Name: Las fibras serotoninérgicos proyección de imagen en la médula espinal de ratón El uso de la claridad / Técnica CÚBICO (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: Aprende a visualizar fibras serotoninérgicas en la médula espinal de ratón mediante el protocolo CLARITY/CUBIC. Esta técnica permite observar la distribución tridimensional in situ con mayor detalle que los métodos histológicos tradicionales.

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Este trabajo fue apoyado por el Centro de Excelencia para la Función Cerebral Integrativa del Consejo de Investigación Australiano (ARC Centre Grant CE140100007), una subvención del proyecto NHMRC (#1086643). El Prof. George Paxinos cuenta con el apoyo de una beca Senior Principal Research Fellow del NHMRC (#1043626).

Ética Declaración: Todos los procedimientos que involucran sujetos animales siguen las directrices del Comité de Cuidado de Animales y Ética (ACEC) en la Universidad de Nueva Gales del Sur (el número ACEC aprobado es de 14 / 94A). 1. Preparación de la cuerda del ratón transparente espinal <ol><li> Preparación de hielo solución de hidrogel frío <ol><li> Preparación de solución de paraformaldehído al 16% (PFA) <ol><li> Añadir 16 g de polvo en 70 ml de paraformaldehído-calentado previamente en agua destilada (50-55 ° C) y se agita en un agitador magnético se calienta hasta que se disuelva paraformaldehído. Nota: No permita que la solución se caliente más de 55 ° C y tenga en cuenta que paraformaldehído es tóxico. </li><li> Transferir la solución de paraformaldehído a un cilindro y añadir agua destilada hasta 100 ml. Se enfría la solución de paraformaldehído usando un 4 ° C refrigerador. </li></ol></li><li> Disolver 125 mg iniciador VA-044 en 26,25 ml de agua destilada y se enfría la solución en un 4° C nevera. </li><li> solución fresca 5 ml de acrilamida (40%), 1,25 ml de solución de bis (2%) (PRECAUCIÓN: Bis y soluciones de acrilamida son tóxicos, puede causar defectos genéticos o cáncer), 5 ml 10x PBS, solución PFA 12,5 ml 16%, y el solución de iniciador VA-044 en hielo. </li><li> Mezclar las soluciones anteriores en hielo. Nota: el volumen total es de 50 ml. </li></ol></li><li> Perfusión y la Colección de la cuerda del ratón espinal <ol><li> Anestesiar un ratón con una inyección intraperitoneal de ketamina (80 mg / kg) y xyzaline (5 mg / kg) diluido en solución salina normal al 0,9%. La dosificación para el ratón puede ser inferior a la de las ratas. </li><li> En una superficie de plástico adecuado en una campana extractora, fijar las extremidades del ratón fuera del cuerpo (cinta adhesiva es eficaz) una vez que el ratón no responde a una pizca de su piel del pie. </li><li> Cortar la piel del ratón sobre el pecho y luego el pecho hueso para exponer el corazón con una tijera. </li><li> Usando una bomba peristáltica, con una aguja de 25 G unida a the extremo del tubo, inserte la aguja en el ventrículo izquierdo del corazón, snip la aurícula derecha para crear un punto de salida para la sangre y luego comenzar el lavado con solución salina normal 40 ml de 0,9% a razón de aproximadamente 10 ml / min. </li><li> Cuando se haya completado, perfundir el ratón con 35 ml de solución de hidrogel de hielo frío. Nota: la perfusión a una velocidad de 10 ml / min para evitar la hinchazón del tejido nervioso. </li><li> Incisión en la piel sobre la parte posterior con una cuchilla y luego retire los músculos al lado del vertebrado. Después de cortar los arcos vertebrales en un lado y dándoles la vuelta hacia el otro lado, tomar la médula espinal de la columna vertebral con una multa de tijera. </li></ol></li><li> Borrado de la cuerda del ratón espinal <ol><li> Coloque la médula espinal en 15 ml de solución de hidrogel durante la noche a 4 ° C. </li><li> Eliminar 10 ml de la solución de hidrogel y verter el resto de la solución con los segmentos de la médula espinal a un tubo de 5 ml. Llenar el tubo 5 ml con la solución de hidrogel hasta que esté completamente lleno. </li><li> Estirar un pequeño trozo de Parafilm sobre la parte superior del tubo de 5 ml y luego envolver Parafilm alrededor del cuello del tubo. Nota: Asegúrese de que los contactos parafilm la solución de hidrogel y no haya burbujas entre la solución de hidrogel y la parafina. </li><li> Poner el tubo de 5 ml en un 37 &#160; ° C horno durante la noche. Observe la solución de hidrogel hasta que se convierte en un gel. </li><li> Tome el tubo de 5 