Name: Flow-patrón Fabricación guiada de alta densidad de códigos de barras de anticuerpos microarrays (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-06T15:00:01.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: Aprende a fabricar microarrays de anticuerpos de alta densidad mediante patrones de flujo para análisis de células individuales. Este método permite detectar proteínas secretadas e intracelulares simultáneamente.

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Los autores desean agradecer el fondo inicial de SUNY Albany y el acceso a las instalaciones del Centro de Investigación del Cáncer de la Universidad de Albany.

<ol><li>Alhamdani, M. S. S., Schroder, C., Hoheisel, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncoproteomic+profiling+with+antibody+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Med%22%5BJournal%5D)">Oncoproteomic profiling with antibody microarrays.</a> Genome Med. 1 (7), (2009).</li>
<li>Angenendt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+protein+and+antibody+microarray+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today%22%5BJournal%5D)">Progress in protein and antibody microarray technology.</a> Drug Discov Today. 10 (7), 503-511 (2005).</li>
<li>Sun, H. Y., Chen, G. Y. J., Yao, S. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+microarray+technologies+for+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Recent advances in microarray technologies for proteomics.</a> Chem Biol. 20 (5), 685-699 (2013).</li>
<li>Fan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+barcode+chips+for+rapid%2C+multiplexed+analysis+of+proteins+in+microliter+quantities+of+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Integrated barcode chips for rapid, multiplexed analysis of proteins in microliter quantities of blood.</a> Nat Biotechnol. 26 (12), 1373-1378 (2008).</li>
<li>Chattopadhyay, P. K., Gierahn, T. M., Roederer, M., Love, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+technologies+for+monitoring+immune+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Single-cell technologies for monitoring immune systems.</a> Nat Immunol. 15 (2), 128-135 (2014).</li>
<li>Varadarajan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+efficient+functional+characterization+and+recovery+of+HIV-specific+human+CD8%28%2B%29+T+cells+using+microengraving%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Rapid, efficient functional characterization and recovery of HIV-specific human CD8(+) T cells using microengraving.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109 (10), 3885-3890 (2012).</li>
<li>Ma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation-based+delivery+of+cell-penetrating+peptide+conjugates+of+peptide+nucleic+acids+for+antisense+inhibition+of+intracellular+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Integr+Biol-Uk%22%5BJournal%5D)">Electroporation-based delivery of cell-penetrating peptide conjugates of peptide nucleic acids for antisense inhibition of intracellular bacteria.</a> Integr Biol-Uk. 6 (10), 973-978 (2014).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitating+cell-cell+interaction+functions+with+applications+to+glioblastoma+multiforme+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Quantitating cell-cell interaction functions with applications to glioblastoma multiforme cancer cells.</a> Nano Lett. 12 (12), 6101-6106 (2012).</li>
<li>Kravchenko-Balasha, N., Wang, J., Remacle, F., Levine, R. D., Heath, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioblastoma+cellular+architectures+are+predicted+through+the+characterization+of+two-cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Glioblastoma cellular architectures are predicted through the characterization of two-cell interactions.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 111 (17), 6521-6526 (2014).</li>
