><tr><td>Compuesto OCT (Tissue Tek)</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td>Inclusión para criotomía</td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina antibióticos</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5955</td><td>Aditivo para medios de cultivo celular</td></tr><tr><td colspan="4"><Anticuerpos primarios fuertes> </anticuerpo >anticolágeno</td></tr> <tr><td>I</td><td>fuerte Abcam</td><td>#ab6308</td><td></td></tr><tr><td>Anticolágeno tipo IV</td><td>Novocastra</td><td>#NCL-COLL-IV</td><td></td></tr><tr><td>Anticolágeno VII</td><td></td><td></td><td>LH7.2 (en casa)&nbsp;</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-fibronectina</td><td>Abcam</td><td>#ab2413</td><td></td></tr><tr><td>Agente reductor&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NP0009</td> Western <td>blot</td></tr><tr><td>Tampón de muestra</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NP0008</td><td>Western blot</td></tr><tr><td colspan="4">Anticuerpos secundarios (inmunotinción)</td></tr><tr><td>4&prime;,6-Diamidino-2-fenilindol diclorhidrato (DAPI)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#D9542</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 594 cabra anti-conejo</td><td>ThermoFisher Científico</td><td>#A-11037&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 594 cabra anti-ratón</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>&nbsp;#A-11005</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 488 pollo-anti-conejo</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#A-21441</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 488 cabra-anti-ratón</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#A-11001</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpos secundarios (HRP)</td><td>Dako</td><td>Envision + System - Polímero marcado con HRP Anti-Conejo y Anti-Ratón</td><td></td></tr><tr><td>desoxicolato de sodio</td> sin diluir <td>Prodotti Chimicie Alimentari</td><td></td><td>Descelularización</td></tr><tr><td colspan="4"><fuerte>Medios de estratificación</fuerte></td></tr><tr><td>Medio de águila modificado de Dulbecco&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Se utiliza durante la interfase aire-líquido de cultivos organotípicos. Este medio se añade al exterior del inserto de cultivo celular.</td></tr><tr><td>Jamón' s F12&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td></td><td></td><td>Se utiliza durante la interfase aire-líquido de cultivos organotípicos. Este medio se añade al exterior del inserto de cultivo celular.</td></tr><tr><td>10% suero fetal bovino&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Se utiliza durante la interfase aire-líquido de cultivos organotípicos. Este medio se añade al exterior del inserto de cultivo celular.</td></tr><tr><td>100 U/ml de penicilina y 100 U/ml de estreptomicina</td><td></td><td></td><td>Se utilizan durante la interfase aire-líquido de cultivos organotípicos. Este medio se añade al exterior del inserto de cultivo celular.</td></tr><tr><td>0,4 mg/ml hidrocortisona</td><td></td><td></td><td>Se utiliza durante la interfase aire-líquido de los cultivos organotípicos. Este medio se añade al exterior del inserto de cultivo celular.</td></tr><tr><td>5 mg/ml de insulina</td><td></td><td></td><td>Se utiliza durante la interfase aire-líquido de los cultivos organotípicos. Este medio se añade al exterior del inserto de cultivo celular.</td></tr><tr><td>1.8 y punto medio; 10-4 M adenina&nbsp; &nbsp;</td><td></td><td></td><td>Se utiliza durante la interfase aire-líquido de cultivos organotípicos. Este medio se añade al exterior del inserto de cultivo celular.</td></tr><tr><td>5 mg/ml de transferrina</td><td></td><td></td><td>Se utiliza durante la interfase aire-líquido de los cultivos organotípicos. Este medio se añade al exterior del inserto de cultivo celular.</td></tr><tr><td>2 y punto medio; 10- 11 M triyodotironina &nbsp;</td><td></td><td></td><td>Se utiliza durante la interfase aire-líquido de cultivos organotípicos. Este medio se añade al exterior del inserto de cultivo celular.</td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Biopolis Instalaciones Compartidas</td><td>0.125% Tripsina/Verne&nbsp; &nbsp; pH 7.0 + 0.3&nbsp;</td><td>Se utiliza para tripsinizar células</td></tr></tbody></table>

la mejora en 2d y 3d de la piel<em&gt; in vitro</em&gt; uso de modelos macromoleculares hacinamiento

