El aislamiento y la citometría de flujo análisis de las células mononucleares de sangre periférica Glioma infiltrantes

El objetivo general de este procedimiento es caracterizar y cuantificar el número de células mononucleares de sangre periférica que se han infiltrado en el microambiente del tumor cerebral temprano. Este método puede ayudar a abordar preguntas clave en el campo de la inmunología de tumores cerebrales mediante la identificación de factores importantes para el tráfico de células inmunitarias periféricas en el microambiente del tumor cerebral. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona datos cuantitativos dependientes del tiempo sobre el número y el estado de activación de los leucocitos que han entrado en este SNC.

Después de colocar un ratón anestesiado en un marco estereotáctico, haga una incisión de dos centímetros en la línea media sobre el cráneo desde el hueso frontal hasta el hueso occipital con una hoja de bisturí. A continuación, retraiga la piel en la incisión con los retractores Collibra. Después de eso, baje una jeringa de microlitros equipada con una aguja de calibre 33 directamente sobre el bma.

Ajuste la posición de la aguja para llegar al sitio objetivo para la implantación del tumor. A continuación, utilice una jeringa de tuberculina de un mililitro equipada con una aguja de calibre 26 para marcar esta ubicación excoriando suavemente el periostio después de eso. Taladre un agujero en el cráneo en el sitio objetivo con la broca de 0,8 milímetros hasta que alcance la duramadre subyacente durante la perforación.

Aplique una presión intermitente seguida de una extracción rápida de la broca de la superficie del cráneo para evitar el calor y la fuerza excesivos. A continuación, enjuague la jeringa de microlitros con cloruro de sodio al 0,9% en un microtubo cónico de polipropileno de 1,7 mililitros para asegurarse de que la aguja no se obstruya. Agite suavemente el microtubo cónico de polipropileno de 0,6 mililitros que contiene las células tumorales varias veces para suspender completamente las células.

A continuación, extraiga dos microlitros de células en la jeringa de microlitros y asegúrese de que no se introduzcan burbujas de aire en la jeringa. Dispense un microlitro de las células en una almohadilla de preparación con alcohol isopropílico al 70%, dejando exactamente un microlitro de células tumorales en la jeringa. Después, baje la aguja hasta que toque la duramadre.

A continuación, baje la aguja 3,5 milímetros en el cerebro y, a continuación, retraiga la aguja 0,5 milímetros lenta y suavemente. Administre las células presionando el émbolo de la jeringa en el transcurso de uno o dos minutos. Realizar perfusión transcárdica en el ratón profundamente anestesiado.

Inserte una aguja roma en el ventrículo izquierdo del corazón. Use un pequeño par de tijeras de disección para cortar la aurícula derecha para permitir la exanguinación, la perfusión del sistema circulatorio del ratón con solución tirográfica durante varios minutos hasta que el hígado y los pulmones se hayan blanqueado por completo a la falta de sangre. Asegúrese de que ninguna cantidad gruesa de sangre continúe saliendo de la aurícula derecha.

Antes de retirar la aguja roma del cubo de aluminio de calibre 20 del ventrículo izquierdo. Después de quitar la aguja, desenganche el ratón del bloque de espuma de poliestireno extruido y gírelo con el lado ventral hacia abajo. Con un par de tijeras de disección grandes, separa la cabeza del resto del cuerpo.

A continuación, corte el cuero cabelludo en la línea media con un pequeño par de tijeras de disección que van desde el hueso occipital hasta el hocico para exponer el cráneo. Posteriormente, retraiga la piel a ambos lados del cráneo y sujete el cráneo de forma segura. Use un par de URS óseos para romper cuidadosamente el cráneo comenzando en el hueso occipital y trabaje hacia adelante para exponer completamente las superficies dorsal y lateral del cerebro.

La extracción del cerebro de ratón del cráneo sin causarle daño puede resultar difícil al principio. Aquellos inexpertos con la técnica pueden desear intentarlo varias veces antes de realizar experimentos adecuados. Una vez que se hayan extraído los huesos craneales, gire la cabeza del ratón con el lado ventral hacia arriba.