<li>Xue, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+methods+for+the+simultaneous+quantitation+of+metabolites+and+proteins+from+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Chemical methods for the simultaneous quantitation of metabolites and proteins from single cells.</a> J Am Chem Soc. 137 (12), 4066-4069 (2015).</li>
<li>Shi, Q. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+proteomic+chip+for+profiling+intracellular+signaling+pathways+in+single+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Single-cell proteomic chip for profiling intracellular signaling pathways in single tumor cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109 (2), 419-424 (2012).</li>
<li>Ma, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clinical+microchip+for+evaluation+of+single+immune+cells+reveals+high+functional+heterogeneity+in+phenotypically+similar+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">A clinical microchip for evaluation of single immune cells reveals high functional heterogeneity in phenotypically similar T cells.</a> Nat Med. 17 (6), 738-743 (2011).</li>
<li>Deng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+microfluidic+chip+system+for+single-cell+secretion+profiling+of+rare+circulating+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">An integrated microfluidic chip system for single-cell secretion profiling of rare circulating tumor cells.</a> Sci Rep. 4, 7499(2014).</li>
<li>Vermesh, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-density%2C+multiplexed+patterning+of+cells+at+single-cell+resolution+for+tissue+engineering+and+other+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed%22%5BJournal%5D)">High-density, multiplexed patterning of cells at single-cell resolution for tissue engineering and other applications.</a> Angew Chem Int Ed. 50 (32), 7378-7380 (2011).</li>
<li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics-based+single-cell+functional+proteomics+for+fundamental+and+applied+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Microfluidics-based single-cell functional proteomics for fundamental and applied biomedical applications.</a> Annu Rev Anal Chem. 7, 275-295 (2014).</li>
<li>Bailey, R. C., Kwong, G. A., Radu, C. G., Witte, O. N., Heath, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-encoded+antibody+libraries%3A+A+unified+platform+for+multiplexed+cell+sorting+and+detection+of+genes+and+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">DNA-encoded antibody libraries: A unified platform for multiplexed cell sorting and detection of genes and proteins.</a> J Am Chem Soc. 129, 1959-1967 (2007).</li>
<li>Alegria-Schaffer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+protein-protein+cross-linking%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">General protein-protein cross-linking.</a> Methods Enzymol. 539, 81-87 (2014).</li>
<li>Ahmad, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robotics+platform+for+automated+batch+fabrication+of+high+density%2C+microfluidics-based+DNA+microarrays%2C+with+applications+to+single+cell%2C+multiplex+assays+of+secreted+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Sci+Instrum%22%5BJournal%5D)">A robotics platform for automated batch fabrication of high density, microfluidics-based DNA microarrays, with applications to single cell, multiplex assays of secreted proteins.</a> Rev Sci Instrum. 82, 094301(2011).</li>
</ol>

