Name: El aislamiento y la citometría de flujo análisis de las células mononucleares de sangre periférica Glioma infiltrantes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 52 s
Description: Aprende a aislar y analizar células mononucleares de sangre periférica infiltrantes en gliomas mediante citometría de flujo. Este método proporciona datos cuantitativos temporales sobre el número y estado de activación de leucocitos en el microambiente tumoral cerebral.

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Esta obra fue financiada por los Institutos Nacionales de Salud / Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares (NIH / NINDS) otorga R01-NS074387, R01-R21-NS057711 y NS091555 al MGC; NIH / NINDS otorga R01-NS061107, R01-NS076991, R01-R21-NS082311 y NS084275 de PRL; subvenciones de Leah Corazones Felices, Universidad de Michigan Comprehensive Cancer Center adjudicado a MGC y PRL; el Departamento de Neurocirugía de la Universidad de la Escuela de Medicina de Michigan; el Instituto Michigan de Investigación Clínica y de la Salud, con el apoyo de NIH subvención 2UL1-TR000433; la Beca de Formación de Biología de la Universidad de Michigan cáncer apoyado por el NIH / NCI (National Cancer Institute) subvención T32-CA009676; la Universidad de Michigan en Capacitación Clínica y Neurociencia Básica apoyado por el NIH / NINDS conceder T32-NS007222; y la Universidad de Programa de Entrenamiento Científico Michigan Medical apoyado por el NIH / NIGMS (Instituto Nacional de Medicina General de Ciencias) conceder T32-GM007863. Los autores de unre agradecidos por el liderazgo académico y el apoyo recibido del Dr. Karin Muraszko y el Departamento de Neurocirugía; M. Dahlgren, D. TOMFORD, y S. napolitana de apoyo administrativo excelente; M. Dzaman para la asistencia técnica en circulación; y Phil F. Jenkins para el generoso apoyo para la compra de un microscopio electrónico de barrido Zeiss 3D. También reconocemos el laboratorio Kuchroo en la Escuela de Medicina de Harvard de la que se ha elaborado una versión modificada de la estrategia de los medios de comunicación mediada por centrifugación de densidad para el aislamiento de células mononucleares cerebrales.

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo describe un método robusto y reproducible para el análisis de citometría de flujo y el aislamiento de PBMCs que se han infiltrado en el microambiente tumoral temprano del ratón cerebro. Suspensiones celulares de glioma se generan a una concentración especificada por el experimentador que se estereotácticamente injertado en el cuerpo estriado del cerebro de ratón. Los ratones son entonces sacrificados en puntos de tiempo predeterminados especificados por el diseño experimental y sus cerebros se cosechan y ...

