Name: El examen de las proteínas unidas al ADN naciente en células de mamífero utilizando BrdU-chip-Slot-occidental Técnica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-14T18:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Aprende a examinar proteínas unidas al ADN naciente en células de mamífero mediante la técnica BrdU-ChIP-Slot-Western. Este método cuantitativo permite detectar interacciones proteicas durante la replicación y reparación del ADN.

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El trabajo en este manuscrito fue apoyada por fondos del Departamento de Oncología Radioterápica y el Instituto de Cáncer Huntsman y el Instituto Nacional de la concesión de la Salud (R01-CA188520) de SB. Doy las gracias a Danielle Johnson y Steven Bennett en mi laboratorio para demostrar el protocolo y explicar sus beneficios. Agradezco al Dr. Mahesh Chandrasekharan (Instituto de Cáncer Huntsman) para comentarios críticos sobre el manuscrito.

1. La cromatina immunoprecipitation (CHIP) después de etiquetado BrdU <ol><li> Cultura células NIH3T3 en presencia de DMSO o inhibidores selectivos HDAC1,2 como se describió previamente 6. </li><li> Tras el tratamiento con inhibidores selectivos de DMSO o HDAC1,2, añadir BrdU a las células en una campana de cultivo de tejido estéril. Incubar 2 x 10 6 NIH3T3 células sembradas en 10 ml de medio NIH3T3 con una concentración final de 20 mM de bromodesoxiuridina (BrdU) durante 60 minutos en un 37 ° C incubadora de cultivo de tejidos estéril. </li><li> Reticular proteínas intracelulares en el ADN mediante la adición de formaldehído directamente a los medios de cultivo a una concentración final de 1%. Incubar 2 x 10 6 células NIH3T3 con formaldehído a TA durante 10 min en un agitador. </li><li> Se detiene la reticulación mediante la adición de glicina a una concentración final de 125 mM. Incubar a TA durante 5 min en un agitador. </li><li> Quite el papel y recoger las células en PBS en un tubo de centrífuga de 15 ml. Girar cells a 956 xg durante 5 min a 4 ° C. Lavar el sedimento celular dos veces con PBS enfriado con hielo. Retirar PBS desde el tubo. Almacenar el sedimento celular reticulado sin PBS (el sobrenadante) a -80 ° C hasta su uso. </li><li> Preparar el lisado del sedimento celular reticulado mediante la adición de tampón FA140 500 l (50 mM de HEPES KOH pH 7,5, 140 mM de NaCl, 1 mM de EDTA (pH 8,0), 1% de Triton-X-100 y 0,1% de desoxicolato de sodio) complementado con cóctel inhibidor de proteasa. </li><li> Cortar la cromatina sonicando las muestras cinco veces en el poder el 35% y con un pulso de 15 segundos, 0,9 segundos encendido y 0,1 seg de ajuste. Mantener los tubos en hielo después de cada ronda de tratamiento con ultrasonidos para evitar el calentamiento de las muestras. <ol><li> Compruebe la esquila en un gel de ADN como la eficiencia esquila variará entre los diferentes sonicadores. Para comprobar la sonicación, invierta reticulación mediante la adición de NaCl a una concentración de 0,16 M y realizar los pasos 1.17.1. - 1.22. Run eluyó 10 l de ADN en un gel de agarosa al 1,5% para comprobar si el cizallamiento esentre 300-700 pb con una intensidad media en 500 pb. </li></ol></li><li> Tras la sonicación, las muestras de centrifugación durante 10 min a 17.949 xg a 4 ° C y transferir el sobrenadante a un nuevo tubo. <ol><li> Efectuar la estimación de proteínas usando el kit de ensayo de proteína comercial según el protocolo del fabricante. Utilice la misma cantidad de lisado de chip de control y las muestras experimentales. En general, use 1 mg de lisado total por reacción chip. </li></ol></li><li> Preparar suspensión al 50% de la proteína A-agarosa usando tampón que contiene FA140 cóctel inhibidor de proteasa. Añadir décima volumen del cóctel inhibidor de proteasa. Calcular el volumen de los granos necesarios basado en el número de muestras en total. <ol><li> Wash perlas de Proteína A-agarosa con tampón FA140 dos veces para eliminar el tampón de almacenamiento y añadir un volumen igual a tampón FA140 a las