Los autores no tienen intereses contrapuestos que divulgar.

Diseño del patrón de flujo es el primer paso crítico en la fabricación de los microarrays 2-D. Para generar dos patrones de ADN superpuestas sobre un sustrato de vidrio, las características de canal del primer diseño deben ser perpendiculares a las de la segunda (Figura 1A-B). Los diseños también consideran que las aplicaciones posteriores de los microarrays. En el caso del análisis de una sola célula, el microarray se utiliza para detectar proteínas a partir de células individuales encerradas ...

Microarrays de anticuerpos han sido ampliamente utilizados en estudios proteómicos durante décadas para examinar la presencia de proteínas específicas, incluyendo biomarcadores proteicos 1-3. Aunque este campo se enfrenta actualmente a grandes retos de otras tecnologías de alto rendimiento, tales como la espectrometría de masas (MS), todavía hay mucho espacio para la utilidad de los microarrays de anticuerpos, principalmente debido a que estos dispositivos ofrecen la interpretación de datos simple y fácil interfaz con otros ensayos. En los últimos años, la integración de los microarrays en andamios microchip ha proporcionado el microarray anticuerpo una nueva oportunidad para prosperar 4-7. Por ejemplo, el microarray de código de barras integrado en un microchip de una sola célula se ha utilizado en estudios de comunicación celular 8,9. Esta tecnología tiene ventajas distintivas con respecto a otras tecnologías de microarrays disponibles. Cuenta con elementos de la matriz de 10-100 micras a, mucho menor que el 150 micras tamaño típico utilizado en elemen microarrays convencionalests. La construcción de elementos de la matriz más pequeños se consigue utilizando enfoques sistemáticos de flujo de modelado, y esto da lugar a microarrays compactos que pueden detectar las proteínas de una sola célula secretadas y proteínas intracelulares. Otra ventaja es el uso de una configuración simple,-instrumento libre. Esto es particularmente importante, ya que la mayoría de los laboratorios y las pequeñas empresas pueden no ser capaces de acceder a las instalaciones centrales de microarrays. Tal código de barras microarrays de anticuerpos de funciones mejorado rendimiento del ensayo y se pueden usar para realizar ensayos altamente multiplexados en células individuales mientras que el logro de alta sensibilidad y especificidad comparable con la de ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas sándwich convencional (ELISA 8). Esta tecnología ha encontrado numerosas aplicaciones en la detección de proteínas de glioblastoma 9-11, células T 12, y células tumorales circulantes 13. Alternativamente, microarrays de ADN de código de barras solo se han utilizado en el posicionamiento preciso de neuronas y astrocitos para mimicking la asamblea en vivo de tejido cerebral 14. Este protocolo se centra sólo en las etapas experimentales y bloquea la acumulación de las dos dimensiones (2-D) de código de barras de microarrays de anticuerpos que tiene aplicaciones potenciales en la detección de biomarcadores en muestras de fluidos y en células individuales. La tecnología se basa en una direccionable de una sola hebra, unidimensional (1-D) de microarrays de ADN construidos utilizando oligonucleótidos ortogonales que se modelan espacialmente sobre sustratos de vidrio. El patrón 1-D se forma cuando se utilizan canales de flujo paralelos en el paso de flujo patrón, y tal patrón aparece como bandas discretas visualmente similares a 1-D Código Universal de Producto (UPC) los códigos de barras. La construcción de un 2-D (n x m) matriz de anticuerpos - una reminiscencia de un código de la matriz 2-D de respuesta rápida (QR) - necesita estrategias de modelado más complejas, pero permite la inmovilización de anticuerpos a una densidad mayor 8,15. La fabricaciónrequiere dos pasos de modelado de ADN, con el primer patrón perpendiculares a la segunda. Los puntos de intersección de estos dos patrones constituyen los elementos de m x n de la matriz. Al seleccionar estratégicamente las secuencias de ADN de cadena sencilla (ssDNA) utilizado en flow-patrón, cada elemento de una matriz dada es asignada una dirección específica. Es necesario Esta referencia espacial para distinguir entre las señales de fluorescencia en la diapositiva de microarrays. La matriz de ssDNA se convierte en una matriz de anticuerpos a través de la incorporación de los conjugados anticuerpo-ADN complementarios, formando una plataforma llamada ADN codificado biblioteca de anticuerpos (DEAL 16). Este protocolo de vídeo se describen los pasos clave en la creación de matrices nxm anticuerpos que incluyen la preparación de polidimetilsiloxano (PDMS) moldes de código de barras, flujo-patrón ssDNA en dos orientaciones, la preparación de los conjugados anticuerpo-DEAL oligonucleótidos, y la conversión de la matriz de ADN 3 x 3 en un 3x 3 matriz de anticuerpos.