Corta los nervios craneales en la base del cerebro para liberarlo del cráneo. En este procedimiento, con una hoja de afeitar limpia de un solo filo, se aísla el área del cerebro que contiene el tumor haciendo una incisión sagital en el centro del cerebro. Para diseccionar los dos hemisferios, voltee el hemisferio ipsilateral con el lado medial hacia abajo y haga una incisión coronal en el cerebelo y otra incisión en el bulbo olfatorio para aislar el tejido objetivo que contiene el implante tumoral.

A continuación, coloque el tejido objetivo en el molinillo de papel de vidrio etiquetado que contiene un mililitro de DPBS. Empuje el émbolo completamente hacia abajo y gírelo siete veces para romper el tejido. Después de eso, levante el émbolo para permitir que el líquido se asiente de nuevo en el fondo del molinillo de pañuelos.

Repita este paso tres veces. Sin embargo, solo gire el émbolo cuatro veces durante las próximas dos repeticiones y tres veces durante la última repetición. Para evitar la sobreexplotación del tejido cerebral.

A continuación, aplique tres volúmenes de un mililitro de DPBS helado a los lados del émbolo para enjuagar la materia cerebral residual en el triturador de tejidos. A continuación, suspendemos la materia cerebral TRID pipeteándola hacia arriba y hacia abajo, y la colocamos en un tubo de centrífuga de 15 mililitros etiquetado sobre hielo. Enjuague los lados del molinillo de papel desechable con un mililitro adicional de DPBS helado y agréguelo al mismo tubo de centrífuga de 15 mililitros.

Mantenga todos los tubos que contengan materia encefálica TRID en hielo hasta que se hayan procesado todas las muestras. A continuación, haga girar la materia cerebral TRID en los tubos de centrífuga de 15 mililitros a 740 veces G durante 20 minutos a cuatro grados centígrados. A continuación, retire el sobrenadante y vuelva a suspender la materia encefálica granulada en un mililitro de una mezcla previamente preparada de colagenasa y ADN de enzimas digestivas.

Coloque los tubos de centrífuga de 15 mililitros en una rejilla de tubos de ensayo y coloque la rejilla en un baño de agua CS de celda de 37 grados durante 15 minutos. A continuación, agite suavemente las muestras dos veces durante el período de incubación moviendo los tubos para facilitar la disgregación del tejido. Posteriormente, agregue seis mililitros de DPBS frío de tornillo de banco a cada tubo para diluir las enzimas digestivas.

Canalice hacia arriba y hacia abajo para resuspender y filtrar el volumen total a través de filtros estériles de malla de nailon de 70 micras en nuevos tubos de centrífuga de 15 mililitros etiquetados en hielo. Luego, gire la suspensión de células cerebrales a 740 veces G durante 20 minutos a cuatro grados Celsius para lograr una peleta de una sola célula. Retire los tubos de 15 mililitros de la centrífuga y colóquelos en hielo.

A continuación, aumente el ajuste de temperatura de la centrífuga a unos 21 grados centígrados en preparación para el siguiente paso. A continuación, retire completamente el snat celular e inicialmente vuelva a suspender los gránulos celulares en un mililitro de medio de centrifugación de 70% de densidad utilizando una micropipeta P 1000. A continuación, añada cuatro mililitros adicionales de medios de centrifugación de 70% de densidad a cada tubo.

Coloque las tapas de forma segura y homogeneice la suspensión celular invirtiendo suavemente el tubo varias veces, luego transfiera los tubos de centrífuga de 15 mililitros que contienen células cerebrales resuspendidas en una densidad del 70%. Medios de centrifugación de hielo a una gradilla de tubos de ensayo a temperatura ambiente, uno a la vez. Superponga cuidadosamente dos mililitros de solución de medios de centrifugación de 37% de densidad sobre los cinco mililitros de medios de centrifugación de 70% de densidad para formar una interfaz limpia entre las dos capas de medios de centrifugación de densidad.