perlas para hacer suspensión al 50%. </li><li> Para eliminar las proteínas que se unen no específicamente a las perlas, se añaden 50 l de suspensión al 50% de proteína A-agarosa y enCubate las muestras a 4 ° C con rotación constante de extremo sobre extremo en un mezclador asador durante 30 min. </li></ol></li><li> Haga girar las muestras a 956 xga 4 ° C durante un minuto. Recoger el sobrenadante y llevar a cabo la inmunoprecipitación mediante la adición de ya sea 8 l de anticuerpo H4K16ac o 5 l (5 g) de 1 mg / ml de anticuerpo smarca5 al sobrenadante. Se incuba a 4 ° CO / N con la rotación de extremo a extremo constante en un mezclador rotisserie. </li><li> Guardar 1 / 10o del extracto para el control de &quot;entrada&quot; y configurarlo como un lado a -20 ° C. La entrada tiene que ser inversa reticulado junto con las muestras IP. </li><li> Utilice una cantidad igual de IgG de conejo (5 l de 1 mg / ml) como la muestra negativa inmunoprecipitación control. </li><li> El día siguiente, se añaden 50 l de 50% de proteína-A agarosa suspensión para el extracto y se incuba durante 1 hora a 4 ° C con rotación. </li><li> Pellet perlas de agarosa por centrifugación a 956 xg durante 2 min a 4 ° C, retire con cuidado el sobrenadante y wash de las bolitas con los siguientes tampones secuencialmente. En los preparativos de amortiguamiento, añadir inhibidores de proteasas justo antes de su uso. <ol><li> Lavar con Sal complejo inmune tampón de lavado Low (FA140; concentración final de 50 mM de HEPES KOH pH 7,5, 140 mM de NaCl, 1 mM de EDTA (pH 8,0), 1% de Triton-X-100 y 0,1% de desoxicolato de sodio) para 5 min a 4 ° C con rotación de extremo a extremo. </li><li> Lavar con elevado de sal complejo inmune Wash Buffer (FA500; concentración final de 50 mM de HEPES KOH pH 7,5, 500 mM de NaCl, 1 mM de EDTA (pH 8,0), 1% de Triton-X-100 y 0,1% de desoxicolato de sodio) para 5 min a 4 ° C con rotación de extremo a extremo. </li><li> Lavar con LiCl complejo inmune tampón de lavado (concentración final de 10 mM de Tris-Cl pH 8,0, 250 mM de LiCl, 0,5% de NP40 y 0,5% de desoxicolato de sodio) durante 5 min a 4 ° C con rotación de extremo a extremo. </li></ol></li><li> Después de lavados como se ha descrito anteriormente, añadir 200 l solución de elución (concentración final de 1% SDS y bicarbonato de sodio 100 mM) y incubate a TA durante 15 min con rotación de extremo a extremo a TA. </li><li> Girar las muestras a 956 xg a TA y transferir el material eluido a un nuevo tubo de 1,5 ml. Repita el paso 1,15 con una solución adicional de elución 200 l. </li><li> Para 400 l de eluato, añadir NaCl hasta una concentración de 0,16 M y mezclar bien. <ol><li> Además, añadir solución de elución a 400 l 10 l de entrada que se había reservado (paso 1,11) y se añade NaCl a una concentración de 0,16 M para revertir muestras de entrada de reticulación también. Invierta entrecruzar las muestras mediante la incubación de 65 ° C baño de agua durante 5 horas. </li></ol></li><li> Añadir 1 ml de EtOH 100% al eluato reticulado inversa. Mezclar bien e incubar a 80 ° C durante 2-3 horas oa -20 ° CO / N. Haga girar las muestras a 17.949 xg durante 15 min y deseche etanol. </li><li> Añadir 800 l 70% de etanol para lavar el pellet. Vuelta a 17.949 xg durante 15 min a 4 ° C y descartar etanol. Girar brevemente para eliminar cualquier etanol residual. Seque las muestras a 37 ° C durante 10 min para eliminar el etanol residual. </li><li> Disolver el ADN en 90 l de RNasa y DNasa libre de agua y añadir 2 l 10 mg / ml RNasa a un / ml de concentración final 0,2 mg. Se incuba a 37 ° C en baño de agua durante 30 minutos. </li><li> Añadir 10 l de 10x proteinasa K Buffer (100 mM Tris-Cl pH 8,0, 50 mM EDTA pH 8,0, 5% de SDS). Mezclar bien y añadir 1 l de proteinasa K. Incubar a 42 ° C durante 1 hora. </li><li> Se purifica ADN de entrada y chip usando kit comercial de purificación de PCR según el protocolo del fabricante y eluir ADN en 50 l de agua. ADN tienda a -20 ° C hasta su uso posterior. </li></ol> 2. Ranura Análisis de transferencia