<table><tbody><tr><td>Sylgard 184 base de elastómero de silicona</td><td>Dow Corning</td><td>3097366-1004</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 agente de curado de elastómero de silicona</td><td>Dow Corning</td><td>3097358-1004</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2025 fotorresistente</td><td>MicroChem</td><td>Y111069</td><td></td></tr><tr><td>Obleas de silicona&nbsp;</td><td>University Wafers</td><td>452</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de vidrio recubiertos de poli-L-lisina</td><td>Thermo Scientific</td><td>C40-5257-M20</td><td></td></tr><tr><td>Oligonucleótidos</td><td>Tecnologías de ADN integradas</td><td></td><td>*Pedido a medida de Integrated DNA Technologies, consulte Tabla 2.</td></tr><tr><td>Solución madre adhesiva de poli-L-lisina</td><td>Newcomer Supply</td><td>1339</td><td></td></tr><tr><td>Bis (sulfosuccinimidyl) suberate&nbsp; (BS3)</td><td>Thermo Scientific</td><td>21585</td><td></td></tr><tr><td>1x solución salina tamponada con fosfato, pH 7,4</td><td>Calidad biológica</td><td>114-058-101</td><td></td></tr><tr><td>&Auml; kta Explorer 100 Sistema de cromatografía líquida rápida de proteínas (FPLC)</td><td>GE (Amersham Pharmacia)&nbsp;</td><td>18-1112-41</td><td></td></tr><tr><td>Columna Superose 6 10/300 GL</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-5172-01</td><td></td></tr><tr><td>Captura de anticuerpos</td><td>varios</td><td></td><td>*La selección de anticuerpos depende de la aplicación</td></tr><tr><td>Succinimidil-6-hidrazino-nicotinamida (S-HyNic)</td><td>Solulink</td><td>S-1002</td><td></td></tr><tr><td>Succinimidil-4-formilbenzamida (S-4FB)</td><td>Solulink</td><td>S-1004</td><td></td></tr><tr><td>N,N-dimetilformamida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>227056</td><td></td></tr><tr><td>Ácido cítrico anhidro</td><td>Acros</td><td>42356</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra filtro de centrifugación 10 kDa MWCO</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC201024</td><td></td></tr><tr><td>Barnizadora</td><td>Laurell Technologies</td><td>WS-650-MZ</td><td></td></tr><tr><td>Punzón de biopsia con émbolo (1,0 mm de diámetro)</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>15110-10</td><td></td></tr><tr><td>Escriba de diamante (Estilo 60)</td><td>SPI suministra</td><td>6004</td><td></td></tr><tr><td>Trimetilclorosilano</td><td>Sigma Aldrich</td><td>92361</td><td></td></tr></tbody></table>

flow-patrón fabricación guiada de alta densidad de códigos de barras de anticuerpos microarrays

Flow-pattern Guided Fabrication of High-density Barcode Antibody Microarray

El microarray de anticuerpos, como tecnología bien desarrollada, se enfrenta actualmente al desafío de algunas otras tecnologías de alto rendimiento establecidas o emergentes. En este informe, renovamos la tecnología de microarrays de anticuerpos mediante el uso de un enfoque novedoso para la fabricación y la introducción de nuevas características. La fabricación de nuestro microarray de anticuerpos de alta densidad se logra a través de un patrón de flujo orientado perpendicularmente de ADN monocatenario y la posterior conversión mediada por conjugados ADN-anticuerpo. Este protocolo describe los pasos críticos en el patrón de flujo del ADN, la producción y purificación de conjugados ADN-anticuerpo y la evaluación de la calidad del microarray fabricado. La uniformidad y la sensibilidad son comparables con los microarrays convencionales, mientras que nuestra fabricación de microarrays no requiere la ayuda de una impresora de arrays y se puede realizar en la mayoría de los laboratorios de investigación. La otra gran ventaja es que el tamaño de nuestras unidades de microarrays es 10 veces más pequeño que el de las matrices impresas, lo que ofrece la capacidad única de analizar proteínas funcionales de células individuales cuando se interactúan con diseños de microchips genéricos. Esta tecnología de código de barras se puede emplear ampliamente en la detección de biomarcadores, estudios de señalización celular, ingeniería de tejidos y una variedad de aplicaciones clínicas.

Los diseños de los moldes de PDMS (Figura 1A-1B) se extrajeron utilizando un programa CAD (AutoCAD). Dos diseños que se muestran los canales de función para el patrón de flujo, uno horizontal y otro vertical. Las partes izquierda y derecha de cada diseño son simétricos; cualquiera de ellos podría ser entradas o salidas. Cada uno de 20 canales es sinuoso de un extremo todo el camino hasta el otro extremo. Cada diseño se imprime en una fotomáscara cromo (Figura 1C)...

