Aislamiento y análisis de citometría de flujo de células inmunes del cerebro isquémico Ratón

El objetivo general de este procedimiento es aislar células inmunitarias del cerebro isquémico de ratón para su cuantificación y caracterización fenotípica mediante citometría de flujo multiparamétrica. El análisis de la inflamación postisquémica en el cerebro mediante citometría de flujo multicolor proporciona una comprensión profunda de los procesos inmunológicos implicados en la progresión de la lesión, la reparación y el resultado general del accidente cerebrovascular. La principal ventaja de este procedimiento es la rápida centrifugación en gradiente de densidad de un solo paso, que permite el aislamiento de un gran número de células inmunitarias viables del cerebro isquémico del ratón.

La aplicación de esta técnica tiene como objetivo la identificación y validación de nuevas estrategias de tratamiento inmunomodulador que se puedan aplicar en un período de tiempo más amplio del accidente cerebrovascular. Comience sumergiendo un extremo de un tubo de bomba de perfusión peristáltica en HBSS helado sin calcio ni magnesio. Fije una aguja roma de calibre 23 en el otro extremo del tubo.

Y encienda la bomba para llenar completamente la tubería con HBSS. A continuación, coloque un ratón sacrificado dorsalmente en una tabla de disección incrustada en una bandeja de plástico, y sujete las patas delanteras y traseras, estiradas lo más que sea posible, con agujas de calibre 20. Usando un par de pinzas de dientes rectos, uno por dos para agarrar la piel abdominal, haga una incisión lateral a través del tegumento y la pared abdominal con tijeras afiladas de iris para exponer el hígado.

A continuación, levanta el esternón y utiliza la hoja roma de unas tijeras Iris afiladas y romas para incidir el diafragma. Continúe cortando la caja torácica lateral a ambos lados en la dirección caudocraial, teniendo cuidado de no lesionar las arterias pulmonares, cardíacas y torácicas, y use pinzas romas para ajustar el colgajo de piel. Sujete el colgajo a la tabla de disección y separe cuidadosamente el corazón del tejido conectivo.

Sujetando el corazón con una pinza de extremo romo, luego inserte la punta de la aguja de calibre 23 en el extremo del tubo de perfusión en el vértice del ventrículo izquierdo, teniendo cuidado de no lesionar el tabique intraventricular. Con unas tijeras afiladas Iris, haga una incisión en la aurícula derecha e inmediatamente encienda la bomba, teniendo cuidado de evitar la formación de burbujas dentro del bombeo. Cuando el hígado se vuelva de un color café claro, use tijeras quirúrgicas rectas para decapitar al ratón justo detrás del cráneo.

A continuación, utiliza las tijeras Iris para hacer una incisión en la línea media del cuero cabelludo. Cuando el cráneo sea visible, coloque una punta de tijera afilada de iris en el foramen magnum y haga una incisión lateral en el hueso. Repita la incisión en el otro lado.

A continuación, utiliza unas tijeras afiladas Iris para cortar con cuidado desde la misma cavidad hasta la línea media, hacia la nariz. Con pinzas finas, pela suavemente los huesos craneales de cada hemisferio cerebral. Luego, levante el cerebro con una espátula y use unas tijeras afiladas de iris para diseccionar cuidadosamente las fibras de los nervios craneales que lo fijan al cráneo.

Colocar el cerebro en un tubo de 15 mililitros, que contiene 10 mililitros de HBSS con calcio y magnesio en hielo. Para disociar el tejido cerebral en una suspensión de una sola célula, primero, use una hoja de afeitar limpia para extraer cuidadosamente el tronco encefálico y el cerebullum. A continuación, utiliza otra cuchilla de afeitar limpia para hemi-sectar el cerebro, cortando cada hemisferio a lo largo del plano coronal en tres piezas de aproximadamente el mismo tamaño.

Usando el extremo del émbolo de una jeringa de cinco mililitros, triture los trozos de tejido cerebral a través de un colador de células de 100 micrones, enjuagando continuamente el colador con HBSS helado con calcio y magnesio. A continuación, coloque los tejidos homogeneizados en hielo. Cuando se hayan procesado todas las muestras, centrifuga las suspensiones celulares y desecha con cuidado los sobrenadantes.

Vuelva a suspender los gránulos en un mililitro de tampón de digestión. A continuación, transfiera la suspensión celular a un tubo de dos mililitros e incube las células bajo una rotación lenta y continua a 37 grados centígrados. Después de una hora, tamice la suspensión celular a través de un colador celular de 70 micras y enjuague bien el filtro con tres mililitros de tampón de lavado que contenga DNasa.

