Name: El examen de las proteínas unidas al ADN naciente en células de mamífero utilizando BrdU-chip-Slot-occidental Técnica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-14T18:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Aprende a examinar proteínas unidas al ADN naciente en células de mamífero mediante la técnica BrdU-ChIP-Slot-Western. Este método cuantitativo permite detectar interacciones proteicas durante la replicación y reparación del ADN.

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El trabajo en este manuscrito fue apoyada por fondos del Departamento de Oncología Radioterápica y el Instituto de Cáncer Huntsman y el Instituto Nacional de la concesión de la Salud (R01-CA188520) de SB. Doy las gracias a Danielle Johnson y Steven Bennett en mi laboratorio para demostrar el protocolo y explicar sus beneficios. Agradezco al Dr. Mahesh Chandrasekharan (Instituto de Cáncer Huntsman) para comentarios críticos sobre el manuscrito.

1. La cromatina immunoprecipitation (CHIP) después de etiquetado BrdU <ol><li> Cultura células NIH3T3 en presencia de DMSO o inhibidores selectivos HDAC1,2 como se describió previamente 6. </li><li> Tras el tratamiento con inhibidores selectivos de DMSO o HDAC1,2, añadir BrdU a las células en una campana de cultivo de tejido estéril. Incubar 2 x 10 6 NIH3T3 células sembradas en 10 ml de medio NIH3T3 con una concentración final de 20 mM de bromodesoxiuridina (BrdU) durante 60 minutos en un 37 ° C incubadora de cultivo de tejidos estéril. </li><li> Reticular proteínas intracelulares en el ADN mediante la adición de formaldehído directamente a los medios de cultivo a una concentración final de 1%. Incubar 2 x 10 6 células NIH3T3 con formaldehído a TA durante 10 min en un agitador. </li><li> Se detiene la reticulación mediante la adición de glicina a una concentración final de 125 mM. Incubar a TA durante 5 min en un agitador. </li><li> Quite el papel y recoger las células en PBS en un tubo de centrífuga de 15 ml. Girar cells a 956 xg durante 5 min a 4 ° C. Lavar el sedimento celular dos veces con PBS enfriado con hielo. Retirar PBS desde el tubo. Almacenar el sedimento celular reticulado sin PBS (el sobrenadante) a -80 ° C hasta su uso. </li><li> Preparar el lisado del sedimento celular reticulado mediante la adición de tampón FA140 500 l (50 mM de HEPES KOH pH 7,5, 140 mM de NaCl, 1 mM de EDTA (pH 8,0), 1% de Triton-X-100 y 0,1% de desoxicolato de sodio) complementado con cóctel inhibidor de proteasa. </li><li> Cortar la cromatina sonicando las muestras cinco veces en el poder el 35% y con un pulso de 15 segundos, 0,9 segundos encendido y 0,1 seg de ajuste. Mantener los tubos en hielo después de cada ronda de tratamiento con ultrasonidos para evitar el calentamiento de las muestras. <ol><li> Compruebe la esquila en un gel de ADN como la eficiencia esquila variará entre los diferentes sonicadores. Para comprobar la sonicación, invierta reticulación mediante la adición de NaCl a una concentración de 0,16 M y realizar los pasos 1.17.1. - 1.22. Run eluyó 10 l de ADN en un gel de agarosa al 1,5% para comprobar si el cizallamiento esentre 300-700 pb con una intensidad media en 500 pb. </li></ol></li><li> Tras la sonicación, las muestras de centrifugación durante 10 min a 17.949 xg a 4 ° C y transferir el sobrenadante a un nuevo tubo. <ol><li> Efectuar la estimación de proteínas usando el kit de ensayo de proteína comercial según el protocolo del fabricante. Utilice la misma cantidad de lisado de chip de control y las muestras experimentales. En general, use 1 mg de lisado total por reacción chip. </li></ol></li><li> Preparar suspensión al 50% de la proteína A-agarosa usando tampón que contiene FA140 cóctel inhibidor de proteasa. Añadir décima volumen del cóctel inhibidor de proteasa. Calcular el volumen de los granos necesarios basado en el número de muestras en total. <ol><li> Wash perlas de Proteína A-agarosa con tampón FA140 dos veces para eliminar el tampón de almacenamiento y añadir un volumen igual a tampón FA140 a las