ml del horno y quitar el gel del tubo con una llave (tal como una punta de pipeta 1 ml pala). Quitar el gel a partir del tejido de la médula espinal por pegar el tejido grueso para el gel y luego tomar el papel grueso de distancia (el gel se adhiere al tejido y, por tanto, será eliminado por el tejido). </li><li> Después de quitar el gel a partir del tejido de la médula espinal, lavar la médula espinal 4 veces con 1 x PBS (pH 7,4) durante 24 horas en un agitador. </li><li> Preparar la solución de limpieza CUBIC disolviendo 3,85 g de urea y 3,85 g de N, N, N &#39;, N&#39;-tetrakis (2-hidroxipropil) ethylenediamine en 5,38 ml de agua destilada. Nota: Se utiliza un agitador caliente. Añadir 2,31 g de polietilenglicol mono-p-isooctilfenil éter / Triton X-100 a la solución una vez que es claro y se enfría a temperatura ambiente. Nota: 10 g de estos tres productos químicos son de un ratón. </li><li> Cortar la médula espinal de ratón coronal en 2-3 mm de largo segmentos con una hoja de afeitar y ponerlas en 5 ml de la solución de aclaramiento CÚBICO anteriormente. Colocar en un agitador en el horno a 37 &#160; ° C durante 3 días. </li><li> Tres días más tarde, cambiar la solución de intercambio de información para una nueva. Nota: la solución anterior se prepara antes de su uso. </li><li> Dos o tres días más tarde después de actualizar la solución de aclaramiento cúbico, comprobar la transparencia del tejido contra un papel con tipo de letra 8 letras. Si es transparente, las letras se pueden ver a través del tejido despejado. Eliminar la solución de compensación y añadir 4 ml de PBST (0,1% Triton-X100) para lavar el tejido 4 veces al día (cada 6 horas). </li></ol></li></ol><ol><li> Incubar los segmentos de la médula espinal en la solución de anticuerpo primario (anti-serotonina, criado en conejo, diluido 1: 100 en PBST) durante 3 días en un agitador en un horno de 37 ° C. </li><li> Eliminar la solución de anticuerpo y añadir 4 ml de PBST (0,1% Triton-X100) para lavar los segmentos de la médula espinal 4 veces al día (cada 6 horas) en un horno a 37 ° C. </li><li> Quitar la solución PBST y agregar la solución de anticuerpo secundario (conjugado de cabra 594 IgG anti-conejo, diluido 1: 100 en PBST) incubar el tejido durante 3 días en un agitador en un horno de 37 ° C. </li><li> Retirar la solución de anticuerpo secundario y añadir 4 ml de PBST para lavar los segmentos de la médula espinal 4 veces al día (cada 6 horas) en un agitador en un horno de 37 ° C. Al día siguiente, el tejido está listo para la imagen. </li></ol> 3. Imaging <ol><li> Eliminar la solución de PBST y añadir 4 ml de 85% de glicerol para hacer que el índice de refracción del tejido uniforme. </li><li&gt; Comprobar la claridad del tejido. Una vez que es evidente en aproximadamente 1 hora, poner el tejido sobre un gran tobogán, vidrio delgado que se ajusta el bastidor de soporte del microscopio de fluorescencia de múltiples fotos. </li><li> Ponga unas gotas de 85% de glicerol al lado del tejido de la médula espinal y el cubreobjetos con un vaso cubreobjetos 22 x 50 mm 2. Nota: La orientación de la médula espinal decide cómo la imagen se parece. </li><li> Ponga el portaobjetos de vidrio en el bastidor de soporte del microscopio de fluorescencia de múltiples fotones y mover el tejido en la vía de la luz. </li><li> Elija el helio-neón línea de láser 594 nm y ajustar la intensidad del láser al nivel óptimo marcando el brillo de la señal positiva en la imagen en vivo. </li><li> Seleccionar el área de escaneo del tejido de la médula espinal utilizando el objetivo 20X (en agua, NA 0,7) y se preparan para crear una pila Z, y la profundidad de cada paso se establece en 3 m. </li><li> Analiza el tejido desde la parte superior a la parte inferior de la pila Z bajo el objec 20Xtivo y luego objetivo 63X (en aceite, NA 1,4) (tamaño del paso fue de 1 m), respectivamente. Reconstruir videos en 3D utilizando un software de 3D ​​28. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El protocolo descrito se muestra cómo las fibras de imagen serotoninérgicos en la médula espinal de ratón con la claridad combinado y técnicas cúbico. Se introduce un proceso de compensación más rápido en comparación con el protocolo de compensación pasiva desarrollada por Cheung et al. 14 y Tomer et al. 15 y permite que el tejido de la médula espinal a estar bien apoyado por el hidrogel durante la limpieza. Un paso importante durante la fijación de la...