de ADN chip <ol><li> Medir el rendimiento de entrada y el ADN se eluyó en ChIP 50 l de agua como se describe en el paso 1.22 usando un espectrofotómetro a 280 nm de acuerdo con el protocolo del fabricante. </li><li> Tome volúmenes iguales (50 l) de la entrada o de ADN immunoprecipitated que están dentro del rango lineal de detección. <ol><li> Por ejemplo, si la entradaRendimiento de ADN es de 1,5 ng / l, luego tomar 30 l (o 45 ng de ADN total) y crea volumen de 50 l con agua. Para factor de chip, tome todo el eluato 50 l a partir del paso 2.1 y vaya al paso 2.3. </li></ol></li><li> Desnaturalizar 50 l de entrada o ADN inmunoprecipitado mediante la adición de 2,5 volúmenes de NaOH 0,4 N, vórtice brevemente y centrifugar durante 956 xg durante 10 seg, y se incuba a TA durante 30 min. </li><li> Neutralizar la DNA desnaturalizado mediante la adición de 175 l de M Tris-HCl pH 6,8, 1, vórtice, de centrífuga de 956 xg durante 10 seg y colocar las muestras en hielo. </li><li> Preparar una dilución en serie de entrada y el ADN inmunoprecipitado para el ensayo de transferencia en ranura como se describe a continuación. <ol><li> Siga los pasos 2.3 - 2.4 para obtener un volumen de muestra total de 350 l (es decir, 50 l de entrada / DNA chip, 125 l NaOH 0,4 N, M Tris-HCl 175 l 1, pH 6,8). Nota: Para la instancia se ha dicho, 45 ng de ADN de entrada va a terminar siendo 0.129 ng / l. </li><li> Para ADN de entrada, etiquetar tres tubos como 100, 50 y 25 y añadir 100 l, 50 l y 25 l de la muestra de ADN desnaturalizado y neutralizado. Hacer que el volumen final de 100 l con agua libre de nucleasa. Para chip de ADN, la etiqueta tres tubos como 200, 100 y 50 y añadir 200 l, 100 l y 50 l de la muestra de ADN desnaturalizado y neutralizado. Hacer volumen final de 200 l con agua libre de nucleasa. </li></ol></li><li> Cortar la membrana con el tamaño del aparato de slot blot. Pre-humedecer la membrana y papeles secantes en 20x SSC antes y antes de añadir el ADN. Ensamblarlos en el aparato de slot blot de acuerdo con el protocolo del fabricante. </li><li> ADN Pipet desde el paso 2.5.2 en las ranuras apropiadas. Aplicar el vacío lentamente para sacar el ADN sobre la membrana zeta-sonda. Deje de vacío después de haber pasado todas las muestras a través del aparato. <ol><li> Desmontar el aparato e inmovilizar inmediatamente el ADN sobre la membrana utilizando un agente de reticulación UV. Tener el lado del ADN en el agente de reticulación UV y usar el autocrosslink establecer en el agente de reticulación. Siga el protocolo del fabricante. </li></ol></li><li> Detectar BrdU en el slot blot mediante la realización de Western Blot. <ol><li> Bloquear la membrana con 5% de leche seca no grasa en PBS que contenía 0,1% de Tween-20 (PBST) durante 1 hora a RT para evitar la unión no específica de anticuerpos a la membrana. </li><li> Añadir anticuerpo primario anti-BrdU (1: 500 dilución) diluido en 1% de leche seca no grasa en PBST y se incuba el blot con el anticuerpo primario durante 3 horas a RT en un agitador. Se lava la membrana con PBST tres veces después de la incubación del anticuerpo primario. </li><li> Añadir anti-ratón anticuerpo secundario conjugado con HRP a la blot (1: 5000 dilución) y se incuba a RT durante 1 hr. Lavar la membrana con PBST tres veces después de la incubación del anticuerpo secundario. NOTA: Utilice un volumen suficiente de los anticuerpos para cubrir completamente la membrana durante incubaciones de anticuerpos primarios y secundarios. </li></ol></li><li> Preparar la mezcla de ECL y agregarlo a la ac blotacuerdo con el protocolo del fabricante. Incubar la membrana con la mezcla de ECL durante 5 min a RT. <ol><li> Colocar la membrana en un casete de rayos X, exponer la membrana a la película de rayos X y desarrollar el blot utilizando el protocolo del fabricante. </li><li> Cuantificar la señal obtenida para la entrada y el ADN chiped después de escanear las manchas utilizando la imagen J software de acuerdo con el protocolo del fabricante. Para la cuantificación, utilizar la señal que está dentro del intervalo lineal de detección con el fin de asegurar la exactitud de la medición. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Podhorecka, M., Skladanowski, A., Bozko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H2AX+Phosphorylation%3A+Its+Role+in+DNA+Damage+Response+and+Cancer+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+nucleic+acids%22%5BJournal%5D)">H2AX Phosphorylation: Its Role in DNA Damage Response and Cancer Therapy.</a> J nucleic acids. , (2010).</li>