perlas para hacer suspensión al 50%. </li><li> Para eliminar las proteínas que se unen no específicamente a las perlas, se añaden 50 l de suspensión al 50% de proteína A-agarosa y enCubate las muestras a 4 ° C con rotación constante de extremo sobre extremo en un mezclador asador durante 30 min. </li></ol></li><li> Haga girar las muestras a 956 xga 4 ° C durante un minuto. Recoger el sobrenadante y llevar a cabo la inmunoprecipitación mediante la adición de ya sea 8 l de anticuerpo H4K16ac o 5 l (5 g) de 1 mg / ml de anticuerpo smarca5 al sobrenadante. Se incuba a 4 ° CO / N con la rotación de extremo a extremo constante en un mezclador rotisserie. </li><li> Guardar 1 / 10o del extracto para el control de &quot;entrada&quot; y configurarlo como un lado a -20 ° C. La entrada tiene que ser inversa reticulado junto con las muestras IP. </li><li> Utilice una cantidad igual de IgG de conejo (5 l de 1 mg / ml) como la muestra negativa inmunoprecipitación control. </li><li> El día siguiente, se añaden 50 l de 50% de proteína-A agarosa suspensión para el extracto y se incuba durante 1 hora a 4 ° C con rotación. </li><li> Pellet perlas de agarosa por centrifugación a 956 xg durante 2 min a 4 ° C, retire con cuidado el sobrenadante y wash de las bolitas con los siguientes tampones secuencialmente. En los preparativos de amortiguamiento, añadir inhibidores de proteasas justo antes de su uso. <ol><li> Lavar con Sal complejo inmune tampón de lavado Low (FA140; concentración final de 50 mM de HEPES KOH pH 7,5, 140 mM de NaCl, 1 mM de EDTA (pH 8,0), 1% de Triton-X-100 y 0,1% de desoxicolato de sodio) para 5 min a 4 ° C con rotación de extremo a extremo. </li><li> Lavar con elevado de sal complejo inmune Wash Buffer (FA500; concentración final de 50 mM de HEPES KOH pH 7,5, 500 mM de NaCl, 1 mM de EDTA (pH 8,0), 1% de Triton-X-100 y 0,1% de desoxicolato de sodio) para 5 min a 4 ° C con rotación de extremo a extremo. </li><li> Lavar con LiCl complejo inmune tampón de lavado (concentración final de 10 mM de Tris-Cl pH 8,0, 250 mM de LiCl, 0,5% de NP40 y 0,5% de desoxicolato de sodio) durante 5 min a 4 ° C con rotación de extremo a extremo. </li></ol></li><li> Después de lavados como se ha descrito anteriormente, añadir 200 l solución de elución (concentración final de 1% SDS y bicarbonato de sodio 100 mM) y incubate a TA durante 15 min con rotación de extremo a extremo a TA. </li><li> Girar las muestras a 956 xg a TA y transferir el material eluido a un nuevo tubo de 1,5 ml. Repita el paso 1,15 con una solución adicional de elución 200 l. </li><li> Para 400 l de eluato, añadir NaCl hasta una concentración de 0,16 M y mezclar bien. <ol><li> Además, añadir solución de elución a 400 l 10 l de entrada que se había reservado (paso 1,11) y se añade NaCl a una concentración de 0,16 M para revertir muestras de entrada de reticulación también. Invierta entrecruzar las muestras mediante la incubación de 65 ° C baño de agua durante 5 horas. </li></ol></li><li> Añadir 1 ml de EtOH 100% al eluato reticulado inversa. Mezclar bien e incubar a 80 ° C durante 2-3 horas oa -20 ° CO / N. Haga girar las muestras a 17.949 xg durante 15 min y deseche etanol. </li><li> Añadir 800 l 70% de etanol para lavar el pellet. Vuelta a 17.949 xg durante 15 min a 4 ° C y descartar etanol. Girar brevemente para eliminar cualquier etanol residual. Seque las muestras a 37 ° C durante 10 min para eliminar el etanol residual. </li><li> Disolver el ADN en 90 l de RNasa y DNasa libre de agua y añadir 2 l 10 mg / ml RNasa a un / ml de concentración final 0,2 mg. Se incuba a 37 ° C en baño de agua durante 30 minutos. </li><li> Añadir 10 l de 10x proteinasa K Buffer (100 mM Tris-Cl pH 8,0, 50 mM EDTA pH 8,0, 5% de SDS). Mezclar bien y añadir 1 l de proteinasa K. Incubar a 42 ° C durante 1 hora. </li><li> Se purifica ADN de entrada y chip usando kit comercial de purificación de PCR según el protocolo del fabricante y eluir ADN en 50 l de agua. ADN tienda a -20 ° C hasta su uso posterior. </li></ol> 2. Ranura Análisis de transferencia