A continuación, marque la posición de la interfaz entre las dos capas con un marcador de punta fina para que pueda identificarse fácilmente después de la centrifugación cuando la distinción sea menos evidente. Gire los tubos de centrífuga de 15 mililitros a 740 veces G durante 20 minutos a temperatura ambiente sin interrupción. Para evitar interrumpir la interfaz entre las capas de medios de centrifugación de densidad posteriormente, recoja los pbmc que se han acumulado en la interfaz entre las dos capas de medios de centrifugación de densidad introduciendo una micropipeta P 200 en el tubo.

Evitando con cuidado la capa lipídica una vez al nivel de la banda PBMC, extraiga lentamente 200 microlitros de la superficie de la capa de medios de centrifugación de 70% de densidad y transfiéralos a un tubo de fax de polipropileno marcado respectivamente en hielo. Repita este paso una vez para lograr un volumen total de 400 microlitros por muestra. La capacidad experimentalista de formar una interfaz limpia entre las dos capas de medios de centrifugación de densidad es crucial para el aislamiento reproducible de las BMC p.

Se debe verter lentamente el medio de centrifugación de 37% de densidad mientras se inclina el tubo de 20 a 30 grados por encima de la mesa de trabajo. Esta figura muestra la estrategia de compuerta para un experimento típico: puertas colocadas en células mieloides GR one positivas CD 11 B positivas que se muestran en el paso cinco y NK 1.1. Las células asesinas naturales positivas que se muestran en el paso seis se estratifican en función de la expresión de GZMB en los pasos cinco y seis primos, respectivamente.

En esta figura, la reasignación de células mieloides GR 11 B positivas para CD 11 B y células asesinas naturales NK 1.1 positivas en FSCA frente a SSCA demuestra el menor tamaño linfoide de las células asesinas naturales en comparación con la población mieloide de tamaño relativamente mayor, lo que proporciona una mayor confirmación de la identidad de estas dos subpoblaciones de pbmc. Los datos aquí muestran que el injerto de células de glioma GL 26 sital one I en el singen. Un cerebro de ratón XC 57 negro seis J induce rápidamente el reclutamiento de CD-45, los números positivos de PBMC que se muestran en asociación con cada punto de datos a lo largo de la curva GL 26 sit GAL one I representan la inducción del pliegue de la pbmc infiltrante tumoral por encima del control.

Se demostró que los tumores NT de GGL 26 se sentaron a la hora especificada después de la implantación del tumor o HPI, según el cóctel de anticuerpos específico utilizado en la demostración: se demostró que las células mieloides GR 11 B positivas y las células asesinas naturales NK 1.1 positivas ingresaron específicamente al microambiente tumoral con deficiencia de GAL one dentro de las 48 horas posteriores al injerto tumoral. Sin embargo, el número total de gliomas que infiltran células mieloides supera con creces al de las células asesinas naturales. Una vez dominada, se describe la metodología desde la recolección de cerebros hasta el flujo.

El análisis citométrico puede ser realizado en aproximadamente seis horas por un experimental. Es imperativo que el citómetro de flujo analice el volumen total de cada muestra de PBMC para lograr una comparación justa del número total de experimentos complementarios de pbmc que infiltran glioma. Dicho análisis inmunohistoquímico se puede realizar para obtener datos espaciales sobre los infiltrados de células inmunitarias y para permitir la medición del tamaño general del tumor y la microanatomía en puntos temporales que correspondan a los evaluados con este procedimiento.

Esta técnica puede aplicarse al estudio de diversos modelos de tumores cerebrales, incluidos los generados de novo con el uso de oncogén que codifica ADN plasmático sin alteraciones significativas en el procedimiento general. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo preparar suspensiones de células de glioma para estereotáctica e injerto en un cerebro de ratón, cómo transi tumor profuso, ratones portadores de cerebro, y cómo aislar y fluir citométricamente, analizar el glioma infiltrando células mononucleares de sangre periférica.