<li>Groth, A., Rocha, W., Verreault, A., Almouzni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+challenges+during+DNA+replication+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Chromatin challenges during DNA replication and repair.</a> 128, 721-733 (2007).</li>
<li>Demeret, C., Vassetzky, Y., Mechali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+remodelling+and+DNA+replication%3A+from+nucleosomes+to+loop+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Chromatin remodelling and DNA replication: from nucleosomes to loop domains.</a> Oncogene. 20, 3086-3093 (2001).</li>
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<li>Bhaskara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+deacetylases+1+and+2+maintain+S-phase+chromatin+and+DNA+replication+fork+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics+Chromatin%22%5BJournal%5D)">Histone deacetylases 1 and 2 maintain S-phase chromatin and DNA replication fork progression.</a> Epigenetics Chromatin. 6, 27(2013).</li>
<li>Bhaskara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hdac3+is+essential+for+the+maintenance+of+chromatin+structure+and+genome+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Hdac3 is essential for the maintenance of chromatin structure and genome stability.</a> Cancer Cell. 18, 436-447 (2010).</li>
<li>Johnson, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDAC1%2C2+inhibition+impairs+EZH2-+and+BBAP-mediated+DNA+repair+to+overcome+chemoresistance+in+EZH2+gain-of-function+mutant+diffuse+large+B-cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">HDAC1,2 inhibition impairs EZH2- and BBAP-mediated DNA repair to overcome chemoresistance in EZH2 gain-of-function mutant diffuse large B-cell lymphoma.</a> Oncotarget. 6, 4863-4887 (2015).</li>
<li>Bhaskara, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+deacetylases+1+and+2+regulate+DNA+replication+and+DNA+repair%3A+potential+targets+for+genome+stability-mechanism-based+therapeutics+for+a+subset+of+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Histone deacetylases 1 and 2 regulate DNA replication and DNA repair: potential targets for genome stability-mechanism-based therapeutics for a subset of cancers.</a> Cell Cycle. 14, 1779-1785 (2015).</li>
<li>Taddei, A., Roche, D., Sibarita, J. B., Turner, B. M., Almouzni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duplication+and+maintenance+of+heterochromatin+domains%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Duplication and maintenance of heterochromatin domains.</a> J Cell Biol. 147, 1153-1166 (1999).</li>
<li>Alabert, C., Groth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+replication+and+epigenome+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Chromatin replication and epigenome maintenance.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 13, 153-167 (2012).</li>
<li>Clapier, C. R., Cairns, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+ISWI+involves+inhibitory+modules+antagonized+by+nucleosomal+epitopes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Regulation of ISWI involves inhibitory modules antagonized by nucleosomal epitopes.</a> Nature. 492, 280-284 (2012).</li>
<li>Sirbu, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+protein+dynamics+at+active%2C+stalled%2C+and+collapsed+replication+forks%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Analysis of protein dynamics at active, stalled, and collapsed replication forks.</a> Genes Dev. 25, 1320-1327 (2011).</li>
</ol>