de ADN chip <ol><li> Medir el rendimiento de entrada y el ADN se eluyó en ChIP 50 l de agua como se describe en el paso 1.22 usando un espectrofotómetro a 280 nm de acuerdo con el protocolo del fabricante. </li><li> Tome volúmenes iguales (50 l) de la entrada o de ADN immunoprecipitated que están dentro del rango lineal de detección. <ol><li> Por ejemplo, si la entradaRendimiento de ADN es de 1,5 ng / l, luego tomar 30 l (o 45 ng de ADN total) y crea volumen de 50 l con agua. Para factor de chip, tome todo el eluato 50 l a partir del paso 2.1 y vaya al paso 2.3. </li></ol></li><li> Desnaturalizar 50 l de entrada o ADN inmunoprecipitado mediante la adición de 2,5 volúmenes de NaOH 0,4 N, vórtice brevemente y centrifugar durante 956 xg durante 10 seg, y se incuba a TA durante 30 min. </li><li> Neutralizar la DNA desnaturalizado mediante la adición de 175 l de M Tris-HCl pH 6,8, 1, vórtice, de centrífuga de 956 xg durante 10 seg y colocar las muestras en hielo. </li><li> Preparar una dilución en serie de entrada y el ADN inmunoprecipitado para el ensayo de transferencia en ranura como se describe a continuación. <ol><li> Siga los pasos 2.3 - 2.4 para obtener un volumen de muestra total de 350 l (es decir, 50 l de entrada / DNA chip, 125 l NaOH 0,4 N, M Tris-HCl 175 l 1, pH 6,8). Nota: Para la instancia se ha dicho, 45 ng de ADN de entrada va a terminar siendo 0.129 ng / l. </li><li> Para ADN de entrada, etiquetar tres tubos como 100, 50 y 25 y añadir 100 l, 50 l y 25 l de la muestra de ADN desnaturalizado y neutralizado. Hacer que el volumen final de 100 l con agua libre de nucleasa. Para chip de ADN, la etiqueta tres tubos como 200, 100 y 50 y añadir 200 l, 100 l y 50 l de la muestra de ADN desnaturalizado y neutralizado. Hacer volumen final de 200 l con agua libre de nucleasa. </li></ol></li><li> Cortar la membrana con el tamaño del aparato de slot blot. Pre-humedecer la membrana y papeles secantes en 20x SSC antes y antes de añadir el ADN. Ensamblarlos en el aparato de slot blot de acuerdo con el protocolo del fabricante. </li><li> ADN Pipet desde el paso 2.5.2 en las ranuras apropiadas. Aplicar el vacío lentamente para sacar el ADN sobre la membrana zeta-sonda. Deje de vacío después de haber pasado todas las muestras a través del aparato. <ol><li> Desmontar el aparato e inmovilizar inmediatamente el ADN sobre la membrana utilizando un agente de reticulación UV. Tener el lado del ADN en el agente de reticulación UV y usar el autocrosslink establecer en el agente de reticulación. Siga el protocolo del fabricante. </li></ol></li><li> Detectar BrdU en el slot blot mediante la realización de Western Blot. <ol><li> Bloquear la membrana con 5% de leche seca no grasa en PBS que contenía 0,1% de Tween-20 (PBST) durante 1 hora a RT para evitar la unión no específica de anticuerpos a la membrana. </li><li> Añadir anticuerpo primario anti-BrdU (1: 500 dilución) diluido en 1% de leche seca no grasa en PBST y se incuba el blot con el anticuerpo primario durante 3 horas a RT en un agitador. Se lava la membrana con PBST tres veces después de la incubación del anticuerpo primario. </li><li> Añadir anti-ratón anticuerpo secundario conjugado con HRP a la blot (1: 5000 dilución) y se incuba a RT durante 1 hr. Lavar la membrana con PBST tres veces después de la incubación del anticuerpo secundario. NOTA: Utilice un volumen suficiente de los anticuerpos para cubrir completamente la membrana durante incubaciones de anticuerpos primarios y secundarios. </li></ol></li><li> Preparar la mezcla de ECL y agregarlo a la ac blotacuerdo con el protocolo del fabricante. Incubar la membrana con la mezcla de ECL durante 5 min a RT. <ol><li> Colocar la membrana en un casete de rayos X, exponer la membrana a la película de rayos X y desarrollar el blot utilizando el protocolo del fabricante. </li><li> Cuantificar la señal obtenida para la entrada y el ADN chiped después de escanear las manchas utilizando la imagen J software de acuerdo con el protocolo del fabricante. Para la cuantificación, utilizar la señal que está dentro del intervalo lineal de detección con el fin de asegurar la exactitud de la medición. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Podhorecka, M., Skladanowski, A., Bozko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H2AX+Phosphorylation%3A+Its+Role+in+DNA+Damage+Response+and+Cancer+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+nucleic+acids%22%5BJournal%5D)">H2AX Phosphorylation: Its Role in DNA Damage Response and Cancer Therapy.</a> J nucleic acids. , (2010).</li>