Las proyecciones supraespinales son responsables de la modulación de diversos comportamientos como la percepción del dolor. Una de las proyecciones portadoras de información nociceptiva contiene fibras serotoninérgicas, que se originan en el rafe posterior del cerebro y los núcleos reticulares adyacentes1,2. Los estudios fisiológicos y farmacológicos han demostrado un aumento de la liberación de serotonina en el asta dorsal de la médula espinal después de la estimulación eléctrica de los núcleos del rafe en el cerebro posterior3-5. En la rata y la zarigüeya, las fibras rafespinales serotoninérgicas tienen terminales densos, no solo en el cuerno dorsal6-8, sino también en la zona intermedia7,9,10, el cuerno ventral7,11 e incluso la lámina 1012,13. No hay estudios similares en el ratón. El presente estudio tuvo como objetivo mapear el patrón de terminación de las fibras serotoninérgicas que surgen de los núcleos del rafe del cerebro posterior y sus núcleos reticulares adyacentes en la médula espinal del ratón utilizando el método CLARITY14 recientemente publicado y su modificación: CUBIC15. 
La inmunohistoquímica convencional de fluorescencia o peroxidasa de la médula espinal muestra claramente la distribución de las fibras serotoninérgicas en la sustancia gris de la médula espinal en secciones transversales de 30-40 μm de grosor. Sin embargo, este enfoque no muestra la continuidad de los tractos de fibras serotoninérgicas en la sustancia blanca y sus colaterales en la sustancia gris. Aunque la reconstrucción en 3D de secciones histológicas ha avanzado en nuestro conocimiento de los tractos fibrosos, sigue siendo un desafío para los histólogos y anatomistas seguir un solo tracto debido a las pequeñas distorsiones en el tejido causadas por el corte. Para sortear este obstáculo, varios investigadores han desarrollado varios protocolos para hacer que toda la estructura del tejido sea transparente y recopilar una imagen del tejido inalterado en un solo archivode video 17-21. Hasta el momento, la técnica de hidrogel tisular (CLARITY), transparente, intercambiado por lípidos, híbrido con acrilamida, compatible con la imagen/inmunotinción, desarrollada por el grupo14,15 de Deisseroth, así como CUBIC, desarrollada por Susaki et al16, son las más exitosas. Desde la publicación de los protocolos, muchos investigadores han comenzado a utilizar estas técnicas para investigar diversos aspectos de los tejidos biológicos, incluyendo, no solo el cerebro22-25, sino también el corazón, los riñones, el intestino y los pulmones26,27. 
Mediante la fijación de la médula espinal del ratón con la solución de hidrogel (CLARITY) y la eliminación con los reactivos CUBIC (que es un método mucho más rápido que el descrito por el protocolo CLARITY original14,15), se eliminó un bloque de tejido de la médula espinal de 2-3 mm de largo en dos semanas y se completó la tinción de inmunofluorescencia para la serotonina en ocho días. Con solo una combinación de agentes químicos, la inmunohistoquímica convencional se puede utilizar para crear una imagen de tractos de fibras individuales en un archivo de video 3D en aproximadamente un mes.