No tengo intereses financieros en competencia.

El protocolo se describe en este manuscrito es un método relativamente rápido para demostrar la presencia de las proteínas o sus formas modificadas post-traduccionalmente en el ADN recién replicado o naciente. Además, esta técnica permite que un para medir la cinética de asociación-disociación de una proteína o su forma modificada con el ADN naciente. Esta técnica es complementaria a la tecnología elegante ipond 13. En la tecnología ipond, ADN recién sintetizado se etiqueta con acetato de desoxiuridina (EDU)....

La reparación del ADN defectuoso y / o la replicación del ADN son una causa principal de la inestabilidad del genoma, lo que puede desencadenar la muerte celular. Una sola sin reparar rotura de doble cadena es suficiente para causar la muerte celular 1. Organización de la cromatina se altera transitoriamente tanto durante la replicación y la reparación de 2,3, y el fracaso para mantener la información epigenética durante estos procesos se traducirá en una amenaza para la integridad del genoma. Pérdida de HDAC3 o función HDAC1,2 impide la progresión de la fase S, la replicación y reparación del ADN que conduce a estrés genotóxico (daño en el ADN) y la muerte celular 4-9. Es por lo tanto una estrategia práctica para usar inhibidores de HDAC selectivos para interrumpir la replicación, reparación y la cromatina en las células cancerosas y causar daño en el ADN, que a su vez puede detener el crecimiento y la muerte celular selectivamente inducir en las células cancerosas que crecen rápidamente. Durante la replicación del ADN, la cromatina se desmonta rápidamente y luego se vuelve a montar después de la duplicación del ADN. Recién syhistona H4 nthesized es acetilada en K5 y K12 residuos (H4K5K12ac) y después de la deposición sobre la cromatina, se deacetylated rápidamente por desacetilasas de histonas (HDAC) 10,11. El fracaso de las células para mantener la integridad de la cromatina naciente por desacetilación de histonas puede conducir al colapso tenedor, que a su vez puede dar lugar a daños en el ADN y la muerte celular. Recientemente hemos demostrado que la inhibición selectiva de HDAC1,2 aumenta la acetilación de histonas (H4K5ac, H4K12ac y H4K16ac) e inhibe la actividad smarca5 remodelador de cromatina en la cromatina naciente, que se correlaciona con una menor progresión de tenedor de replicación, aumentamos colapso tenedor y el aumento de la replicación del daño en el ADN inducido por el estrés 6 . Así, el tratamiento inhibidor de HDAC puede alterar la estructura de cromatina naciente para desencadenar el daño del ADN y la muerte muy rápidamente en las células cancerosas, ya que estos ciclo de las células rápidamente y pasar muchas veces a través de la fase S. Por tanto, es importante entender cómo las HDAC funcionan para regular la acetilación de histonas y proteínas binding para mantener la replicación del ADN en células de mamífero. Para medir cuantitativamente la cantidad de acetilación de histonas y smarca5 remodelador de cromatina asociada con el ADN naciente durante la replicación del ADN, ideamos un chip de ensayo modificado llama la técnica de BrdU-chip-Slot-occidental. Después de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) de una modificación de la proteína o histona se desea, la cantidad de ADN naciente (marcó usando análogo de la timidina, BrdU) en la muestra de chip puede ser detectado mediante análisis de Western de DNA chip BrdU marcado con transfirió a una membrana usando un Slot aparato Blot. Mediante esta técnica, se demostró que H4K16ac (una marca implicada en el embalaje de la cromatina) y el miembro de la familia ISWI smarca5 (actina dependiente regulador de la matriz asociada relacionada con el SNF SWI / de la cromatina) remodelador de cromatina se asocian con el ADN naciente en las células en fase S 6. También se encontró que la marca naciente H4K16ac se desacetila por HDAC1,2 durante la replicación del ADN 6. Inhibe H4K16acactividad remodelador de cromatina del familiar ISWI smarca5 12. Por lo tanto, utilizando la técnica de BrdU-CHIP-Slot-Western, podríamos conectar las funciones para HDAC1,2 en la regulación de remodelación de la cromatina durante la replicación del ADN. Por lo tanto, la técnica BrdU-chip-Slot-Western Blot es un enfoque poderoso para medir cuantitativamente la dinámica de asociación y disociación de proteínas o sus modificaciones posteriores a la traducción que se unen al ADN naciente.