<li>Groth, A., Rocha, W., Verreault, A., Almouzni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+challenges+during+DNA+replication+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Chromatin challenges during DNA replication and repair.</a> 128, 721-733 (2007).</li>
<li>Demeret, C., Vassetzky, Y., Mechali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+remodelling+and+DNA+replication%3A+from+nucleosomes+to+loop+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Chromatin remodelling and DNA replication: from nucleosomes to loop domains.</a> Oncogene. 20, 3086-3093 (2001).</li>
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<li>Bhaskara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+deacetylases+1+and+2+maintain+S-phase+chromatin+and+DNA+replication+fork+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics+Chromatin%22%5BJournal%5D)">Histone deacetylases 1 and 2 maintain S-phase chromatin and DNA replication fork progression.</a> Epigenetics Chromatin. 6, 27(2013).</li>
<li>Bhaskara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hdac3+is+essential+for+the+maintenance+of+chromatin+structure+and+genome+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Hdac3 is essential for the maintenance of chromatin structure and genome stability.</a> Cancer Cell. 18, 436-447 (2010).</li>
<li>Johnson, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDAC1%2C2+inhibition+impairs+EZH2-+and+BBAP-mediated+DNA+repair+to+overcome+chemoresistance+in+EZH2+gain-of-function+mutant+diffuse+large+B-cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">HDAC1,2 inhibition impairs EZH2- and BBAP-mediated DNA repair to overcome chemoresistance in EZH2 gain-of-function mutant diffuse large B-cell lymphoma.</a> Oncotarget. 6, 4863-4887 (2015).</li>
<li>Bhaskara, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+deacetylases+1+and+2+regulate+DNA+replication+and+DNA+repair%3A+potential+targets+for+genome+stability-mechanism-based+therapeutics+for+a+subset+of+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Histone deacetylases 1 and 2 regulate DNA replication and DNA repair: potential targets for genome stability-mechanism-based therapeutics for a subset of cancers.</a> Cell Cycle. 14, 1779-1785 (2015).</li>
<li>Taddei, A., Roche, D., Sibarita, J. B., Turner, B. M., Almouzni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duplication+and+maintenance+of+heterochromatin+domains%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Duplication and maintenance of heterochromatin domains.</a> J Cell Biol. 147, 1153-1166 (1999).</li>
<li>Alabert, C., Groth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+replication+and+epigenome+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Chromatin replication and epigenome maintenance.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 13, 153-167 (2012).</li>
<li>Clapier, C. R., Cairns, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+ISWI+involves+inhibitory+modules+antagonized+by+nucleosomal+epitopes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Regulation of ISWI involves inhibitory modules antagonized by nucleosomal epitopes.</a> Nature. 492, 280-284 (2012).</li>
<li>Sirbu, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+protein+dynamics+at+active%2C+stalled%2C+and+collapsed+replication+forks%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Analysis of protein dynamics at active, stalled, and collapsed replication forks.</a> Genes Dev. 25, 1320-1327 (2011).</li>
</ol>