<table><tbody><tr><td>Fotoiniciador VA044</td><td>Wako</td><td>va-044/225-02111</td><td>http://www.wako-chem.co.jp/specialty/waterazo/VA-044.htm</td></tr><tr><td>solución de acrilamida al 40%</td><td>Bio Rad</td><td>161-0140</td><td>http://www.bio-rad.com/en-au/sku/161-0140-40-acrylamide-solution</td></tr><tr><td>solución al 2% Bis</td><td>Bio Rad</td><td>161-0142</td><td>http://www.bio-rad.com/en-au/sku/161-0142-2-bis-solution?parentCategoryGUID=5e7a4f31- 879c-4d63-ba0b-82556a0ccf1d</td></tr><tr><td>paraformaldehído</td><td>Sigma</td><td>158127</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/158127?lang=en&region=AU</td></tr><tr><td>urea</td><td>Merck Millipore</td><td>66612</td><td>http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Urea---CAS-57-13-6---Calbiochem,EMD_BIO-66612</td></tr><tr><td>N,N,N',N'-tetrakis (2-hidroxipropil) etilendiamina</td><td>Merck Millipore</td><td>821940</td><td>http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetra-2-propanol,MDA_CHEM-821940</td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Merck Millipore</td><td>648462</td><td>http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/TRITON&reg;-X-100-Detergent---CAS-9002-93-1---Calbiochem,EMD_BIO-648462</td></tr><tr><td>sacarosa</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s0389?lang=en&region=AU</td></tr><tr><td>anticuerpo de serotonina</td><td>Merck Millipore</td><td>AB938</td><td>http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Anti-Serotonin-Antibody,MM_NF-AB938</td></tr><tr><td>anti conejo de cabra Anticuerpo secundario IgG (H + L), Alexa Fluor & reg; 594 conjugado</td><td>Life Technologies</td><td>&nbsp; A-11012 https://www.lifetechnologies.com/order/genome-database/antibody/Rabbit-IgG-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11012</td><td></td></tr><tr><td>microscopio multifotónico</td><td>Leica Leica</td><td>TCS SP5 MP STED http://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/details/product/leica-tcs-sp5-mp/</td><td></td></tr></tbody></table>

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Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

Las fibras largas de descender a la médula espinal son esenciales para la locomoción, la percepción del dolor, y otros comportamientos. El patrón de terminación de fibras en la médula espinal de la mayoría de estos sistemas de fibra no se han investigado a fondo en cualquier especie. fibras serotoninérgicos, que se proyectan a la médula espinal, se han estudiado en ratas y zarigüeyas en secciones histológicas y su significado funcional se ha deducido en base a su patrón de terminación de fibras en la médula espinal. Con el desarrollo de la claridad y técnicas cúbico, es posible investigar este sistema de fibras y su distribución en la médula espinal, que es probable que revelar características hasta ahora desconocidas de las vías supraespinales serotoninérgicos. A continuación, ofrecemos un protocolo detallado para obtener imágenes de las fibras serotoninérgicos en la médula espinal de ratón usando la claridad combinado y técnicas cúbicos. El método consiste en la perfusión de un ratón con una solución de hidrogel y la clarificación del tejido con una combinación de la limpieza de los reactivos. el tejido de la médula espinal fue despejada en menos de dos semanas, y la posterior tinción de inmunofluorescencia contra la serotonina se completó en menos de diez días. Con un microscopio de fluorescencia multi-fotón, el tejido fue escaneada y una imagen 3D se reconstruyó usando software Osirix.

Esta sección muestra los resultados de la tinción de anticuerpos de la serotonina en la médula espinal de ratón transparente usando una combinación de la claridad y protocolos cúbicos. Se demuestra que las fibras serotoninérgicos están presentes en todas las láminas de la médula espinal con un predominio en la parte ventral del asta ventral (Figura 1, también ver video 1). El tejido de control no tuvo fibras positivos (resultado no se muestra). En el ast...

Las proyecciones supraespinales son importantes para la percepción del dolor y otros comportamientos, y las fibras serotoninérgicas son uno de estos sistemas de fibras. El presente estudio se centró en la aplicación del protocolo combinado CLARITY/CUBIC a la médula espinal de ratón con el fin de investigar la terminación de estas fibras serotoninérgicas.

Las fibras serotoninérgicos proyección de imagen en la médula espinal de ratón El uso de la claridad / Técnica CÚBICO

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

El objetivo general de este experimento CLARITY/CUBIC es revelar las características tridimensionales de las fibras serotoninérgicas en la médula espinal de ratón, las cuales no son observables mediante histología tradicional. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neuroanatomía, como ¿cómo se distribuyen las fibras serotoninérgicas a lo largo de la médula espinal? Las principales ventajas de esta técnica son que permite observar las fibras serotoninérgicas in situ, junto con la identificación de vectores que no son observables mediante histología tradicional.Aunque este método puede proporcionar información sobre la organización del sistema nervioso central, también puede aplicarse a otros sistemas, como el sistema cardiovascular. Buscamos utilizar por primera vez este método cuando alcanzamos limitaciones al usar un método de trazado tradicional para analizar las fibras serotoninérgicas en la médula espinal de ratón. Comience fijando las extremidades de un ratón anestesiado a una plataforma plástica de disección dentro de una campana extractora.Confirme la ausencia de respuesta al pellizco en los dedos del pie y use un par de tijeras para abrir la

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Microscopía multifotónica de órganos enteros de ratón es posible por ópticamente despejar el órgano antes de formación de imágenes, pero no todos los protocolos de preservar la señal fluorescente de proteínas fluorescentes. El uso de un método de compensación óptica con base de etanol y alcohol bencílico deshidratación: bencil benzoato de compensación, se muestran imágenes de alta resolución multifotónica de cerebro de ratón que expresa toda YFP.

