Name: Lapso de tiempo-microscopía de vídeo para la Evaluación de EYFP-Parkin agregación como un marcador para celular mitofagia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Aprende microscopía de lapso de tiempo para evaluar la agregación de EYFP-Parkin como marcador de mitofagia celular. Este método permite rastrear la eliminación selectiva de mitocondrias dañadas en fibroblastos embrionarios de ratón.

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Este trabajo fue financiado en parte por subvenciones de los NIH (1R01CA137494, R01CA132115, R01CA086072 a R.G.P.), el Centro Oncológico Kimmel P30CA056036 de subvención principal del Centro Oncológico de los NIH (R.G.P.), una subvención de la Fundación para la Investigación del Cáncer de Mama, generosas subvenciones del Dr. Ralph y Marian C. Falk Medical Research Trust (R.G.P.) y una subvención del Departamento de Salud de Pensilvania (R.G.P.). En parte, este trabajo fue financiado por una beca postdoctoral (G.D.) de la American Italian Cancer Foundation y Bioimaging Shared Resource del Sidney Kimmel Cancer Center (NCI 5, P30, CA-56036). El Departamento renuncia específicamente a la responsabilidad por un análisis, interpretaciones o conclusiones. No hay conflictos de intereses asociados con este manuscrito.

1. La electroporación de fibroblastos con ambos vectores de expresión EYFP-Parkin y pDsRed2-Mito <ol><li> Cultivar las células de fibroblastos de embriones de ratón inmortalizada en 10 centímetro placa de cultivo de tejidos utilizando DMEM (medio de Eagle modificado por Dulbecco) suplementado con 10% de suero fetal bovino, 2 mmol / l de L-glutamina, 100 U / ml de penicilina, y 100 mg / ml estreptomicina en una atmósfera humidificada que contiene 5% de CO 2 a 37 ° C. <ol><li> En la confluencia de células 80%, desechar el medio DMEM completo por succión estéril y añadir 10 ml de solución tampón de fosfato 1x estéril (PBS) (80 g de NaCl, 2,0 g de KCl, 14,4 g de Na 2 HPO 4, 2,4 g de KH 2 PO 4 y 1 L de H2O destilada, pH: 7,4). </li><li> Desechar el PBS mediante aspiración estéril y añadir 1 ml de tripsina-EDTA 0,25%. Incubar la placa a 37 ° C hasta que las células se separan (2-3 min). Añadir 4 ml de medio DMEM completo, volver a suspender las células y sacar 10 _6; l de la suspensión celular para el recuento hemocitómetro. NOTA: El hemocitómetro está diseñado de modo que el número de células en un conjunto de 16 cuadrados de las esquinas es equivalente al número de células x 10 4 / ml. </li></ol></li><li> Seed 1 x 10 6 células en 10 cm placas de cultivo de tejidos de 24 horas antes del proceso de electroporación. </li><li> Descartar el medio DMEM completo por succión estéril y añadir 10 ml de PBS estéril. Desechar el PBS mediante aspiración estéril y añadir 1 ml de tripsina-EDTA 0,25%. Incubar la placa a 37 ° C hasta que las células se separan (2-3 min). Añadir 4 ml de medio completo DMEM y resuspender las células en un tubo de 15 ml. </li><li> Girar las células hacia abajo a 250 xg durante 5 min usando una centrífuga refrigerada (4 ° C). Eliminar el sobrenadante por aspiración estéril y resuspender el precipitado en 1 ml de PBS estéril. Girar las células hacia abajo a 250 g durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Eliminar el sobrenadante por aspiración estéril, y añadir 100 l Of mezcla de solución para la electroporación (82 l de solución de electroporación V + 18 l de solución Suplementaria 1) al sedimento celular y resuspender suavemente el precipitado pipeteando (Para más detalles, consulte el Manual del usuario). Añadir 2 g de EYFP-Parkin (excitación / emisión 514/527) y 1 g pDsRed2-Mito (excitación / emisión 565/620) a la suspensión celular. </li><li> Transferir la solución a la cubeta estéril utilizando un pasteur desechable (ambas herramientas se proporcionan con el kit) y electroporación utilizando el programa pre-establecido NIH / 3T3 T-030 (solo pulso, tensión de 200 V, la capacitancia 960 mF, tiempo de pulso de 20 milisegundos , el número de impulsos: 1). </li><li> Inmediatamente después de la electroporación, añadir 500 l de medio DMEM completo pre-calentado fresco y sembrar la célula en un 6 cm de la placa de cultivo de tejidos en vivo de imágenes de grado y los incuban en una atmósfera humidificada que contiene 5% de CO 2 a 37 ° C durante 24 horas. </li></ol> 2. Tiempo-Lapso de microscopía de vídeo <ol><li&gt; Ajuste la temperatura de la cámara del microscopio a 37 ° C antes de su uso. </li><li> En este punto, preparar un medio específico de formación de imágenes