No tengo intereses financieros en competencia.

El protocolo se describe en este manuscrito es un método relativamente rápido para demostrar la presencia de las proteínas o sus formas modificadas post-traduccionalmente en el ADN recién replicado o naciente. Además, esta técnica permite que un para medir la cinética de asociación-disociación de una proteína o su forma modificada con el ADN naciente. Esta técnica es complementaria a la tecnología elegante ipond 13. En la tecnología ipond, ADN recién sintetizado se etiqueta con acetato de desoxiuridina (EDU)....

La reparación del ADN defectuoso y / o la replicación del ADN son una causa principal de la inestabilidad del genoma, lo que puede desencadenar la muerte celular. Una sola sin reparar rotura de doble cadena es suficiente para causar la muerte celular 1. Organización de la cromatina se altera transitoriamente tanto durante la replicación y la reparación de 2,3, y el fracaso para mantener la información epigenética durante estos procesos se traducirá en una amenaza para la integridad del genoma. Pérdida de HDAC3 o función HDAC1,2 impide la progresión de la fase S, la replicación y reparación del ADN que conduce a estrés genotóxico (daño en el ADN) y la muerte celular 4-9. Es por lo tanto una estrategia práctica para usar inhibidores de HDAC selectivos para interrumpir la replicación, reparación y la cromatina en las células cancerosas y causar daño en el ADN, que a su vez puede detener el crecimiento y la muerte celular selectivamente inducir en las células cancerosas que crecen rápidamente. Durante la replicación del ADN, la cromatina se desmonta rápidamente y luego se vuelve a montar después de la duplicación del ADN. Recién syhistona H4 nthesized es acetilada en K5 y K12 residuos (H4K5K12ac) y después de la deposición sobre la cromatina, se deacetylated rápidamente por desacetilasas de histonas (HDAC) 10,11. El fracaso de las células para mantener la integridad de la cromatina naciente por desacetilación de histonas puede conducir al colapso tenedor, que a su vez puede dar lugar a daños en el ADN y la muerte celular. Recientemente hemos demostrado que la inhibición selectiva de HDAC1,2 aumenta la acetilación de histonas (H4K5ac, H4K12ac y H4K16ac) e inhibe la actividad smarca5 remodelador de cromatina en la cromatina naciente, que se correlaciona con una menor progresión de tenedor de replicación, aumentamos colapso tenedor y el aumento de la replicación del daño en el ADN inducido por el estrés 6 . Así, el tratamiento inhibidor de HDAC puede alterar la estructura de cromatina naciente para desencadenar el daño del ADN y la muerte muy rápidamente en las células cancerosas, ya que estos ciclo de las células rápidamente y pasar muchas veces a través de la fase S. Por tanto, es importante entender cómo las HDAC funcionan para regular la acetilación de histonas y proteínas binding para mantener la replicación del ADN en células de mamífero. Para medir cuantitativamente la cantidad de acetilación de histonas y smarca5 remodelador de cromatina asociada con el ADN naciente durante la replicación del ADN, ideamos un chip de ensayo modificado llama la técnica de BrdU-chip-Slot-occidental. Después de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) de una modificación de la proteína o histona se desea, la cantidad de ADN naciente (marcó usando análogo de la timidina, BrdU) en la muestra de chip puede ser detectado mediante análisis de Western de DNA chip BrdU marcado con transfirió a una membrana usando un Slot aparato Blot. Mediante esta técnica, se demostró que H4K16ac (una marca implicada en el embalaje de la cromatina) y el miembro de la familia ISWI smarca5 (actina dependiente regulador de la matriz asociada relacionada con el SNF SWI / de la cromatina) remodelador de cromatina se asocian con el ADN naciente en las células en fase S 6. También se encontró que la marca naciente H4K16ac se desacetila por HDAC1,2 durante la replicación del ADN 6. Inhibe H4K16acactividad remodelador de cromatina del familiar ISWI smarca5 12. Por lo tanto, utilizando la técnica de BrdU-CHIP-Slot-Western, podríamos conectar las funciones para HDAC1,2 en la regulación de remodelación de la cromatina durante la replicación del ADN. Por lo tanto, la técnica BrdU-chip-Slot-Western Blot es un enfoque poderoso para medir cuantitativamente la dinámica de asociación y disociación de proteínas o sus modificaciones posteriores a la traducción que se unen al ADN naciente.