Microscopía Multiphoton de cerebro de ratón Borrado Expresando YFP

Fuente: Pekarek, B. T., et. al., Obtención de imágenes y cuantificación de dendritas neuronales intactas mediante la limpieza de tejidos CLARITY. J. Vis. Exp. (2021)En este video, demostramos la preparación, la obtención de imágenes y el análisis de un cerebro de ratón aclarado para examinar los ejes dendríticos, la morfología de la columna vertebral y la distribución neuronal utilizando técnicas de microscopía confocal y reconstrucción 3D.

Imágenes de microscopía confocal de árboles dendríticos intactos y morfología de la columna vertebral en un cerebro de ratón despejado

Para obtener imágenes de alta resolución de células marcadas con fluorescencia dentro de tejidos grandes, idealmente, las muestras biológicas deben ser visualizadas sin seccionar. 3DISCO es un procedimiento sencillo de limpieza de tejidos basado en la incubación secuencial con disolventes orgánicos. Al aclararse, los órganos se vuelven transparentes, lo que permite un escaneo láser de extremo a extremo del espécimen.

Borrado de imágenes Sistemas Biológicos intactos a nivel celular por 3DISCO

Una nueva preparación ex vivo para obtener imágenes de la médula espinal de ratón. Este protocolo permite la formación de imágenes de dos fotones de las interacciones celulares en vivo a lo largo de la médula espinal.

De dos fotones de imágenes de Dinámica Celular en la médula espinal de ratón

Las técnicas de aclarado óptico están revolucionando la forma en que se visualizan los tejidos. En este informe describimos las modificaciones del protocolo original Clear-Lipid-Exchange-Acrylamide-Hibridado-Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) que produce resultados más consistentes y menos costosos.

Clearing óptico del sistema nervioso central del ratón Utilizando CLARITY pasiva

Aquí presentamos un protocolo para adaptar el método de la CLARIDAD de los tejidos cerebrales para las retinas del entero-montaje para mejorar la calidad de la coloración immunohistochemical estándar y de la proyección de imagen de alta resolución de neuronas retinianas y de sus estructuras subcelulares.

Inmunostaining De Retinas De Montaje Completo Con El Método De Claro De Tejido CLARITY

La morfología dendrítica neuronal a menudo subyace a la función. De hecho, muchos procesos de enfermedad que afectan el desarrollo de las neuronas se manifiestan con un fenotipo morfológico. Este protocolo describe un método simple y poderoso para analizar cenadores dendríticos intactos y sus espinas asociadas.

Obtención de imágenes y cuantificación de dendritas neuronales intactas a través de CLARITY Tissue Clearing

El protocolo proporciona un método detallado de imágenes neuronales en cortes cerebrales utilizando un método de limpieza de tejidos, ScaleSF. El protocolo incluye la preparación del tejido cerebral, la clarificación del tejido, el manejo de rodajas despejadas y la microscopía de escaneo láser confocal de las estructuras neuronales desde los niveles mesoscópicos hasta los microscópicos.

Un método de limpieza de tejidos para imágenes neuronales de escalas mesoscópicas a microscópicas

Las técnicas mínimamente invasivas y un dispositivo de laboratorio simple mejoran la reproducibilidad del modelo de lesión de la médula espinal al reducir el daño operatorio a los animales de experimentación y permitir el mantenimiento de la morfología anatómica. El método vale la pena porque los resultados confiables y el procedimiento reproducible facilitan las investigaciones de los mecanismos de reparación de enfermedades.

Establecimiento de un modelo de lesión de la médula espinal por contusión en ratones basado en una técnica mínimamente invasiva

Este estudio presenta un protocolo para extraer y preparar muestras claras de todo el cerebro y la médula espinal con señales fluorescentes conservadas, lo que mejora la eficiencia experimental y la integridad de los datos para avanzar en la investigación en neurociencia.

Extracción y limpieza de tejidos: preparación de muestras de cerebro-médula espinal de ratón

Aprende a visualizar fibras serotoninérgicas en la médula espinal de ratón mediante el protocolo CLARITY/CUBIC. Esta técnica permite observar la distribución tridimensional in situ con mayor detalle que los métodos histológicos tradicionales.

Las fibras serotoninérgicos proyección de imagen en la médula espinal de ratón El uso de la claridad / Técnica CÚBICO

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