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

La familia de glicoproteínas de colágenos representa las principales proteínas estructurales en el cuerpo humano, y son componentes clave de los biomateriales utilizados en la ingeniería de tejidos moderna. Un cuello de botella técnico es la deposición de colágeno in vitro, ya que es notoriamente lentos, lo que resulta en la formación de sub-óptima de tejido conectivo y la cohesión del tejido posterior, particularmente en modelos de piel. A continuación, describimos un método que implica la adición de co-polímeros de sacarosa diferencialmente de tamaño a cultivos de piel para generar macromolecular hacinamiento (MMC), que se traduce en una mejora dramática de la deposición de colágeno. En particular, los fibroblastos dérmicos depositan una cantidad significativa de colágeno I / IV / VII y fibronectina bajo MMC en comparación con los controles. El protocolo también describe un método para decellularize capas de células de hacinamiento, la exposición de cantidades significativas de la matriz extracelular (ECM) que se conservaron en la superficie de cultivo como se evidencia por immunocytochemistry. patrón de masa total y la distribución de la matriz se estudió mediante microscopía de interferencia de reflexión. Curiosamente matrices, fibroblastos, queratinocitos y los co-cultivos producidos derivados de células (MDL) de diferente composición y morfología. MDL podría utilizarse como &quot;bio-andamios&quot; para la siembra celular secundaria, donde el uso actual de los revestimientos o andamios, por lo general de fuentes animales xenogénicas, se puede evitar, trasladando así a las aplicaciones más clínicamente relevante. Además, este protocolo describe la aplicación de MMC durante la fase sumergida de un modelo 3D-organotípicos piel de co-cultivo, que era suficiente para aumentar la deposición de ECM en la unión dermo-epidérmica (DEJ), en particular, el colágeno VII, el componente principal de fibrillas de anclaje. La microscopía electrónica confirmó la presencia de fibrillas de anclaje en cultivos desarrollados con MMC, en comparación con los controles. Esto es significativo ya que las fibrillas de anclaje atar el dermis a la epidermis, por lo tanto,que tiene un pre-formada madura DEJ puede beneficiar a los receptores de injertos de piel en cuanto a la estabilidad del injerto y la curación de heridas en general. Además, el tiempo de cultivo se condensa a partir de 5 semanas a 3 semanas para obtener una construcción madura, al utilizar MMC, reduciendo los costos.

Aglomeración macromolecular fue capaz de mejorar la deposición de ECM, en particular, los fibroblastos depositan más colágeno I, IV y fibronectina en comparación con los cultivos control (figura 1, la capa de células; 1A, colágeno I; 1B, colágeno IV; 1C, fibronectina). Tras la descelularización, era evidente que los fibroblastos fueron los principales depositantes de colágeno I, IV y fibronectina en comparación con los q...

Se presenta un protocolo para obtener matrices derivadas de células ricas en proteínas de la matriz extracelular, utilizando Crowders macromoleculares (MMC). Además, se presenta un protocolo que incorpora MMC en 3D generación de la piel de co-cultivo organotípicos, lo que reduce el tiempo de cultivo, manteniendo la madurez del constructo.

La mejora en 2D y 3D de la piel<em&gt; In Vitro</em&gt; Uso de modelos macromoleculares hacinamiento

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern ...

El objetivo general de este procedimiento es potenciar la deposición de la matriz extracelular y mejorar los modelos cutáneos 2D y 3D actuales mediante el uso de concentración macromolecular. La concentración macromolecular mejora la generación de matrices derivadas de células y cultivos organotípicos maduros en un período de tiempo reducido. Este método puede responder preguntas clave en el campo de la ingeniería de tejidos, ya que ofrece formas mejoradas de generar matrices extracelulares derivadas de células para la bioingeniería de la piel y otros tejidos.La principal ventaja de esta técnica es que las matrices derivadas de células y los constructos cutáneos organotípicos pueden generarse en un período de tiempo significativamente más corto al aplicar el enriquecimiento macromolecular a estos cultivos. La técnica de microscopía de reflexión por interferencia permite visualizar la deposición total de matriz extracelular sin necesidad de tinción con anticuerpos. Las aplicaciones de estas técnicas se extenderán desde estudios sobre la deposición de matriz extracelular por células cutáneas hasta terapias mejoradas para heridas, especialmente con la generación de equivalentes cutáne

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Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Este protocolo describe el uso de aglomeración macromolecular para crear un modelo de tejido cicatricial humano in vitro que se asemeja a condiciones in vivo. Cuando se cultivan en un ambiente macromolecular lleno de gente, los fibroblastos de la piel humana exhiben fenotipos, bioquímica, fisiología y características funcionales que se asemejan al tejido cicatricial.