<table><tbody><tr><td>Anti-BrdU (westerns)</td><td>BD Biosciences</td><td>B555627</td><td></td></tr><tr><td>Anti-SMARCA5</td><td>Abcam</td><td>ab3749</td><td></td></tr><tr><td>Anti-H4K16ac</td><td>Motivo activo</td><td>39167</td><td></td></tr><tr><td>Zeta-Probe GT Membrana</td><td>Bio-Rad</td><td>162-0197</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehído</td><td>Fisher</td><td>BP531-500</td><td></td></tr><tr><td>Proteína A agarosa</td><td>Millipore</td><td>16-156</td><td></td></tr><tr><td>Rnasa</td><td>A Qiagen</td><td>19101</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasa K</td><td>Sigma</td><td>P4850</td><td></td></tr><tr><td>PCR Kit de purificación</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>G7403</td><td></td></tr><tr><td>Cóctel inhibidor de proteasa</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>BrdU</td><td>Sigma</td><td>B9285</td><td></td></tr><tr><td>Conejo IgG& nbsp;</td><td>Millipore</td><td>12-370</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S-3014</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Sigma</td><td>93443</td><td></td></tr><tr><td>NP40</td><td>USB Corporation</td><td>19628</td><td></td></tr><tr><td>Desoxicolato de sodio</td><td>Sigma</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio</td><td>Sigma</td><td>S-4019</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Etanol Decon Laboratories</td><td>04-355-222</td><td></td></tr><tr><td>Agua tratada con DEPC</td><td>Sigma</td><td>95284</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Fisher</td><td>BP-152-5</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Ambion</td><td>AM9820</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio</td><td>Mallinckrodt GenAR&nbsp;</td><td>MAL7772-06</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC</td><td>Life Technologies</td><td>15557-036</td><td></td></tr><tr><td>Leche en polvo descremada</td><td>Lab Scientific Inc</td><td>M0841</td><td></td></tr><tr><td>ECL</td><td>Thermo Fisher</td><td>80196</td><td></td></tr><tr><td>Película de rayos X</td><td>Genesee Sci</td><td>30-101</td><td></td></tr><tr><td>Revelador</td><td>Konica Minolta</td><td>SRX-101A</td><td></td></tr><tr><td>Reticulante UV</td><td>Stratagene</td><td>XLE-1000</td><td></td></tr><tr><td>Sonificador</td><td>Branson Sonicator &nbsp; Disruptor de célula ultrasónico digital</td><td>Modelo: centrífuga 450</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Modelo Eppendorf</td>: <td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Baño de agua</td><td>Fisher Scientific Isotemp</td><td>Modelo: 2322</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotómetro NanoDrop 1000</td><td>Modelo ThermoScientific</td><td>: Aparato de transferencia de ranura 1000</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Schleicher and Schuell Minifold II</td><td>44-27570</td><td></td></tr><tr><td>incubadora de cultivo de tejidos</td><td>Thermo Scientific</td><td>Series II 3110 Incubadoras</td><td></td> de CO2 con camisa de agua</tr></tbody></table>

el examen de las proteínas unidas al adn naciente en células de mamífero utilizando brdu-chip-slot-occidental técnica

Examination of Proteins Bound to Nascent DNA in Mammalian Cells Using  BrdU-ChIP-Slot-Western Technique