<table><tbody><tr><td>Anti-BrdU (westerns)</td><td>BD Biosciences</td><td>B555627</td><td></td></tr><tr><td>Anti-SMARCA5</td><td>Abcam</td><td>ab3749</td><td></td></tr><tr><td>Anti-H4K16ac</td><td>Motivo activo</td><td>39167</td><td></td></tr><tr><td>Zeta-Probe GT Membrana</td><td>Bio-Rad</td><td>162-0197</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehído</td><td>Fisher</td><td>BP531-500</td><td></td></tr><tr><td>Proteína A agarosa</td><td>Millipore</td><td>16-156</td><td></td></tr><tr><td>Rnasa</td><td>A Qiagen</td><td>19101</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasa K</td><td>Sigma</td><td>P4850</td><td></td></tr><tr><td>PCR Kit de purificación</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>G7403</td><td></td></tr><tr><td>Cóctel inhibidor de proteasa</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>BrdU</td><td>Sigma</td><td>B9285</td><td></td></tr><tr><td>Conejo IgG& nbsp;</td><td>Millipore</td><td>12-370</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S-3014</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Sigma</td><td>93443</td><td></td></tr><tr><td>NP40</td><td>USB Corporation</td><td>19628</td><td></td></tr><tr><td>Desoxicolato de sodio</td><td>Sigma</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio</td><td>Sigma</td><td>S-4019</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Etanol Decon Laboratories</td><td>04-355-222</td><td></td></tr><tr><td>Agua tratada con DEPC</td><td>Sigma</td><td>95284</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Fisher</td><td>BP-152-5</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Ambion</td><td>AM9820</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio</td><td>Mallinckrodt GenAR&nbsp;</td><td>MAL7772-06</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC</td><td>Life Technologies</td><td>15557-036</td><td></td></tr><tr><td>Leche en polvo descremada</td><td>Lab Scientific Inc</td><td>M0841</td><td></td></tr><tr><td>ECL</td><td>Thermo Fisher</td><td>80196</td><td></td></tr><tr><td>Película de rayos X</td><td>Genesee Sci</td><td>30-101</td><td></td></tr><tr><td>Revelador</td><td>Konica Minolta</td><td>SRX-101A</td><td></td></tr><tr><td>Reticulante UV</td><td>Stratagene</td><td>XLE-1000</td><td></td></tr><tr><td>Sonificador</td><td>Branson Sonicator &nbsp; Disruptor de célula ultrasónico digital</td><td>Modelo: centrífuga 450</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Modelo Eppendorf</td>: <td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Baño de agua</td><td>Fisher Scientific Isotemp</td><td>Modelo: 2322</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotómetro NanoDrop 1000</td><td>Modelo ThermoScientific</td><td>: Aparato de transferencia de ranura 1000</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Schleicher and Schuell Minifold II</td><td>44-27570</td><td></td></tr><tr><td>incubadora de cultivo de tejidos</td><td>Thermo Scientific</td><td>Series II 3110 Incubadoras</td><td></td> de CO2 con camisa de agua</tr></tbody></table>

el examen de las proteínas unidas al adn naciente en células de mamífero utilizando brdu-chip-slot-occidental técnica

Examination of Proteins Bound to Nascent DNA in Mammalian Cells Using  BrdU-ChIP-Slot-Western Technique

Histonas desacetilasas 1 y 2 (HDAC1,2) localizar a los sitios de la replicación del ADN. En el estudio anterior, el uso de un inhibidor selectivo y un sistema de caída genética, mostramos funciones novedosas para HDAC1,2 en la replicación del tenedor progresión y mantenimiento de la cromatina naciente en células de mamífero. Además, se utilizó una técnica de BrdU-chip-Slot-occidental que combina la cromatina immunoprecipitation (CHIP) de bromo-desoxiuridina (BrdU) ADN marcado con con slot blot y análisis Western para medir cuantitativamente las proteínas o modificación de las histonas asociadas con el ADN naciente. Activamente células que se dividen fueron tratados con HDAC1,2 inhibidor selectivo o transfectadas con siRNAs contra HDAC1 y HDAC2 y luego ADN recién sintetizado se marcó con el análogo de la timidina bromodesoxiuridina (BrdU). El etiquetado BrdU se realizó en un punto de tiempo cuando no había detención del ciclo celular o apoptosis significativa debido a la pérdida de las funciones HDAC1,2. Después de lAbeling de las células con BrdU, inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP) de las marcas de acetilación de histonas o la cromatina-remodelador se realizó con anticuerpos específicos. El ADN de entrada BrdU-etiquetado y la immunoprecipitated (o chiped) ADN fue descubierto en una membrana utilizando la técnica de transferencia de ranura y inmovilizaron utilizando UV. La cantidad de ADN naciente en cada ranura a continuación, se evaluó cuantitativamente utilizando el análisis de Western con un anticuerpo anti-BrdU. A continuación, el efecto de la pérdida de las funciones HDAC1,2 sobre los niveles de ADN asociado a histonas marcas de acetilación recién sintetizadas y remodelador de la cromatina se determinó mediante la normalización de la señal BrdU-Chip obtenido a partir de las muestras tratadas a las muestras de control.