Modelo In Vitro de Cicatrices Hipertróficas Cutáneas Humanas usando Crowding Macromolecular

Este protocolo describe un método sencillo para cultivar epidermis humana reconstituida tridimensional de una manera reproducible y robusta. Además, caracteriza la relación estructura-función del modelo de barrera epidérmica. Las respuestas biológicas de la epidermis humana reconstituida sobre estímulos proinflammatory también se presentan.

El cultivo de una epidermis humana reconstruida tridimensional a gran escala

La meta de este protocolo es describir la generación y el análisis volumétrico de los equivalentes humanos vascularizados de la piel usando las técnicas accesibles y simples para la cultura a largo plazo. En la medida de lo posible, se describe la justificación de los pasos para permitir a los investigadores la capacidad de personalizar en función de sus necesidades de investigación.

Generación de equivalentes de piel humana vascularizada autoensamblada

Aquí, presentamos un protocolo para generar un modelo tridimensional de piel simplificado e indiferenciado utilizando una plataforma microfluídica micromecanizado. Un enfoque de flujo paralelo permite la deposición in situ de un compartimento dérmico para la siembra de células epiteliales en la parte superior, todo controlado por bombas de jeringa.

Generación de un modelo tridimensional simplificado de piel en un chip en una plataforma microfluídica micromecanizado

Aquí, presentamos procedimientos económicos y simples para introducir varios modelos de piel en 3D para la investigación de rutina en un laboratorio de cultivo celular. Los investigadores pueden crear modelos adaptados a sus necesidades sin depender de modelos disponibles en el mercado.

Creación de modelos de piel para numerosas aplicaciones, desde el monocultivo bidimensional (2D) hasta el multicultivo tridimensional (3D)

Visualización de las muestras de proteínas por microscopía de electrones negativos mancha (EM) se ha convertido en un popular método de análisis estructural. Es útil para el análisis estructural cuantitativo, como el cálculo de una reconstrucción en 3D de las moléculas en estudio, y también para el examen cualitativo de la calidad de los preparados de proteínas. En este artículo se presentan los protocolos de detalle para la preparación de las redes de EM, la tinción de la muestra y la...

Visualización de las proteínas y complejos macromoleculares de Negative EM Mancha: desde la preparación de la cuadrícula para adquisición de imágenes

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Acuosos sistemas de dos fases se utiliza para poblaciones modelo simultáneamente múltiples de células. Este método rápido y fácil para el patrón celular se aprovecha de la separación de fases de las soluciones acuosas de glicol de polietileno y dextrano y la tensión interfacial que existe entre las dos soluciones de polímero.

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Microrheology de partículas de seguimiento se puede utilizar para cuantificar de forma no destructiva y espacialmente mapa cambios en las propiedades mecánicas de la matriz extracelular en modelos de tumores en 3D.

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Hemos desarrollado un ensayo de irritación ocular que utiliza un modelo de tejido tridimensional epitelial-córnea como humana reconstruida (RHCE). La prueba es capaz de discriminar entre irritante ocular y materiales corrosivos (SGA Categorías 1 y 2 combinados) y aquellos que no requieren etiquetado (GHS No Categoría).

Irritación de los ojos de prueba (IET) para la identificación del peligro de los ojos: Irrita los productos químicos que utilizan Reconstruido humana Córnea-como epitelial (RHCE) Modelo de Tejidos

Aprende a mejorar modelos de piel 2D y 3D mediante hacinamiento macromolecular para ingeniería tisular. Este método acelera la generación de matrices celulares y culturas organotípicas maduras para aplicaciones en regeneración dérmica.

La mejora en 2D y 3D de la piel

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