Los gliomas son una clase de cánceres de cerebro neuroepiteliales derivadas de la glía transformado dentro del sistema nervioso central (SNC). De todos los gliomas, Organización Mundial de la Salud (OMS) glioma de grado IV, o glioblastoma (GBM), es el más común y letal 1. GBM es altamente refractaria a la atención estándar de corriente que consta de la resección del tumor a la medida de lo posible seguida de radiación y quimioterapia concomitante y adyuvante con temozolomida 2. Estos cánceres mortales tienen un pronóstico sombrío de sólo 15 a 18 meses de supervivencia desde el momento del diagnóstico inicial con sólo el 5% de los pacientes que sobreviven la enfermedad después de 5 años 3. La presencia de la barrera hematoencefálica (BBB), la falta de células presentadoras de antígenos profesionales (APC), y la existencia previamente no identificado de estructuras linfáticas de buena fe dentro del cerebro 4 han dado lugar a la noción de GBM como inmune privilegiados. Sin embargo, numerosos estudios ahora show que estos cánceres de cerebro de hecho generan el reclutamiento de células inmunes periféricos que son predominantemente de origen mieloide, que incluyen monocitos, macrófagos y células supresoras mieloides derivadas de MDSCs (5). GBM también influye en la actividad de la microglia del cerebro residente para convertirse en pro-tumorigénico 6,7. Las células linfoides tales como células T CD8 + 8 y CD56 células + asesinas naturales 9 también están presentes en el microambiente del tumor, pero en mucho menor número, un hecho piensa que es debido a la función inmunosupresora instigado por factores de glioma derivado de macrófagos asociados al tumor ( TAM) 10. Las células T CD4 + también están presentes en GBM, pero gran parte de esta población también expresa CD25 y FoxP3, los responsables de inmunosupresora T reguladoras (Treg) células 11. El estado inmunosupresor general de GBM culmina en la promoción de evasión inmunológica y la progresión tumoral 12. <p class= &quot;jove_content&quot;&gt; Una mejor comprensión de los mecanismos de GBM inmunosupresión es fundamental para el desarrollo de estrategias inmunoterapéuticas eficaces para estimular el sistema inmune contra el tumor. En los últimos 15 años, nuestro laboratorio ha trabajado para superar los mecanismos de immunosuppresson tumor cerebral con el fin de desarrollar eficaces nuevas inmunoterapias anti-MBG 13-19. La culminación de este trabajo ha dado lugar a un ensayo clínico diseñado para evaluar un citotóxico combinado y terapéutico inmune-estimulantes para los pacientes con diagnóstico reciente (Identificador ClinicalTrials.gov: NCT01811992) GBM. Nuestro trabajo más reciente muestra que GL26 de ratón y de rata CNS-1 células GBM bloquean antitumoral de las células NK vigilancia inmunológica mediante la producción de grandes cantidades de la lectina de unión a β-galactosidasa-galectina-1 (Gal-1) 20. Esto se demostró mediante la supresión de la expresión de gal-1 en células de glioma usando mediada por shRNA desmontables gen. In vitro experiments mostraron que las células de glioma-gal 1-deficiente proliferaron normalmente en cultivo, sin embargo, fueron sometidos a rechazo rápido pronto después del injerto singénico intracraneal en ratones C57BL / 6J o RAG1 - / - ratones, estableciendo así la independencia de T o células B en esta forma de el rechazo del tumor. Immunodepletion células NK con anti-asialo GM 1 anti-suero o anticuerpos monoclonales NK1.1 llevó a la restauración completa de glioma intracraneal crecimiento gal-1-deficientes, se crea la función de las células NK en gal-1-deficiente rechazo glioma. Ahora demuestran que immunodepletion de las células mieloides GR-1 + / CD11b + es suficiente para prevenir el rechazo de glioma gal-1-deficiente a pesar de la presencia de células NK, revelando así un papel auxiliar indispensable para las células mieloides en la ayuda a la gal mediada por NK lisis tumoral -1-deficiente (datos no publicados). Este resultado inesperado nos ha llevado a desarrollar un protocolo integral para el aislamiento y el análisis de las células