en vivo de proceder con el protocolo experimental. Prepare el soporte de imágenes en vivo de la siguiente manera; mezclar DMEM-fenol libre suplementado con 10% de suero bovino fetal, 2 mmol / l de L-glutamina, 100 U / ml de penicilina, y 100 mg / ml de estreptomicina. Pre-calentar el medio de imágenes en vivo a 37 ° C en un baño de agua. </li><li> Descartar el medio de las células sometidas a electroporación por aspiración estéril y añadir 1 ml de medio de imágenes en vivo pre-calentado, utilizando una pipeta P1000 e incubar la placa durante 30 minutos a 37 ° C. </li><li> Durante el período de placa de incubación, afluencia 5% de CO 2 en la cámara del microscopio ya a una temperatura estable de 37 ° C. </li><li> Coloque la placa con las células a electroporación en la cámara del microscopio evitando movimientos u oscilaciones importantes. </li><li> Mediante la interfaz de software, configurar el microscopio con el fin de detectar tanto Fluoreseñales scence de las proteínas de fusión codificadas por los vectores de co-transfectadas, EYFP-Parkin (rango de excitación de 495 a la 510 nm y el rango de emisión 520 a la 550 nm, verde) y el pDsRed2-Mito (máximo de excitación 558 nm y emisión máxima de 583 nm, rojo). <ol><li> Abra el software de microscopía de vídeo de lapso de tiempo. En el menú superior seleccionar el FITC para EYFP-Parkin y rodamina para pDsRed2-Mito. En el menú superior seleccionar el aumento (20X). </li></ol></li><li> El uso de la interfaz de software, buscar la única célula que expresa ambos vectores co-transfectadas y registrar la posición. Repita este paso hasta un mínimo de 10 células se recoge para cada condición experimental (grupo experimental). <ol><li> Seleccione el menú &quot;Aplicaciones&quot; y haga clic en Multi Adquisición dimensional. En las ventanas de adquisición multidimensional seleccionar los parámetros necesarios, tales como el número de adquisiciones, el intervalo de tiempo entre cada adquisición y la posición de la célula registrada. Haga clic en &quot;Adquirir&quot;Para iniciar el proceso de adquisición. </li></ol></li><li> Iniciar la adquisición basal de ambos EYFP-Parkin y la señal fluorescente DsRed2-Mito recogida de imágenes cada 5 min durante un intervalo total de 15 min. </li><li> Para preparar el medio de imágenes en vivo pre-calentado con una concentración de FCCP dos veces mayor que la concentración final de trabajo (0,1 - 10 mM, dependiente del tipo de célula). </li><li> Interrumpir el proceso de adquisición y añadir suavemente 1 ml de medio de imágenes en vivo pre-calentado con FCCP en la placa dentro de la cámara del microscopio utilizando una pipeta P1000. </li><li> Reiniciar el proceso de adquisición, como se describe anteriormente, durante un periodo total de 3 horas, utilizando la posición de grabado. Guardar todas las imágenes adquiridas con el fin de analizarlas y crear un video del proceso mitophagic cuando la adquisición se ha terminado. </li></ol> 3. Análisis <ol><li> Recoge todas las imágenes adquiridas en formato &quot;tiff&quot; en un ordenador personal </li><li> Abrir las imágenes con un suave gráficoWare y definir el intervalo temporal se produjeron de la mitocondrial inducida por despolarización con FCCP a la primera imagen que muestra el reclutamiento de Parkin en la membrana mitocondrial (Las imágenes se adquieren cada 5 min). Repita este análisis para cada celda en el grupo experimental. </li><li> Etiquetar la primera celda de la columna en una hoja de cálculo con el nombre del grupo experimental. Para cada grupo experimental, medir los intervalos temporales para Parkin reclutamiento de un mínimo de 10 células. Hacer un promedio de los intervalos temporales calculadas para el reclutamiento Parkin y definir la desviación estándar para cada grupo experimental (media ± SD, n = 10). <ol><li> Organizar en columnas individuales de los intervalos temporales calculados. Cada columna contiene el n = 10 mediciones del grupo experimental. </li><li> Seleccione el &quot;promedio&quot; de la función en el menú de fórmulas. Seleccionar los datos de la columna. Seleccione la función &quot;desviación estándar&quot; en el menú de fórmulas. select los datos de la columna. </li></ol></li><li> El uso de un enfoque estadístico, comparar los grupos experimentales aplicando el estadístico apropiado con el fin de definir una diferencia significativa en la dinámica de mitofagia entre los grupos experimentales. (Por ejemplo, dos grupos = t de Student prueba, tres o más grupos = ANOVA más un test post-hoc) </li></ol>

