Lapso de tiempo-microscopía de vídeo para la Evaluación de EYFP-Parkin agregación como un marcador para celular mitofagia

El objetivo general de esta microscopía de video con lapso de tiempo es rastrear la eliminación selectiva de mitocondrias dañadas mediada por Parkin durante el proceso de mitofagia. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del metabolismo molecular, como cómo afecta la mitofagia a condiciones patológicas persistentes. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona una herramienta muy potente para seguir la dinámica de proteínas marcadas durante sus procesos moleculares.

Este método puede proporcionar información sobre el ciclo vital mitocondrial. También puede aplicarse a otros sistemas, como cultivos celulares primarios, estudios de embriología y predicción de una prioridad. Los fibroblastos embrionarios de ratón inmortalizados utilizados en este estudio se cultivan en medio DMEM completo en una placa de cultivo de tejidos de diez centímetros de diámetro a 37 grados Celsius en una atmósfera humedecida que contiene cinco por ciento de dióxido de carbono.

Cuando las células alcancen una confluencia del 80 por ciento, deseche el medio mediante succión estéril y agregue diez mililitros de PBS estéril. Retire el PBS y agregue un mililitro de tripsina-EDTA al 0,25 por ciento. Incube la placa a 37 grados Celsius durante dos a tres minutos hasta que las células se desprendan.

Añada cuatro mililitros de medio DMEM completo y re suspenda las células. Retire diez microlitros de la suspensión celular para el recuento con un hemocitómetro. Siembre uno por diez a la sexta potencia de células en un recipiente de cultivo tisular de diez centímetros y incube durante 24 horas.

Al día siguiente, lave las células una vez con PBS y desprenda las células mediante tripsinización, como se demostró anteriormente. Añada cuatro mililitros de medio DMEM completo, re-suspenda las células y transfiera la suspensión celular a un tubo de 15 mililitros. Centrifugue las células a 250 gs y cuatro grados Celsius durante cinco minutos.

Deseche el sobrenadante y resuspenda el precipitado en un mililitro de PBS estéril. Centrifugue las células nuevamente. Deseche el sobrenadante después de la segunda centrifugación.

Añada 100 microlitros de la mezcla de solución para electroforesis al precipitado celular y re suspenda suavemente el precipitado mediante pipeteo. Luego, agregue a la suspensión celular dos microgramos del plásmido de expresión de EYFP Parkin y un microgramo del plásmido de expresión de DsRed2 Mito. Utilice la pipeta Pasteur desechable para transferir la solución a una cubeta estéril.

Electroporar las células utilizando un programa preestablecido. Inmediatamente después de la electroporación, añadir 500 microlitros de medio DMEM completo fresco, previamente calentado, a las células y sembrar las células en una placa de cultivo de tejidos de seis centímetros de calidad para imágenes en vivo.

Incube las células en una atmósfera humedecida que contenga cinco por ciento de dióxido de carbono a 37 grados Celsius durante 24 horas. Antes de comenzar este procedimiento, ajuste la temperatura de la cámara del microscopio a 37 grados Celsius. A continuación, prepare un medio específico para imágenes en vivo mezclando lo siguiente: DMEM sin fenol suplementado con diez por ciento de suero bovino fetal, dos milimolares por litro de L-glutamina, 100 unidades por mililitro de penicilina y 100 miligramos por mililitro de estreptomicina.

Caliente previamente el medio a 37 grados Celsius en un baño de agua. Descarte el medio de las células electropermeabilizadas mediante succión estéril y agregue un mililitro de medio precalentado para imágenes en vivo. Incube la placa durante 30 minutos a 37 grados Celsius.

Después de confirmar que la cámara del microscopio se encuentra a una temperatura estable de 37 grados Celsius, introduzca un 5 % de dióxido de carbono en la cámara. Coloque cuidadosamente, sin movimientos bruscos ni oscilaciones, la placa con las células electro poradas dentro de la cámara del microscopio.

Mediante la interfaz del software, configure el microscopio para detectar las señales fluorescentes de las proteínas de fusión codificadas por los vectores de expresión EYFP Parkin y DsRed2 Mito. Abra el software de microscopía de video con lapse de tiempo. En el menú superior, seleccione FITC para EYFP Parkin y Rhodamine para DsRed2 Mito.

Seleccione un aumento de 20X. Mediante la interfaz del software, busque una sola célula que exprese ambos vectores codirigidos y registre la posición. Haga esto con un mínimo de 10 células para cada condición experimental.

Seleccione el menú, Aplicaciones y haga clic en, Adquisición Multidimensional. En la ventana de Adquisición Multidimensional, seleccione los parámetros necesarios, como el número de adquisiciones, el intervalo de tiempo entre cada adquisición y la posición de la célula registrada. Haga clic en, Adquirir para comenzar la adquisición basal de ambas señales fluorescentes.

Recolecte imágenes cada cinco minutos durante un intervalo total de quince minutos. Mientras se realiza la adquisición de imágenes, prepare el medio de imagen en vivo precalentado que contenga cianuro de carbonilo 4 trifluorometoxi fenilhidrazona, o FCCP, a una concentración dos veces superior a la concentración final de trabajo. Interrumpa el proceso de adquisición y agregue suavemente un mililitro del medio de imagen en vivo precalentado con FCCP en la placa dentro de la cámara del microscopio.

Después de agregar FCCP, es importante volver a enfocar el microscopio antes de reiniciar la adquisición de imágenes. Reinicie el proceso de adquisición como se describió anteriormente y recopile imágenes durante un período total de tres horas utilizando la posición registrada. Cuando la adquisición de imágenes haya finalizado, guarde todas las imágenes adquiridas para su análisis posterior.

Se muestran aquí imágenes de lapso de tiempo de las señales fluorescentes de EYFP-Parkin y DsRED2-Mito en fibroblastos antes de la administración de FCCP. Los recuadros blancos representan las áreas ampliadas de los respectivos paneles a la derecha. Durante los puntos de tiempo basales, EYFP-Parkin, visualizado en verde, está difuso de manera homogénea en toda la célula.

La red de mitocondrias, visualizada en rojo, parece estar bien interconectada, como indican las flechas blancas. Tras la administración de FCCP, se observa la fragmentación de las mitocondrias debido a la desolarización de la membrana a los cinco minutos. Sin embargo, EYFP-Parkin aún está difuso de manera homogénea en todo el citoplasma.

A los 55 minutos posteriores a la administración de FCCP, EYFP-Parkin se recluta a las membranas mitocondriales dañadas para desencadenar el proceso de mitofagia. El movimiento de EYFP-Parkin hacia la membrana mitocondrial tras la administración de FCCP se muestra en esta película representativa de lapsos de tiempo. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en dos horas si se lleva a cabo correctamente.

Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la autofagia experimentaran el reciclaje mitocondrial. Permite a las células estudiar el proceso de mitofagia como un mecanismo de control de calidad mitocondrial en las células.