mononucleares de sangre periférica (CMSP) queinfiltrarse en el microambiente del tumor cerebral poco después el injerto intracraneal para que podamos caracterizar mejor los eventos de infiltración inmunes que predican el rechazo glioma gal-1-deficientes. El método se demuestra aquí utilizando células de glioma GL26 de ratón que la proteína fluorescente mCitrine expresan constitutivamente, llamado GL26-Cit, que permite la visualización directa de las células tumorales mediante microscopía de fluorescencia 21. Estas células se estereotácticamente injertaron en el cerebro de singénicos ratones C57BL / 6J y se dejaron crecer durante 24, 48, o 72 hr antes de la eutanasia del ratón. PBMCs glioma infiltrantes son entonces aislados y immunolabeled utilizando anti -CD45, -GR-1, -CD11b y -NK1.1 anticuerpos de la superficie celular, junto con immunolabeling intracelular de granzima B (GzmB). Esta combinación específica de anticuerpos permite la identificación de Gr-1 + / + células CD11b infiltrantes de tumores mieloides y NK1.1 +, células NK, los tipos de células que tenemos been implicado en el rechazo del tumor gal-1-deficientes. El perfil inmunológico de la infiltración gal-1-deficiente GL26-Cit glioma, se hace referencia aquí como GL26-Cit-gal1i, se compara entonces con la de gliomas que expresan niveles normales de gal-1 llamado GL26-Cit-NT que contienen un no- focalización de control shRNA horquilla. El protocolo comienza con una descripción de cómo la cultura células GL26-Cit glioma in vitro, que es seguido por una explicación sobre cómo injertar ortotópicamente estas células en el cuerpo estriado de singeneicos C57BL / 6J. A continuación, procede a enumerar los pasos implicados en el aislamiento y la inmunomarcación de PBMCs de glioma infiltrantes para el análisis de citometría de flujo. El protocolo concluye con una explicación de análisis de datos estándar y representación gráfica. La manifestación revela que tanto Gr-1 + / CD11b + células mieloides y células NK1.1 + NK preferentemente acumularse dentro del microambiente del tumor cerebral gal-1-deficientes dentro de 48h de la implantación del tumor, un resultado que ayuda a explicar por qué estos tumores se someten rápidamente lisis tumoral completa aproximadamente 1 semana injerto post-tumoral 20. El método es fácilmente adaptable a una serie de diferentes diseños experimentales in vivo en el que se requieren los datos temporales sobre la infiltración inmune en el cerebro. Un único experimentador puede realizar el protocolo de recolección cerebro para análisis citométrico de flujo de PBMCs de glioma infiltrantes en aproximadamente 4-6 horas, dependiendo del número de muestras a analizar. El método también se puede combinar con experimentos destinados para caracterizar el perfil de la circulación de PBMCs en ratones portadores de tumor para la comparación con los que se infiltran en el cerebro para identificar fenotipos de inmunosupresión específicamente inducidos por el microambiente tumoral. La aplicación de este y otros métodos debería facilitar una mejor comprensión de los factores que intervienen en el tráfico de células inmunes periféricas en el microambiente del tumor cerebral.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco' s Modificación de Eagles Medium</td><td>Gibco</td><td>12430-054</td><td>con 4,5 g/L de D-glucosa, L-glutamina, 25 mM de HEPES y rojo de fenol;</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Solución salina tamponada con fosfato&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>14190-144&nbsp;</td><td>sin cloruro de calcio ni cloruro de magnesio</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Omega Scientific Inc.</td><td>FB-11</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina Estreptomicina&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>10.000 U/ml Penicilina; 10.000 &mu; g/ml de estreptomicina&nbsp;</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td>200 mM</td></tr><tr><td>G418 sulfato&nbsp;</td><td>Omega Científico Inc.