<ol><li>Youle, R. J., Narendra, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of mitophagy.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 12, 9-14 (2011).</li>
<li>Zhi, X., Zhong, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Prime+Rep%22%5BJournal%5D)">Autophagy in cancer.</a> F1000Prime Rep. 7, 18(2015).</li>
<li>Ding, W. X., Yin, X. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitophagy%3A+mechanisms%2C+pathophysiological+roles%2C+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Mitophagy: mechanisms, pathophysiological roles, and analysis.</a> Biol Chem. 393, 547-564 (2012).</li>
<li>Lemasters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+mitochondrial+autophagy%2C+or+mitophagy%2C+as+a+targeted+defense+against+oxidative+stress%2C+mitochondrial+dysfunction%2C+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Rejuvenation+Res%22%5BJournal%5D)">Selective mitochondrial autophagy, or mitophagy, as a targeted defense against oxidative stress, mitochondrial dysfunction, and aging.</a> Rejuvenation Res. 8, 3-5 (2005).</li>
<li>Kissova, I., Deffieu, M., Manon, S., Camougrand, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uth1p+is+involved+in+the+autophagic+degradation+of+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Uth1p is involved in the autophagic degradation of mitochondria.</a> J Biol Chem. 279, 39068-39074 (2004).</li>
<li>Kubli, D. A., Gustafsson, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+and+mitophagy%3A+the+yin+and+yang+of+cell+death+control%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Mitochondria and mitophagy: the yin and yang of cell death control.</a> Circ Res. 111, 1208-1221 (2012).</li>
<li>Redmann, M., Dodson, M., Boyer-Guittaut, M., Darley-Usmar, V., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitophagy+mechanisms+and+role+in+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitophagy mechanisms and role in human diseases.</a> Int J Biochem Cell Biol. 53, 127-133 (2014).</li>
<li>Di Sante, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+sirt1+promotes+prostatic+intraepithelial+neoplasia%2C+reduces+mitophagy%2C+and+delays+park2+translocation+to+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Loss of sirt1 promotes prostatic intraepithelial neoplasia, reduces mitophagy, and delays park2 translocation to mitochondria.</a> Am J Pathol. 185, 266-279 (2015).</li>
<li>Tanaka, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkin-mediated+selective+mitochondrial+autophagy%2C+mitophagy%3A+Parkin+purges+damaged+organelles+from+the+vital+mitochondrial+network%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Parkin-mediated selective mitochondrial autophagy, mitophagy: Parkin purges damaged organelles from the vital mitochondrial network.</a> FEBS Lett. 584, 1386-1392 (2010).</li>
<li>Shiba-Fukushima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PINK1-mediated+phosphorylation+of+the+Parkin+ubiquitin-like+domain+primes+mitochondrial+translocation+of+Parkin+and+regulates+mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">PINK1-mediated phosphorylation of the Parkin ubiquitin-like domain primes mitochondrial translocation of Parkin and regulates mitophagy.</a> Sci Rep. 2, 1002(2012).</li>
<li>Trinh, J., Farrer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+genetics+of+Parkinson+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurol%22%5BJournal%5D)">Advances in the genetics of Parkinson disease.</a> Nat Rev Neurol. 9, 445-454 (2013).</li>
<li>Murphy, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+mitochondria+produce+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">How mitochondria produce reactive oxygen species.</a> Biochem J. 417, 1-13 (2009).</li>
<li>Heytler, P. G., Prichard, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+class+of+uncoupling+agents--carbonyl+cyanide+phenylhydrazones%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">A new class of uncoupling agents--carbonyl cyanide phenylhydrazones.</a> Biochem Biophys Res Commun. 7, 272-275 (1962).</li>
<li>Karan, G., Yang, Z., Zhang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+wild+type+and+mutant+ELOVL4+in+cell+culture%3A+subcellular+localization+and+cell+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">Expression of wild type and mutant ELOVL4 in cell culture: subcellular localization and cell viability.</a> Mol Vis. 10, 248-253 (2004).</li>
<li>Jin, S. M., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PINK1-+and+Parkin-mediated+mitophagy+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">PINK1- and Parkin-mediated mitophagy at a glance.</a> J Cell Sci. 125, 795-799 (2012).</li>
<li>Kerr, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualisation+of+macropinosome+maturation+by+the+recruitment+of+sorting+nexins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Visualisation of macropinosome maturation by the recruitment of sorting nexins.</a> J Cell Sci. 119, 3967-3980 (2006).</li>
<li>Edin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-D+gel+culture+and+time-lapse+video+microscopy+of+the+human+vestibular+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">3-D gel culture and time-lapse video microscopy of the human vestibular nerve.</a> Acta Otolaryngol. 134, 1211-1218 (2014).</li>