Para determinar la especificidad de los inhibidores selectivos HDAC1,2, se utilizaron Hdac1,2 FL / FL y HDAC3 FL / FL células de fibrosarcoma. Se utilizó la recombinasa Cre (Ad-Cre) que contiene Adenovirus-eliminar Hdac1,2 y HDAC3 en estas células. Después de la infección Ad-Cre de Hdac1,2 FL / FL células, se observó un fuerte incremento en H4K5ac. El tratamiento de células knockout Hd...

En este protocolo, describimos una novedosa técnica BrdU-ChIP-Slot-Western para examinar proteínas y modificaciones de histonas asociadas con ADN recién sintetizado o naciente.

El examen de las proteínas unidas al ADN naciente en células de mamífero utilizando BrdU-chip-Slot-occidental Técnica

Histone deacetylases 1 and 2 (HDAC1,2) localize to the sites of DNA replication. In the previous study, using a selective inhibitor and a genetic ...

El objetivo general de este procedimiento es examinar rápidamente las proteínas unidas al ADN naciente con precisión utilizando el marcaje de BrdU y la precipitación de cromatina. Este método puede responder preguntas clave en el campo de la replicación, reparación en el campo de la cromatina, como qué proteínas se unen al ADN naciente durante la replicación del ADN y qué proteínas de reparación se unen al ADN naciente durante el estrés de replicación. La principal ventaja de esta técnica es que es un método relativamente rápido para detectar proteínas unidas al ADN naciente de una manera altamente cuantitativa.Para comenzar, configure cultivos de dos millones de células NIH 3T3 en 10 mililitros de medio con DMSO o inhibidores. Además, agregue BrdU a una concentración final de 20 micromolares. Una vez emplatadas, incubar las células durante 60 minutos.Después de una hora, entrecruza las proteínas intracelulares con el ADN añadiendo formaldehído directamente al medio de cultivo hasta una concentración del 1% en volumen. Luego, deje que las células se incuben a temperatura ambiente durante 10 minutos con agitación. Después de 10 minutos, apague la reacción agregando glicina al medio a 125 milimolares y continúe la incubación durante cinco minutos más.A continuación, recoja las células en PBS y lávelas dos veces con PBS mediante centrifugación. El pellet se puede congelar a 80 grados centígrados por almacenamiento si se desea. A continuación, prepare el lisado a partir de las células reticuladas, añada 500 microlitros de tampón FA140 suplementado con el cóctel de inhibidores de la proteasa al pellet y corte la cromatina utilizando cinco pulsos de sonicación de 15 segundos.Mantenga las células frías entre las pulsaciones. A continuación, ejecute 10 microlitros de muestra en un gel al 1,5% para diagnosticar la eficacia del cizallamiento. Una vez cortadas, centrifugar las muestras durante 10 minutos y transferir el sobrenadante a un nuevo tubo.A continuación, estime la concentración de proteínas en el sobrenadante utilizando un kit. A continuación, prepare una suspensión al 50% de perlas de agarosa de proteína A con tampón FA140 que contiene inhibidor de proteasa. Agregue 50 microlitros de la suspensión a cada muestra e incube las muestras a 4 grados centígrados con una rotación constante de extremo a extremo durante 30 minutos.Después de media hora, centrifugar las muestras durante un minuto alrededor de 1000 G en una centrífuga refrigerada. A continuación, recoja el sobrenadante que contiene la cromatina marcada. Antes de continuar, guarde 1/10 del extracto a 20 grados centígrados para que luego sirva como control de entrada.Para inmunoprecipitar la cromatina, agregue ocho microlitros de anticuerpo H4K16ac o cinco microgramos de SMARCA5 anticuerpo a los sobrenadantes. Además, agregue cinco microgramos de IgG rápida al extracto que sirve como muestra de control negativo. Incubar la cromatina a 4 grados centígrados durante la noche en una batidora de asador.Al día siguiente, añadir 50 microlitros de la suspensión preparada de agarosa al 50% de proteína A a las inmunoprecipitaciones e incubar las mezclas durante una hora a 4 grados centígrados con rotación. Después de una hora, pelicé las perlas de agarosa y deseché con cuidado el sobrenadante. Ahora, lave las cuentas usando rotaciones de extremo a extremo a 4 grados Celsius en tres tampones secuenciales.Primero, use un tampón de lavado de complejo inmunológico bajo en sal recién preparado durante cinco