</td><td>GN-04</td><td></td></tr><tr><td>Dihidrocloruro de puromicina&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8833</td><td>de Streptomyces alboniger</td></tr><tr><td>HyClone HyQTasa alternativa a la tripsina no mamífera&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>SV30030.01</td><td>en DPBS con EDTA&nbsp;</td></tr><tr><td>Hemocitómetro de contraste</td><td>de fase Sigma-Aldrich</td><td>Z359629</td><td>0,1 mm de profundidad</td></tr><tr><td>Tinción azul de tripán</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Inyección estéril de NaCl al 0,9%, USP</td><td>Hospira</td><td>NDC: 0409-4888</td><td>viales de 10 ml</td></tr><tr><td>Microtubos cónicos de polipropileno de 0,6 ml</td><td>Genesee Scientific</td><td>22-272</td><td></td></tr><tr><td>Inyección de clorhidrato de atipamezol</td><td>Orion Pharma</td><td>NDC: 52483-6298</td><td>Solución de 5 mg/ml</td></tr><tr><td>Inyección de clorhidrato de ketamina</td><td>Fort Dodge</td><td>NDC: 0409-2051 Solución de</td><td>100 mg/ml</td></tr><tr><td>Inyección de clorhidrato de dexmedetomidina</td><td>Zoetis</td><td>NDC: 54771-2805</td><td>Solución de 0,5 mg/ml</td></tr><tr><td>Inyección de clorhidrato de xilacina</td><td>Lloyd</td><td>NDC: 61311-481</td><td>Solución de 100 mg/ml Inyección</td></tr> de <tr><td>carprofeno</td><td>Pfizer</td><td>NDC: 61106-8501</td><td>50 mg/ml solución</td></tr><tr><td>Clorhidrato de buprenorfina inyectable</td><td>Reckitt Benckiser</td><td>NDC: 12496-0757</td><td>ampollas de 0,3 mg/ml</td></tr><tr><td>jeringas de tuberculina de 1 ml&nbsp;</td><td>Covidien</td><td>8881501400</td><td></td></tr><tr><td>26G x &frac12; (0,45 mm x 13 mm) agujas de jeringa&nbsp;</td><td>BD</td><td>305111</td><td></td></tr><tr><td>Cortaúñas quirúrgicas</td><td>3M</td><td>9661</td><td></td></tr><tr><td>Providona solución de yodo</td><td>Aplicare</td><td>82-217</td><td>NDC: 52380-1905</td></tr><tr><td>Pomada oftálmica estéril de vaselina&nbsp;</td><td>Dechra</td><td>NDC: 17033-211</td><td></td></tr><tr><td>Almohadillas de preparación con alcohol isopropílico al 70%</td><td>Kendall</td><td>6818</td><td></td></tr><tr><td>Gasa estéril</td><td>Covidien</td><td>8044</td><td>no tejida, 4" x 4", 4 capas&nbsp;</td></tr><tr><td>Microtubos cónicos de polipropileno de 1,7 ml</td><td>Genesee Scientific</td><td>22-281</td><td></td></tr><tr><td>Marco estereotáctico de ratón</td><td>Stoelting</td><td>51730</td><td></td></tr><tr><td>Lámpara quirúrgica</td><td>Philips Burton</td><td>CS316W</td><td>Coolspot II Foco variable</td></tr><tr><td>Pinza de disección curva</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>5431</td><td></td></tr><tr><td>Retractores Colibrí&nbsp;</td><td>FST</td><td>17000-03</td><td></td></tr><tr><td>Taladro eléctrico de precisión inalámbrico</td><td>Dremel&nbsp;</td><td>1100-01</td><td>Modelo de palpador; Iones de litio de 7,2 voltios con estación de acoplamiento</td></tr><tr><td>Cortador de grabado</td><td>Dremel</td><td>Jeringa de microlitros de 105</td><td>1/32" o 0,8 mm de diámetro de broca</td></tr><tr><td></td><td>Hamilton</td><td>75</td><td>Jeringas de microlitros Hamilton serie 700; 5 &mu; l volumen</td></tr><tr><td>Agujas de jeringa de microlitro</td><td>Hamilton</td><td>7762-06</td><td>33 G, cubo pequeño RN NDL, 1,5 pulgadas, estilo de punta 3, 6/PK</td></tr><tr><td>Ethilon 3-0 suturas de nailon monofilamento negro&nbsp;</td><td>Ethicon</td><td>1663</td><td></td></tr><tr><td>Barra agitadora magnética</td><td>VWR</td><td>74950-296</td><td>7,9 mm de diámetro x 50 mm de largo (5/16" de diámetro x 2" de longitud)</td></tr><tr><td>1 L de vidrio con tapón de rosca</td><td>Corning</td><td>1395</td><td>Tipo 1, Clase A vidrio de borosilicato</td></tr><tr><td>Heparina sódica&nbsp;</td><td>Sagent</td><td>NDC: 25021-400</td><td>Solución de 1.000 U/ml</td></tr><tr><td>Bomba peristáltica</td><td>Cole Parmer Instruments Group</td><td>77200-60</td><td>Master Flex Easy Load II con mando de consola</td></tr><tr><td>Carbogen comprimido (95% O2 / 5% CO2)</td><td>disponible en el proveedor local</td><td>N/A</td><td>Tipo A, cilindro grande&nbsp;</td></tr><tr><td>20 G x 1 y frac12; " cubo de aluminio agujas romas</td><td>Kendall 8881202363</td><td></td><td>0.9 mm x 38.1 mm</td></tr><tr><td>Cubo de hielo de poliuretano</td><td>Fisherbrand</td><td>02-591-45</td><td>Capacidad: 0.152 oz. (4.5L)</td></tr><tr><td>Colagenasa (Tipo I-S)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C1639</td><td>de Clostridium histolyticum&nbsp;</td></tr><tr><td>Desoxirribonucleasa I</td><td>Worthington Biochemical Corp.