Histonas desacetilasas 1 y 2 (HDAC1,2) localizar a los sitios de la replicación del ADN. En el estudio anterior, el uso de un inhibidor selectivo y un sistema de caída genética, mostramos funciones novedosas para HDAC1,2 en la replicación del tenedor progresión y mantenimiento de la cromatina naciente en células de mamífero. Además, se utilizó una técnica de BrdU-chip-Slot-occidental que combina la cromatina immunoprecipitation (CHIP) de bromo-desoxiuridina (BrdU) ADN marcado con con slot blot y análisis Western para medir cuantitativamente las proteínas o modificación de las histonas asociadas con el ADN naciente. Activamente células que se dividen fueron tratados con HDAC1,2 inhibidor selectivo o transfectadas con siRNAs contra HDAC1 y HDAC2 y luego ADN recién sintetizado se marcó con el análogo de la timidina bromodesoxiuridina (BrdU). El etiquetado BrdU se realizó en un punto de tiempo cuando no había detención del ciclo celular o apoptosis significativa debido a la pérdida de las funciones HDAC1,2. Después de lAbeling de las células con BrdU, inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP) de las marcas de acetilación de histonas o la cromatina-remodelador se realizó con anticuerpos específicos. El ADN de entrada BrdU-etiquetado y la immunoprecipitated (o chiped) ADN fue descubierto en una membrana utilizando la técnica de transferencia de ranura y inmovilizaron utilizando UV. La cantidad de ADN naciente en cada ranura a continuación, se evaluó cuantitativamente utilizando el análisis de Western con un anticuerpo anti-BrdU. A continuación, el efecto de la pérdida de las funciones HDAC1,2 sobre los niveles de ADN asociado a histonas marcas de acetilación recién sintetizadas y remodelador de la cromatina se determinó mediante la normalización de la señal BrdU-Chip obtenido a partir de las muestras tratadas a las muestras de control.

Para determinar la especificidad de los inhibidores selectivos HDAC1,2, se utilizaron Hdac1,2 FL / FL y HDAC3 FL / FL células de fibrosarcoma. Se utilizó la recombinasa Cre (Ad-Cre) que contiene Adenovirus-eliminar Hdac1,2 y HDAC3 en estas células. Después de la infección Ad-Cre de Hdac1,2 FL / FL células, se observó un fuerte incremento en H4K5ac. El tratamiento de células knockout Hd...

En este protocolo, describimos una novedosa técnica BrdU-ChIP-Slot-Western para examinar proteínas y modificaciones de histonas asociadas con ADN recién sintetizado o naciente.

El examen de las proteínas unidas al ADN naciente en células de mamífero utilizando BrdU-chip-Slot-occidental Técnica

Histone deacetylases 1 and 2 (HDAC1,2) localize to the sites of DNA replication. In the previous study, using a selective inhibitor and a genetic ...

El objetivo general de este procedimiento es examinar rápidamente las proteínas unidas al ADN naciente con precisión utilizando el marcaje de BrdU y la precipitación de cromatina. Este método puede responder preguntas clave en el campo de la replicación, reparación en el campo de la cromatina, como qué proteínas se unen al ADN naciente durante la replicación del ADN y qué proteínas de reparación se unen al ADN naciente durante el estrés de replicación. La principal ventaja de esta técnica es que es un método relativamente rápido para detectar proteínas unidas al ADN naciente de una manera altamente cuantitativa.Para comenzar, configure cultivos de dos millones de células NIH 3T3 en 10 mililitros de medio con DMSO o inhibidores. Además, agregue BrdU a una concentración final de 20 micromolares. Una vez emplatadas, incubar las células durante 60 minutos.Después de una hora, entrecruza las proteínas intracelulares con el ADN añadiendo formaldehído directamente al medio de cultivo hasta una concentración del 1% en volumen. Luego, deje que las células se incuben a temperatura ambiente durante 10 minutos con agitación. Después de 10 minutos, apague la reacción agregando glicina al medio

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JoVE Journal

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Biología

Determinar la posición del ciclo celular de una población de células, o la comprensión de cómo afectan a la proliferación de señales, puede ser fácilmente medido por citometría de flujo utilizando este protocolo. Se presenta un enfoque simple experimental para la tinción de células y la cuantificación de su posición en el ciclo celular.

Análisis de la posición del ciclo celular en células de mamífero

Un método cuantitativo para el análisis de sincronización cromosoma replicación se describe. El método utiliza la incorporación de BrdU en combinación con...