<li>Ramsden, A. E., Mota, L. J., Munter, S., Shorte, S. L., Holden, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SPI-2+type+III+secretion+system+restricts+motility+of+Salmonella-containing+vacuoles%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The SPI-2 type III secretion system restricts motility of Salmonella-containing vacuoles.</a> Cell Microbiol. 9, 2517-2529 (2007).</li>
<li>Meseguer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryo+incubation+and+selection+in+a+time-lapse+monitoring+system+improves+pregnancy+outcome+compared+with+a+standard+incubator%3A+a+retrospective+cohort+study%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil+Steril%22%5BJournal%5D)">Embryo incubation and selection in a time-lapse monitoring system improves pregnancy outcome compared with a standard incubator: a retrospective cohort study.</a> Fertil Steril. 98, 1481-1489 (2012).</li>
<li>Campbell, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+a+risk+classification+of+aneuploidy+in+human+embryos+using+non-invasive+morphokinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Biomed+Online%22%5BJournal%5D)">Modelling a risk classification of aneuploidy in human embryos using non-invasive morphokinetics.</a> Reprod Biomed Online. 26, 477-485 (2013).</li>
<li>Bingol, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+deubiquitinase+USP30+opposes+parkin-mediated+mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial deubiquitinase USP30 opposes parkin-mediated mitophagy.</a> Nature. 510, 370-375 (2014).</li>
<li>Carroll, R. G., Hollville, E., Martin, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkin+sensitizes+toward+apoptosis+induced+by+mitochondrial+depolarization+through+promoting+degradation+of+Mcl-1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Parkin sensitizes toward apoptosis induced by mitochondrial depolarization through promoting degradation of Mcl-1.</a> Cell Rep. 9, 1538-1553 (2014).</li>
<li>Batlevi, Y., La Spada, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+autophagy+in+neural+function%2C+neurodegenerative+disease%2C+neuron+cell+death%2C+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial autophagy in neural function, neurodegenerative disease, neuron cell death, and aging.</a> Neurobiol Dis. 43, 46-51 (2011).</li>
<li>Frank, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitophagy+is+triggered+by+mild+oxidative+stress+in+a+mitochondrial+fission+dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitophagy is triggered by mild oxidative stress in a mitochondrial fission dependent manner.</a> Biochim Biophys Acta. 1823, 2297-2310 (2012).</li>
<li>Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+into+mouse+lyoma+cells+by+electroporation+in+high+electric+fields%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields.</a> EMBO J. 1, 841-845 (1982).</li>
<li>Sugar, I. P., Neumann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+model+for+electric+field-induced+membrane+pores.+Electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+Chem%22%5BJournal%5D)">Stochastic model for electric field-induced membrane pores. Electroporation.</a> Biophys Chem. 19, 211-225 (1984).</li>
<li>Lemasters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variants+of+mitochondrial+autophagy%3A+Types+1+and+2+mitophagy+and+micromitophagy+%28Type+3%29%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biol%22%5BJournal%5D)">Variants of mitochondrial autophagy: Types 1 and 2 mitophagy and micromitophagy (Type 3).</a> Redox Biol. 2, 749-754 (2014).</li>
<li>Aggarwal, B. B., Quintanilha, A. T., Cammack, R., Packer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Damage+to+mitochondrial+electron+transport+and+energy+coupling+by+visible+light%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Damage to mitochondrial electron transport and energy coupling by visible light.</a> Biochim Biophys Acta. 502, 367-382 (1978).</li>
<li>Alexandratou, E., Yova, D., Handris, P., Kletsas, D., Loukas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+fibroblast+alterations+induced+by+low+power+laser+irradiation+at+the+single+cell+level+using+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem+Photobiol+Sci%22%5BJournal%5D)">Human fibroblast alterations induced by low power laser irradiation at the single cell level using confocal microscopy.</a> Photochem Photobiol Sci. 1, 547-552 (2002).</li>
<li>Kim, I., Lemasters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitophagy+selectively+degrades+individual+damaged+mitochondria+after+photoirradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Mitophagy selectively degrades individual damaged mitochondria after photoirradiation.</a> Antioxid Redox Signal. 14, 1919-1928 (2011).</li>
<li>Coutu, D. L., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+cellular+processes+by+long-term+live+imaging--historic+problems+and+current+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Probing cellular processes by long-term live imaging--historic problems and current solutions.</a> J Cell Sci. 126, 3805-3815 (2013).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La microscopía de lapso de tiempo se puede definir como la técnica que se extiende imágenes de células vivas de una sola observación en el tiempo a la observación de la dinámica celular durante largos períodos de tiempo. Esta metodología se distingue de un simple o confocal microscopia de células vivas, ya que permite al observador identificar en tiempo real una sola proteína fluorescente con etiquetas y siga su dinámica dentro de una sola célula viva. De hecho, la microscopía confocal puede identifica fácilmente proteí...