</td><td></td><td>LS002007>2.000 unidades Kunitz por mg de peso seco</td></tr><tr><td>Platos de pesaje hexagonales de poliestireno antiestático</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>20157-3</td><td>diámetro interno superior 115 mm, diámetro interno base 85 mm, volumen de 203 ml;</td></tr><tr><td>Hojas de afeitar de acero inoxidable de un solo filo&nbsp;</td><td>Garvey</td><td>40475</td><td></td></tr><tr><td>Rongeurs de hueso</td><td>FST</td><td>16001-15</td><td></td></tr><tr><td>Hemostático</td><td>FST</td><td>13014-14</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de disección grandes</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>1316</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de disección pequeñas</td><td>FST</td><td>14094-11</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas de punta roma</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>13250</td><td></td></tr><tr><td>Molinillo de tisú Dounce de vidrio de 7 ml</td><td>Kontes</td><td>KT885300-0007</td><td></td></tr><tr><td>Percoll Medios de centrifugación de densidad&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>GE17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>pipetas serológicas de 10 ml</td><td>Genesee Scientific</td><td>12-104</td><td>de un solo uso; estériles</td></tr><tr><td>70 &mu; m coladores de celdas de malla de nailon estériles&nbsp;</td><td>Fisherbrand</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 700-conjugado rat anti-ratón CD45 (clon: 30-F11)</td><td>Biolegend</td><td>103128</td><td></td></tr><tr><td>ratón conjugado APC anti-ratón NK1.1 (clon: PK136)</td><td>eBiosciences&nbsp;</td><td>17-5941-82</td><td></td></tr><tr><td>Rata anti-ratón conjugada con PE Gr-1 (clon: RB6-8C5)</td><td>BD Pharmigen</td><td>553128</td><td></td></tr><tr><td>PerCP/Cy5.5-conjugada rata anti-ratón CD11b (clon: M1/70)&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>101228</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 700 rata conjugada IgG2b, &kappa; (clon: RTK4530) control de isotipos&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>400628</td><td></td></tr><tr><td>ratón conjugado con APC IgG2a, &kappa; (clon: eBM2a) control de isotipos&nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>17-4724</td><td></td></tr><tr><td>IgG2b de rata conjugada con PE, &kappa; (clon: eB149/10H5) control de isotipos&nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>12-4031-82</td><td></td></tr><tr><td>IgG2b de rata conjugada con PerCP/Cy5.5, &kappa; (clon: RTK4530) control de isotipo</td><td>Biolegend</td><td>400632</td><td></td></tr><tr><td>granzima B anti-ratón conjugado con azul del Pacífico (clon: GB11)&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>515403</td><td></td></tr><tr><td>Ratón conjugado azul del Pacífico IgG1, &kappa; (Clon: MOPC-21) control de isotipos&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>400151</td><td></td></tr><tr><td>Cytofix/Cytoperm</td><td>BD 554714</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tubos de centrífuga de polipropileno de 15 ml</td><td>Genesee Scientific</td><td>21-103</td><td>fondo cónico&nbsp;</td></tr><tr><td>Tubos centrífugos de polipropileno de 50 ml</td><td>Genesee Scientific</td><td>21-108</td><td>fondo cónico</td></tr><tr><td>12 mm x 75 mm tubos FACS de polipropileno de fondo redondo&nbsp;</td><td>Fisherbrand</td><td>14-956-1B</td><td></td></tr><tr><td>FACSAria Pedido especial Investigación Citómetro de flujo/clasificador de celdas</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>650033</tr><tr><td>Cabina de seguridad biológica de clase II Modelo</td><td>SG603</td> de <td>The Baker Company</td><td>: SterilGARD III Advance</td></tr></tbody></table>