Este protocolo describe la fabricación de una gran escala, multiplexado de ADN o anticuerpo matriz de dos dimensiones, con aplicaciones potenciales en los estudios de la señalización celular y la detección de biomarcadores.

Flow-patrón Fabricación guiada de alta densidad de códigos de barras de anticuerpos microarrays

Antibody microarray as a well-developed technology is currently challenged by a few other established or emerging high-throughput technologies. In this ...

El objetivo general de esta metodología es fabricar una matriz de anticuerpos con aplicaciones en el análisis de células individuales. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del análisis de células individuales, como por ejemplo, cómo podemos detectar proteínas secretas y proteínas intracelulares simultáneamente a partir de la misma célula. ¿Y cómo podemos fabricar una plataforma de micro-arrays para lograr ese objetivo?La principal ventaja de esta técnica es que es personalizable. Al variar las estrategias de patrones de flujo, se pueden crear matrices de varias dimensiones. De antemano, genere el maestro SU-8 para los patrones de flujo del código de barras.Las instrucciones se proporcionan en el protocolo de texto. Esto implica diseñar y hacer una foto-máscara cromada. La colocación de la mascarilla sobre una capa fotorresistente y la aplicación de rayos UV proporcionan el patrón.Para comenzar a preparar el molde de código de barras PDMS, combine 40 gramos de base de elastómero de silicona con cuatro gramos de agente de curado, luego revuelva vigorosamente durante 10 minutos. A continuación, desgasifique la solución de prepolímero durante 20 minutos al vacío. A continuación, cargue la solución en una placa de Petri que contenga una oblea de silicio con el SU-8 maestro del patrón de código de barras.Vierta la solución a una profundidad de 7,45 milímetros. Luego, desgasifique la mezcla en el plato para eliminar las burbujas restantes. Siga la desgasificación horneando la mezcla durante una hora a 75 grados centígrados para curar el PDMS.A continuación, cortando con un bisturí, retire con cuidado el molde del código de barras. Luego, pela con cuidado la losa de la oblea. A continuación, recorta los bordes de la losa para darle la forma deseada al molde.Termine el molde usando un punzón de biopsia con émbolo para perforar agujeros de medio milímetro en las características circulares del patrón que representan entradas y salidas. Después de soplar el polvo de un portaobjetos de vidrio recubierto de poli-L-lisina con una pistola de nitrógeno, fije el molde de PDMS al portaobjetos. Alinea cuidadosamente los bordes del molde con el portaobjetos.Ahora, hornee el conjunto durante 90 minutos a 75 grados centígrados para fortalecer la unión entre el PDMS y la corredera. Mientras tanto, prepare 20 piezas de tubería de polietileno flexible para las entradas y salidas. En cada pieza de tubo, coloque un pasador hueco de acero inoxidable de un milímetro de diámetro.Luego, a través de los alfileres, llene las longitudes con un centímetro o más de poli-L-lisina. Una vez adheridos al vidrio, fije con cuidado los pasadores a las entradas del molde. Este es el paso más difícil de la preparación.No apresures el proceso. Conecte el otro extremo de los tubos a una configuración de tanque de nitrógeno regulada por presión que consta de una red de 20 válvulas de tres vías y puede manejar dos moldes a la vez. Usando la configuración, sople la solución a través del molde a 0.5 a un PSI durante al menos seis horas.Comience aspirando soluciones de ADN monocatenario recién preparadas en BS-3 a través de las clavijas de acero inoxidable y en el tubo de polietileno. Luego, acople el molde de PDMS a la fuente de nitrógeno y haga fluir la solución a través del molde de código de barras durante unos 40 minutos o hasta que se llenen todos los canales. Luego, detenga el flujo y deje que el molde se incube a temperatura ambiente durante dos horas.Después de un par de horas, hornee el molde de código de barras a 75 grados centígrados durante una hora. Una vez horneado, separe el molde del portaobjetos y lave suavemente el portaobjetos