La macro autofagia es un proceso intracelular que implica la degradación catabólica de componentes celulares dañados y disfuncionales, como orgánulos y proteínas, con el propósito de reciclar o producir energía. Para iniciar este proceso metabólico, la célula engulle los componentes celulares dañados en una estructura de doble membrana, conocida como autofagosoma, que se fusiona con un lisosoma y su contenido se degrada y recicla 1,2. Hay dos tipos principales de autofagia, la no selectiva y la selectiva. El proceso de autofagia no selectiva ocurre cuando la célula se encuentra bajo condiciones de privación de nutrientes y necesita buscar nutrientes esenciales y energía. Sin embargo, la autofagia selectiva se produce para mediar la eliminación de orgánulos y proteínas disfuncionales/dañados que, de otro modo, podrían ser tóxicos. Uno de los procesos de autofagia selectiva más estudiados es la eliminación de mitocondrias, denominada mitofagia 1,3-5.
Las mitocondrias son los orgánulos centrales para el metabolismo celular y la fuente principal de trifosfato de adenosina (ATP) a través de la fosforilación oxidativa a través de la cadena de transporte de electrones, la oxidación de ácidos grasos y el ciclo del ácido tricarboxílico (TCA). Además, las mitocondrias regulan la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) y liberan proteínas que participan en las vías de muerte celular 6-8.
PTEN-quinasa putativa 1 (PINK1) y Parkin RBR E3 ubiquitina ligasa (Parkin) son las proteínas clave implicadas en el proceso de mitofagia. Parkin puede proteger contra la muerte celular al mantener la célula sana a través del control de calidad mitocondrial9. Tras la pérdida del potencial de membrana mitocondrial, la parkina citosólica es reclutada por PINK1 para las mitocondrias. Este reclutamiento desencadena los eventos secuenciales de la mitofagia 10. Existe una amplia gama de pruebas de que la mitofagia es un proceso fundamental de control de calidad de las mitocondrias y las anomalías en este proceso impulsan la enfermedad 7. Por ejemplo, la enfermedad de Parkinson autosómica recesiva se ha asociado con mutaciones en los genes que codifican para Parkin y PINK1 (PARK2 y PINK1, respectivamente) 11. El control de calidad de la salud mitocondrial es esencial para la eliminación de las mitocondrias que contribuyen a la acumulación de ROS12. La presencia excesiva de ROS intracelulares puede provocar daños tanto en el ADN nuclear como en el mitocondrial (ADN y ADN mt, respectivamente).
Aquí, mostramos un enfoque de microscopía de video de lapso de tiempo para seguir la agregación de Parkin después de la inducción de mitofagia mediada por Parkin en fibroblastos embrionarios de ratón inmortalizados a través de la administración in vitro de cianuro de carbonilo 4-(trifluorometoxi)-fenilhidrazona (FCCP), un agente de desacoplamiento. FCCP interrumpe la síntesis de ATP al cortocircuitar protones a través de la membrana mitocondrial externa y, por lo tanto, desacoplar la fosforilación oxidativa de la cadena de transporte de electrones 13. El desencadenamiento de