minutos. En segundo lugar, use un tampón de lavado de complejo inmunológico con alto contenido de sal recién preparado durante cinco minutos. En tercer lugar, use un tampón de lavado del complejo inmunológico de cloruro de litio recién preparado durante cinco minutos.Después de los lavados, agregue solución de elución a las muestras como se describe en el texto. Gire las muestras y transfiera el eluido a un nuevo tubo de 1,5 mililitros. Ahora, incube las muestras a 65 grados centígrados durante 5 horas para revertir la reticulación.Más tarde, precipita el ADN. Agregue un mililitro de etanol 100% a las muestras y mezcle bien. Luego, incubarlos a 80 grados centígrados durante dos o tres horas o toda la noche a 20 grados centígrados.Después de la precipitación, retire el etanol con una ceintrifugación de 15 minutos a 18000 G. Luego, siguiendo el protocolo de texto, lave el pellet, trate las muestras con RNasa, luego con proteinasa K, purifique el ADN como se describe en el texto y, finalmente, almacene a 20 grados centígrados. Para empezar, mida el rendimiento de entrada y ADN ChIP en un espectrofotómetro.A continuación, desnaturaliza las muestras. Añadir 2,5 volúmenes de hidróxido de sodio normal al 0,4, vórtice brevemente y centrifugar e incubar las muestras a temperatura ambiente durante 30 minutos. A continuación, neutraliza el ADN desnaturalizado añadiendo 175 microlitros de un cilimor de Tris molar pH 6,8.Vórtice, centrifugar y colocar las muestras en hielo. Ahora, prepare diluciones en serie del ADN de entrada e inmunoprecipitado y proceda con el ensayo de transferencia en ranura como se describe en el protocolo de texto. Después de que el ADN de la mancha haya sido inmovilizado por los rayos UV, detecte el BrdU en la mancha de la ranura mediante Western blot.Primero, bloquee la membrana con leche en polvo descremada al 5% en PBST durante una hora a temperatura ambiente para evitar la unión inespecífica. A continuación, prepare un baño de leche en polvo descremada al 1% en PBST con anticuerpo anti-BrdU diluido 1:500 añadido. Incubar la mancha en este baño durante tres horas a temperatura ambiente en una coctelera.A continuación, lave la membrana con PBST tres veces. A continuación, sumerja el blot en una dilución 1:5000 de anticuerpo secundario anti-ratón conjugado con HRP en PBST. Incubar a temperatura ambiente durante una hora agitando.Utiliza tres lavados con PBST para eliminar el secundario y analizar el resultado. Se utilizó la técnica occidental de ranura ChIP BrdU H4K16ac para determinar la cantidad de H4K16ac asociada con el ADN naciente. Se observó un enriquecimiento robusto en H4K16ac asociado con el ADN naciente en comparación con el control rápido de IgG.Tras la inhibición de HDAC1/2 con el compuesto 233, se observó un aumento de H4K16ac asociado al ADN naciente. El mismo resultado se obtuvo utilizando el compuesto 898. Finalmente, se determinó el nivel de SMARCA5 remodelador de la cromatina en el ADN naciente mediante la técnica occidental de ranura BrdU SMARCA5 ChIP.De hecho, SMARCA5 asociado con el ADN naciente y el compuesto 898 no cambió los niveles de SMARCA5. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de los cambios que ocurren en la cromatina y las enzimas modificadoras de la cromatina durante la replicación del ADN en células de mamíferos. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la replicación exploraran los cambios en la cromatina en el ADN naciente, así como la dinámica de las proteínas de reparación del ADN en el ADN naciente.En el futuro, esta técnica también podría utilizarse para estudiar la dinámica de la respuesta al daño del ADN y las proteínas de reparación del ADN en la horquilla estancada, además de estudiar las modificaciones de las histonas y las enzimas modificadoras de la cromatina en la horquilla.

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Biología

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Aprende a examinar proteínas unidas al ADN naciente en células de mamífero mediante la técnica BrdU-ChIP-Slot-Western. Este método cuantitativo permite detectar interacciones proteicas durante la replicación y reparación del ADN.

El examen de las proteínas unidas al ADN naciente en células de mamífero utilizando BrdU-chip-Slot-occidental Técnica

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