Replicación del cromosoma Timing Combinado con fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; La hibridación

Este vídeo describe el protocolo para la tinción de inmunofluorescencia BrdU. La técnica permite la identificación de células en diferentes fases del ciclo celular. La adición de colorantes de ADN y el marcaje de anticuerpos permite el análisis detallado del destino de las células de la fase S en momentos posteriores.

Tinción de inmunofluorescencia BrdU: una técnica para identificar células en diferentes fases del ciclo celular

Este artículo de vídeo describe un método de microarrays basado en vitro para determinar los objetivos de genes y sitios de unión para dos reguladores de respuesta del sistema de componentes.

Purificado de ADN afinidad Chip (DAP-chip) Método para determinar los objetivos de genes para bacteriana Dos Sistemas Regulatorios componentes

Estudiar la cinética de reparación de daños de ADN requiere un sistema para inducir lesiones en regiones definidas del nucleares. Se describe un método para crear localizados roturas de doble cadena utilizando un microscopio confocal de escaneo láser equipado con un 405 nm láser y procedimientos automatizados para cuantificar la dinámica de los factores de reparación de estas lesiones.

Investigación de reclutamiento de la proteína a las lesiones del ADN usando 405 Nm láser Micro-irradiación

Ribonucleótidos están entre los nucleótidos no canónico más abundantes incorporados en el genoma durante la replicación del ADN nuclear eucariótica. Si no quitado, ribonucleótidos pueden causar mutagénesis y daño de la DNA. Presentamos dos enfoques experimentales que se utilizan para evaluar la abundancia de incorporación ribonucleótido en ADN y sus efectos mutagénicos.

Estudio incorporación de ribonucleótido: Filamento específicos detección de ribonucleótidos en el genoma de levadura medir mutagénesis inducida por la ribonucleótido

En el presente protocolo, demostramos cómo visualizar la resección final de doble cadena de ADN durante la fase S / G2 del ciclo celular utilizando un método basado en inmunofluorescencia.

Evaluación de la resección final global de DOBLE cadena de ADN utilizando el etiquetado brdU-DNA junto con imágenes de discriminación del ciclo celular

El presente protocolo destaca un método modificado para detectar y cuantificar los enlaces cruzados ADN-proteína (DPCs) y sus modificaciones postraduccionales (PTMs), incluyendo la ubiquitilación, la SUMOilación y la ADP-ribosilación inducida por inhibidores de la topoisomerasa y por formaldehído, permitiendo así el estudio de la formación y reparación de DPCs y sus PTMs.

Detección cuantitativa de enlaces cruzados ADN-proteína y sus modificaciones postraduccionales

El siguiente protocolo presenta la detección de focos de ADN monocatenario en la fase G1 del ciclo celular utilizando la sincronización del ciclo celular seguida de la tinción inmunofluorescente de RPA2.

Visualización de focos de ADN monocatenario en la fase G1 del ciclo celular

El enriquecimiento y secuenciación del ADN naciente asociado a proteínas (eSPAN) se desarrolló para detectar la abundancia relativa de una proteína asociada a la cromatina en dos cadenas de ADN replicantes, revelando así una visión molecular sobre la replicación de la cromatina y sus procesos acoplados. Este protocolo describe los procedimientos eSPAN en células madre embrionarias (ES) de levaduras y ratones.

Análisis específico de hebras de proteínas en cadenas replicantes de ADN mediante el enriquecimiento y secuenciación del método de ADN naciente asociado a proteínas

Los trastornos de la laminopatía a menudo conducen a cambios en la envoltura nuclear, lo que puede causar ampollas y fugas nucleares. Este estudio presenta un método de inmunofluorescencia para visualizar la lámina nuclear junto con el ADN bicatenario (dsDNA), proporcionando un medio para evaluar la estructura nuclear y la integridad en células de mamíferos.

Detección de ampollas nucleares y fugas de ADN en células de mamíferos mediante inmunofluorescencia

Aprende a examinar proteínas unidas al ADN naciente en células de mamífero mediante la técnica BrdU-ChIP-Slot-Western. Este método cuantitativo permite detectar interacciones proteicas durante la replicación y reparación del ADN.

El examen de las proteínas unidas al ADN naciente en células de mamífero utilizando BrdU-chip-Slot-occidental Técnica

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