la despolarización de la membrana mitocondrial conduce a la interrupción de las mitocondrias y a la eliminación selectiva dependiente de Parkin. Por lo tanto, la transfectación de las células de interés con un vector de expresión que codifica Parkin fusionado con un marcador fluorescente (proteína fluorescente amarilla mejorada, EYFP) se puede utilizar como una marca fluorescente para seguir el reclutamiento de Parkin durante el proceso mitofágico. Con el fin de visualizar las mitocondrias, co-transfectamos pDsRed2-Mito, que codifica la proteína fluorescente roja (DsRed2) que contiene una secuencia de diana mitocondrial de la subunidad VIII de la citocromo c oxidasa (Mito). pDsRed2-Mito está diseñado para el marcaje fluorescente de mitocondrias14. El tiempo requerido para la translocación de Parkin a la membrana mitocondrial se puede medir y proporciona una medida indirecta de la salud celular. Por ejemplo, podemos decir que si una línea celular eliminada para un gen particular de interés muestra un reclutamiento más rápido o más lento de Parkin después de la inducción de la mitofagia por FCCP, ese producto génico sería un jugador clave para mantener las tasas metabólicas de la célula en el estado fisiológico y prevenir el desarrollo de enfermedades. Por lo tanto, la microscopía de video de lapso de tiempo proporciona una herramienta muy poderosa para aplicaciones de investigación básica y clínica para seguir la dinámica de las proteínas marcadas durante sus procesos moleculares y comprender cómo se ven afectados estos procesos durante una condición patológica.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Corning Life Science</td><td>10-013-CV</td><td>Precalentamiento en 37 &#176; C antes</td></tr><tr><td>de usar DMEM sin fenol</td><td>Corning Life Science</td><td>17-205-CV</td><td>Precalentar a 37 &#176; C antes de usar</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442</td><td>Precalentamiento a 37 &#176; C antes</td></tr><tr><td>de usar L-Glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030</td><td>Precalentar a 37 &#176; C antes de usar</td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina</td><td>Corning Life Science</td><td>30-002-CI</td><td>Precalentamiento a 37 &#176; C antes de usar</td></tr><tr><td>el vector de expresión EYFP-PARKIN</td><td>Addgene</td><td>23955</td><td></td></tr><tr><td>pDsRed2-Mito vector de expresión</td><td>Clontech</td><td>632421</td><td></td></tr><tr><td>Nucleofector 2B dispositivo</td><td>LONZA</td><td>AAD-1001S</td><td></td></tr><tr><td>Nucleofector para kit R NIH/3T3</td><td>LONZA</td><td>VCA-1001</td><td></td></tr><tr><td>ZEISS AXIOVERT 200M microscopio invertido</td><td>CARL ZEISS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cianuro de carbonilo 4-(trifluorometoxi)-fenilhidrazona (FCCP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2920</td><td></td></tr><tr><td>MetaMorph</td><td>Molecular</td><td>Devices Constructor</td><td></td>experimental</tr><tr><td>ImageJ</td><td>Instituto Nacional de Salud</td><td>Constructor experimental</td><td></td></tr></tbody></table>

