Flow-patrón Fabricación guiada de alta densidad de códigos de barras de anticuerpos microarrays

El objetivo general de esta metodología es fabricar una matriz de anticuerpos con aplicaciones en el análisis de células individuales. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del análisis de células individuales, como por ejemplo, cómo podemos detectar proteínas secretas y proteínas intracelulares simultáneamente a partir de la misma célula. ¿Y cómo podemos fabricar una plataforma de micro-arrays para lograr ese objetivo?

La principal ventaja de esta técnica es que es personalizable. Al variar las estrategias de patrones de flujo, se pueden crear matrices de varias dimensiones. De antemano, genere el maestro SU-8 para los patrones de flujo del código de barras.

Las instrucciones se proporcionan en el protocolo de texto. Esto implica diseñar y hacer una foto-máscara cromada. La colocación de la mascarilla sobre una capa fotorresistente y la aplicación de rayos UV proporcionan el patrón.

Para comenzar a preparar el molde de código de barras PDMS, combine 40 gramos de base de elastómero de silicona con cuatro gramos de agente de curado, luego revuelva vigorosamente durante 10 minutos. A continuación, desgasifique la solución de prepolímero durante 20 minutos al vacío. A continuación, cargue la solución en una placa de Petri que contenga una oblea de silicio con el SU-8 maestro del patrón de código de barras.

Vierta la solución a una profundidad de 7,45 milímetros. Luego, desgasifique la mezcla en el plato para eliminar las burbujas restantes. Siga la desgasificación horneando la mezcla durante una hora a 75 grados centígrados para curar el PDMS.

A continuación, cortando con un bisturí, retire con cuidado el molde del código de barras. Luego, pela con cuidado la losa de la oblea. A continuación, recorta los bordes de la losa para darle la forma deseada al molde.

Termine el molde usando un punzón de biopsia con émbolo para perforar agujeros de medio milímetro en las características circulares del patrón que representan entradas y salidas. Después de soplar el polvo de un portaobjetos de vidrio recubierto de poli-L-lisina con una pistola de nitrógeno, fije el molde de PDMS al portaobjetos. Alinea cuidadosamente los bordes del molde con el portaobjetos.

Ahora, hornee el conjunto durante 90 minutos a 75 grados centígrados para fortalecer la unión entre el PDMS y la corredera. Mientras tanto, prepare 20 piezas de tubería de polietileno flexible para las entradas y salidas. En cada pieza de tubo, coloque un pasador hueco de acero inoxidable de un milímetro de diámetro.

Luego, a través de los alfileres, llene las longitudes con un centímetro o más de poli-L-lisina. Una vez adheridos al vidrio, fije con cuidado los pasadores a las entradas del molde. Este es el paso más difícil de la preparación.

No apresures el proceso. Conecte el otro extremo de los tubos a una configuración de tanque de nitrógeno regulada por presión que consta de una red de 20 válvulas de tres vías y puede manejar dos moldes a la vez. Usando la configuración, sople la solución a través del molde a 0.5 a un PSI durante al menos seis horas.

Comience aspirando soluciones de ADN monocatenario recién preparadas en BS-3 a través de las clavijas de acero inoxidable y en el tubo de polietileno. Luego, acople el molde de PDMS a la fuente de nitrógeno y haga fluir la solución a través del molde de código de barras durante unos 40 minutos o hasta que se llenen todos los canales. Luego, detenga el flujo y deje que el molde se incube a temperatura ambiente durante dos horas.

Después de un par de horas, hornee el molde de código de barras a 75 grados centígrados durante una hora. Una vez horneado, separe el molde del portaobjetos y lave suavemente el portaobjetos con 01%SDS. A continuación, lave el portaobjetos tres veces con agua ultrapura.

A continuación, seca el portaobjetos del código de barras con un deslizador giratorio. Una vez seco, guarde el portaobjetos de código de barras en un tubo limpio de 50 mililitros. Para continuar, siga el protocolo de texto para validar el patrón unidimensional.

Para realizar el procedimiento de validación, bloquee el portaobjetos, hibride la cianina como tres ADN complementario a él y mida los resultados. El maestro SU-8 para una matriz de tres por tres tiene un patrón de flujo perpendicular al del primer diseño. Utilice el método descrito anteriormente para hacer un nuevo molde PDMS de este patrón.

Para empezar, haga nuevas concentraciones de trabajo de los nueve oligonucleótidos. Ahora, fluya una solución de bloqueo de BSA del tres por ciento en los 20 canales del portaobjetos del arreglo durante una hora a 0,5 a un PSI. A continuación, cargue las soluciones de ADN en sus respectivos canales.

Después de fluirlos durante unos 40 minutos, incuba el portaobjetos a temperatura ambiente durante dos horas para permitir que el ADN se hibride. A continuación, fluya una solución de bloqueo BSA al tres por ciento en los 20 canales durante una hora. Esto eliminará el ADN no hibridado.

Ahora, retire la diapositiva de la matriz del PDMS y sumerja la diapositiva en un tres por ciento de BSA una vez. Luego, sumerja la diapositiva en PBS dos veces, seguidas de una inmersión en el dos por ciento de PBS. Luego, como antes, seque el portaobjetos con un girador de portaobjetos de microscopio.

Para continuar, realice un paso de validación similar a la validación de diapositivas unidimensionales. Utilice oligonucleótidos de uno primo a nueve primos, todos conjugados con cianina tres. Guarde el portaobjetos de matriz de tres por tres en un tubo de centrífuga de 50 mililitros para su uso posterior.

El protocolo de texto explica con más detalle cómo convertir la matriz de ADN en una matriz de anticuerpos. Después de preparar y purificar los conjugados anticuerpo-oligonucleótido, prepare otro molde de PDMS con microcámaras. Consulte el texto para obtener más detalles.

Acople este molde con la corredera de matriz. Ahora, bloquee el portaobjetos con un uno por ciento de BSA e incube durante una hora a temperatura ambiente. Durante la incubación, prepare 200 microlitros de conjugados anticuerpo-oligonucleótido.

Después del bloqueo, agregue el cóctel de anticuerpos y oligonucleótidos a la configuración. Deje que los anticuerpos se incuben en la matriz durante una hora a 37 grados centígrados, y luego limpie y seque el portaobjetos antes de continuar con los sumidos de portaobjetos descritos en el protocolo de texto. Después de seguir el protocolo descrito, utilizando un array de tres por tres, el panel de anticuerpos resultante se utilizó en la detección multiplex, principalmente a través de la plataforma ELISA sándwich.

Las proteínas mostraron menos del 10% de variación de un extremo al otro extremo del portaobjetos de vidrio. En la matriz de tres por tres, se pueden detectar hasta siete proteínas junto con una referencia marcada por tres cianina y un control negativo. En un experimento unicelular realizado para un estudio tumoral, las seis proteínas se detectaron simultáneamente.

Para la calibración, se aplicaron proteínas recombinantes a una matriz en varias concentraciones. La sensibilidad de detección fue bastante similar a la de un ELISA sándwich convencional. Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener los moldes de PDMS libres de partículas.

El polvo en los canales puede dar lugar a matrices con poca uniformidad y baja sensibilidad. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la investigación del cáncer exploraran la señalización célula-célula utilizando modelos de microambientes tumorales.