A continuación, lave el colador con 15 mililitros de tampón de lavado sin DNasa, centrifugue las células y deseche el sobrenadante. Para eliminar los restos celulares y la mielina, vuelva a suspender las células en cinco mililitros de medio de gradiente de densidad a temperatura ambiente del 25% y transfiera la suspensión celular a un tubo de 15 mililitros. Mezcle bien las células en degradado con un pipeteo suave repetido.

A continuación, centrifuga la solución celular. Al final de la separación, aspire cuidadosamente la capa de mielina y el sobrenadante sin alterar el gránulo y vuelva a suspender las células en 10 mililitros de tampón de lavado sin DNasa. Transfiera las células a un tubo de 15 mililitros y gírelas hacia abajo nuevamente, resuspendiendo el pellet en 100 microlitros de tampón de lavado en frío.

A continuación, cuente el número de células viables por exclusión de azul de tripán y guárdelas a cuatro grados centígrados. Antes de comenzar la inmunotinción, incubar las células a cuatro grados centígrados durante 10 minutos con un reactivo bloqueante del receptor CD26/CD32 Fc antimurino para evitar cualquier unión inespecífica. A continuación, añada los anticuerpos primarios conjugados con fluoróforos de interés a cuatro grados centígrados durante 20 minutos en la oscuridad.

Al final de la incubación, lavar las células en dos mililitros de tampón de citometría de flujo. Gira hacia abajo. Vuelva a suspender el pellet en 200 microlitros de tampón de citometría de flujo y almacene las muestras a cuatro grados Celsius hasta el análisis de citometría de flujo.

Para cuantificar el número absoluto de células inmunitarias infiltrantes mediante el recuento de perlas, pipetee exactamente 40 microlitros de citometría de flujo y 10 microlitros de suspensión celular en un tubo de recuento que contenga un número conocido de perlas fluorescentes. A continuación, incube la célula y la suspensión de perlas con el anticuerpo CD45 marcado con FITC a cuatro grados centígrados durante 20 minutos en la oscuridad, seguido de un llenado inverso del tubo de recuento con 200 microlitros de tampón de citometría de flujo. A continuación, ejecute inmediatamente la muestra en el citómetro de flujo, registrando el cordón y los eventos de celda CD45 positivos.

24 horas después de la oclusión de la arteria cerebral media, los leucocitos infiltrantes del cerebro se pueden identificar por su alta expresión de CD45. Dentro de la población de CD45 alto, los neutrófilos polimorfonucleares se identifican por su expresión de LY-6G, mientras que los linfocitos T exhiben un fenotipo de superficie celular CD45 alto y CD3 positivo. El resto de las células CD45 altas se pueden distinguir aún más por su expresión de CD19 y CD11b.

Mientras que la fracción CD11b positiva se puede subcategorizar en monocitos inflamatorios Ly-6C altos y una población baja de Ly-6C que abarca las poblaciones de monocitos, macrófagos y células dendríticas. En la etapa aguda del accidente cerebrovascular, los neutrófilos positivos para Ly-6G ingresan al cerebro rápidamente después de la oclusión del vaso. Por el contrario, las frecuencias de las células T CD3 positivas en el hemisferio isquémico disminuyen en comparación con los cerebros de cirugía simulada y el hemisferio contralateral.

Dentro de la población CD11b positiva, la isquemia cerebral cambia la balanza hacia una fuerte preponderancia de monocitos inflamatorios Ly-6C altos. Además, los recuentos totales de leucocitos en el hemisferio infartado aumentan significativamente en comparación con el hemisferio contralateral y los cerebros de cirugía simulada, 24 horas después de la oclusión de la arteria cerebral media. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar células inmunitarias del cerebro isquémico mediante fragmentación mecánica, digestión enzimática y centrifugación en gradiente de densidad, y cómo caracterizar estas células mediante citometría de flujo.

Una vez dominada, esta técnica se puede completar en cuatro horas, si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que el rendimiento total de las células depende fundamentalmente de la disociación completa del tejido cerebral. Además, es necesaria una perfusión transcardíaca suficiente para prevenir la contaminación de los leucocitos infiltrantes del cerebro con células inmunitarias circulantes no inflamatorias.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como ensayos de expresión génica o análisis del perfil de citocinas, para obtener información adicional sobre la relevancia funcional de distintos abscesos inmunitarios en el contexto del accidente cerebrovascular isquémico.