lapso de tiempo-microscopía de vídeo para la evaluación de eyfp-parkin agregación como un marcador para celular mitofagia

Time-Lapse Video Microscopy for Assessment of EYFP-Parkin Aggregation as a Marker for Cellular Mitophagy

La microscopía de video time-lapse se puede definir como la obtención de imágenes en tiempo real de células vivas. Esta técnica se basa en la recopilación de imágenes en diferentes puntos temporales. Los intervalos de tiempo se pueden establecer a través de una interfaz de computadora que controla la cámara integrada en el microscopio. Este tipo de microscopía requiere tanto la capacidad de adquirir eventos muy rápidos como la señal generada por la estructura celular observada durante estos eventos. Una vez que se han recopilado las imágenes, se ensambla una película de todo el experimento para mostrar la dinámica de los eventos moleculares de interés. La microscopía de video de lapso de tiempo tiene una amplia gama de aplicaciones en el campo de la investigación biomédica y es una herramienta poderosa y única para seguir la dinámica de los eventos celulares en tiempo real. A través de esta técnica, podemos evaluar eventos celulares como la migración, la división, la transducción de señales, el crecimiento y la muerte. Además, mediante el uso de sondas moleculares fluorescentes podemos marcar moléculas específicas, como ADN, ARN o proteínas, y seguirlas a través de sus vías y funciones moleculares. La microscopía de video de lapso de tiempo tiene múltiples ventajas, la principal es la capacidad de recopilar datos a nivel de una sola célula, lo que la convierte en una tecnología única para la investigación en el campo de la biología celular. Sin embargo, la microscopía de video de lapso de tiempo tiene limitaciones que pueden interferir con la adquisición de imágenes de alta calidad. Las imágenes pueden verse comprometidas por ambos factores externos; fluctuaciones de temperatura, vibraciones, humedad y factores internos; pH, motilidad celular. En este artículo, describimos un protocolo para la adquisición dinámica de una proteína específica, Parkin, fusionada con la proteína fluorescente amarilla mejorada (EYFP) con el fin de rastrear la eliminación selectiva de las mitocondrias dañadas, utilizando un enfoque de microscopía de video de lapso de tiempo.

Aquí, nos muestran cómo la microscopía de vídeo de lapso de tiempo es una técnica poderosa que puede ser utilizado para seguir los acontecimientos moleculares de las proteínas con fluorescencia etiquetado en una sola célula. Los resultados representativos también muestran cómo esta técnica permite la adquisición de imágenes de alta calidad. Cuando las imágenes del proceso molecular, se obtienen, tenemos la oportunidad de analizar de diferentes maneras. Aquí, se analizan el intervalo de t...

Aquí, describimos en detalle un enfoque de microscopía de video de lapso de tiempo para medir el reclutamiento temporal de EYFP-Parkin durante la eliminación selectiva de mitocondrias dañadas. Este proceso dinámico de eliminación de mitocondrias dañadas dependiente de EYFP-Parkin se puede utilizar como indicador de la salud celular en diferentes condiciones experimentales.

Lapso de tiempo-microscopía de vídeo para la Evaluación de EYFP-Parkin agregación como un marcador para celular mitofagia

Time-lapse video microscopy can be defined as the real time imaging of living cells. This technique relies on the collection of images at different time ...

El objetivo general de esta microscopía de video con lapso de tiempo es rastrear la eliminación selectiva de mitocondrias dañadas mediada por Parkin durante el proceso de mitofagia. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del metabolismo molecular, como cómo afecta la mitofagia a condiciones patológicas persistentes. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona una herramienta muy potente para seguir la dinámica de proteínas marcadas durante sus procesos moleculares.Este método puede proporcionar información sobre el ciclo vital mitocondrial. También puede aplicarse a otros sistemas, como cultivos celulares primarios, estudios de embriología y predicción de una prioridad. Los fibroblastos embrionarios de ratón inmortalizados utilizados en este estudio se cultivan en medio DMEM completo en una placa de cultivo de tejidos de diez centímetros de diámetro a 37 grados Celsius en una atmósfera humedecida que contiene cinco por ciento de dióxido de carbono.Cuando las células alcancen una confluencia del 80 por ciento, deseche el medio mediante succión estéril y agregue diez mililitros de PBS estéril. Retire el PBS y agregue un mililitro de tripsina-EDTA

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Fusión mitocondrial se midió mediante el seguimiento de la equilibración de photoconverted matriz orientada GFP través de la red mitocondrial en el tiempo. Hasta ahora, sólo una célula podría ser sometido a un análisis cinético hora larga a la vez. Se presenta un método que mide simultáneamente varias celdas, y acelera así el proceso de recopilación de datos.