con 01%SDS. A continuación, lave el portaobjetos tres veces con agua ultrapura.A continuación, seca el portaobjetos del código de barras con un deslizador giratorio. Una vez seco, guarde el portaobjetos de código de barras en un tubo limpio de 50 mililitros. Para continuar, siga el protocolo de texto para validar el patrón unidimensional.Para realizar el procedimiento de validación, bloquee el portaobjetos, hibride la cianina como tres ADN complementario a él y mida los resultados. El maestro SU-8 para una matriz de tres por tres tiene un patrón de flujo perpendicular al del primer diseño. Utilice el método descrito anteriormente para hacer un nuevo molde PDMS de este patrón.Para empezar, haga nuevas concentraciones de trabajo de los nueve oligonucleótidos. Ahora, fluya una solución de bloqueo de BSA del tres por ciento en los 20 canales del portaobjetos del arreglo durante una hora a 0,5 a un PSI. A continuación, cargue las soluciones de ADN en sus respectivos canales.Después de fluirlos durante unos 40 minutos, incuba el portaobjetos a temperatura ambiente durante dos horas para permitir que el ADN se hibride. A continuación, fluya una solución de bloqueo BSA al tres por ciento en los 20 canales durante una hora. Esto eliminará el ADN no hibridado.Ahora, retire la diapositiva de la matriz del PDMS y sumerja la diapositiva en un tres por ciento de BSA una vez. Luego, sumerja la diapositiva en PBS dos veces, seguidas de una inmersión en el dos por ciento de PBS. Luego, como antes, seque el portaobjetos con un girador de portaobjetos de microscopio.Para continuar, realice un paso de validación similar a la validación de diapositivas unidimensionales. Utilice oligonucleótidos de uno primo a nueve primos, todos conjugados con cianina tres. Guarde el portaobjetos de matriz de tres por tres en un tubo de centrífuga de 50 mililitros para su uso posterior.El protocolo de texto explica con más detalle cómo convertir la matriz de ADN en una matriz de anticuerpos. Después de preparar y purificar los conjugados anticuerpo-oligonucleótido, prepare otro molde de PDMS con microcámaras. Consulte el texto para obtener más detalles.Acople este molde con la corredera de matriz. Ahora, bloquee el portaobjetos con un uno por ciento de BSA e incube durante una hora a temperatura ambiente. Durante la incubación, prepare 200 microlitros de conjugados anticuerpo-oligonucleótido.Después del bloqueo, agregue el cóctel de anticuerpos y oligonucleótidos a la configuración. Deje que los anticuerpos se incuben en la matriz durante una hora a 37 grados centígrados, y luego limpie y seque el portaobjetos antes de continuar con los sumidos de portaobjetos descritos en el protocolo de texto. Después de seguir el protocolo descrito, utilizando un array de tres por tres, el panel de anticuerpos resultante se utilizó en la detección multiplex, principalmente a través de la plataforma ELISA sándwich.Las proteínas mostraron menos del 10% de variación de un extremo al otro extremo del portaobjetos de vidrio. En la matriz de tres por tres, se pueden detectar hasta siete proteínas junto con una referencia marcada por tres cianina y un control negativo. En un experimento unicelular realizado para un estudio tumoral, las seis proteínas se detectaron simultáneamente.Para la calibración, se aplicaron proteínas recombinantes a una matriz en varias concentraciones. La sensibilidad de detección fue bastante similar a la de un ELISA sándwich convencional. Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener los moldes de PDMS libres de partículas.El polvo en los canales puede dar lugar a matrices con poca uniformidad y baja sensibilidad. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la investigación del cáncer exploraran la señalización célula-célula utilizando modelos de microambientes tumorales.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Chemistry

Química

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Celular del cáncer colorrectal superficie de la proteína perfiles con un microarray de anticuerpos y la multiplexación de fluorescencia

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