Una más rápida, de alta resolución, APMt-GFP-ensayo basado en la fusión mitocondrial Adquisición de datos cinéticos de varias celdas en paralelo mediante microscopía confocal

Los fibroblastos de pacientes portadores de mutaciones causantes de la enfermedad en el Parkinson genes representan un fácil...

El uso de fibroblastos humanos primarios para la Supervisión de fenotipos mitocondriales en el campo de la enfermedad de Parkinson

Mitofagia, el proceso de claro dañaado las mitocondrias, es necesario para el mantenimiento de la homeostasis y salud mitocondrial. Este artículo presenta algunas de la mitofagia últimos métodos de detección en células humanas, Caenorhabditis elegansy los ratones.

In Vitro e In Vivo la detección de la mitofagia en células humanas, C. Elegansy los ratones

Hemos desarrollado un flujo de trabajo sencillo y adaptable para extraer datos cuantitativos de estudios biológicos celulares basado en la proyección de imagen de la fluorescencia de la agregación de la proteína y autofagia flujo en sistema nervioso central de Drosophila modelos de neurodegeneración.

Biología celular cuantitativa de neurodegeneración en Drosophila mediante análisis imparcial de fluorescencia etiquetas proteínas con ImageJ

Mitofagia, la degradación selectiva de las mitocondrias, se ha implicado en la homeostasis mitocondrial y desregulado en varias enfermedades humanas. Sin embargo, convenientes métodos experimentales para medir la actividad de la mitofagia son muy limitados. Presentamos un ensayo sensible para medir la actividad de la mitofagia mediante citometría de flujo.

Medida sensible de la mitofagia por reportero fluorescente flujo Cytometry usando el pH-dependiente mt-Keima

Este protocolo describe un método para el análisis cuantitativo de la formación de complejos de proteínas mitophagy específicamente en células beta a partir de muestras de islet humanos primarios. Esta técnica permite así el análisis de la mitopagia a partir de material biológico limitado, que son cruciales en las muestras preciosas de células beta pancreáticas humanas.

Visualización de complejos endógenos de mitophagy in Situ en células beta pancreáticas humanas que utilizan el ensayo de ligadura de proximidad

La mitofagia es el principal mecanismo de control de calidad mitocondrial. Sin embargo, la evaluación de la mitofagia in vivo se ve obstaculizada por la falta de ensayos cuantitativos fiables. Aquí se presenta un protocolo para la observación de la mitofagia en células vivas utilizando un colorante mitocondrial verde-fluorescente permean celular y un colorante lisosómico rojo-fluorescente.

Visualización de la mitofagia con tintes fluorescentes para mitocondrias y lisosomas

Basado en experimentos in vitro , este estudio reveló el mecanismo de la crocetina en la reparación del daño por estrés oxidativo de los cardiomiocitos al influir en la mitofagia, en la que la vía de señalización PINK1 / Parkin juega un papel importante.

Protección de las células miocárdicas H9c2 del estrés oxidativo por crocetina a través de la mitofagia mediada por la vía PINK1 / Parkin

Esta técnica describe un flujo de trabajo efectivo para visualizar y medir cuantitativamente el potencial de la membrana mitocondrial y los niveles de superóxido dentro de las células HeLa utilizando imágenes en vivo basadas en fluorescencia.

Cuantificación basada en fluorescencia del potencial de membrana mitocondrial y los niveles de superóxido utilizando imágenes en vivo en células HeLa

Este estudio presenta un método para analizar la morfología de las mitocondrias basado en inmunotinción y análisis de imágenes en tejido cerebral de ratón in situ. También describe cómo esto permite detectar cambios en la morfología mitocondrial inducidos por la agregación de proteínas en modelos de enfermedad de Parkinson.

Examen histológico de la morfología mitocondrial en un modelo de enfermedad de Parkinson

Aprende microscopía de lapso de tiempo para evaluar la agregación de EYFP-Parkin como marcador de mitofagia celular. Este método permite rastrear la eliminación selectiva de mitocondrias dañadas en fibroblastos embrionarios de ratón.

Lapso de tiempo-microscopía de vídeo para la Evaluación de EYFP-Parkin agregación como un marcador para celular mitofagia

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