el aislamiento y la citometría de flujo análisis de las células mononucleares de sangre periférica glioma infiltrantes

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

Nuestro laboratorio ha demostrado recientemente que las células asesinas naturales (NK) son capaces de erradicar ortotópicamente implantado GL26 de ratón y de rata CNS-1 gliomas malignos pronto después del injerto intracraneal si las células cancerosas se vuelven deficientes en su expresión de la galectina lectina β-galactósido vinculante -1 (gal-1). Un trabajo más reciente ahora demuestra que una población de células mieloides Gr-1 + / CD11b + es fundamental en este sentido. Para comprender mejor los mecanismos por los cuales NK y células mieloides cooperan para conferir el rechazo del tumor gal-1-deficiente hemos desarrollado un protocolo completo para el aislamiento y análisis de las células mononucleares de sangre periférica de glioma infiltrantes (PBMC). El método se demuestra aquí comparando PBMC infiltración en el microambiente tumoral de gal-1 que expresan GL26 gliomas con los prestados gal-1-deficientes través shRNA desmontables. El protocolo comienza con una descripción de cómo la cultura y preparar GL26 ceLLS para la inoculación en el singénico C57BL / 6J cerebro de ratón. A continuación, se explican los pasos que intervienen en el aislamiento y el flujo de análisis de citometría de glioma de PBMCs infiltrarse desde el microambiente tumoral temprano del cerebro. El método es adaptable a una serie de diseños experimentales in vivo en el que se requieren los datos temporales sobre la infiltración inmune en el cerebro. El método es sensible y altamente reproducible, como PBMCs de glioma infiltrantes pueden ser aislados de tumores intracraneales tan pronto como 24 hr injerto post-tumor con recuentos de células similares observados desde el punto emparejado tumores tiempo a lo largo experimentos independientes. Un único experimentador puede realizar el método de la cosecha cerebro para análisis citométrico de flujo de PBMCs de glioma infiltrantes en aproximadamente 4-6 horas, dependiendo del número de muestras a analizar. Modelos alternativos de glioma y / o anticuerpos de detección de células específicas también pueden utilizarse a discreción de los experimentadores &#39;para evaluar la infiltración de varios otros immuntipos e celulares de interés sin la necesidad de modificaciones en el procedimiento general.

La estrategia gating siguiente se utiliza para un experimento típico: FSC-A vs SSC-A → SSC-H vs SSC-W → FSC-H vs FSC-W → CD45 vs. recuento → Gr-1 vs. CD11b → NK1.1 vs. recuento. Puertas coloca en Gr-1 células mieloides + / CD11b + y las células NK1.1 + NK son estratificados basados ​​en la expresión GzmB (Figura 5A). Backgating las células identificadas como células NK1.1 + NK y Gr-1 + / CD11b + células mieloides en nuestros experimentos ...

Se presenta aquí un método sencillo para el aislamiento y análisis de citometría de flujo de células mononucleares de sangre periférica de glioma infiltrantes que produce datos cuantitativos dependientes del tiempo sobre el número y el estado de activación de las células inmunes que entran en el microambiente tumoral temprano del cerebro.

El aislamiento y la citometría de flujo análisis de las células mononucleares de sangre periférica Glioma infiltrantes

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...

El objetivo general de este procedimiento es caracterizar y cuantificar el número de células mononucleares de sangre periférica que se han infiltrado en el microambiente del tumor cerebral temprano. Este método puede ayudar a abordar preguntas clave en el campo de la inmunología de tumores cerebrales mediante la identificación de factores importantes para el tráfico de células inmunitarias periféricas en el microambiente del tumor cerebral. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona datos cuantitativos dependientes del tiempo sobre el número y el estado de activación de los leucocitos que han entrado en este SNC.Después de colocar un ratón anestesiado en un marco estereotáctico, haga una incisión de dos centímetros en la línea media sobre el cráneo desde el hueso frontal hasta el hueso occipital con una hoja de bisturí. A continuación, retraiga la piel en la incisión con los retractores Collibra. Después de eso, baje una jeringa de microlitros equipada con una aguja de calibre 33 directamente sobre el bma.Ajuste la posición de la aguja para llegar al sitio objetivo para la implantación del tumor. A continuación, utilice una jeringa de tuberculina de un mililitro equipa

isolation-flow-cytometric-analysis-glioma-infiltrating-peripheral

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

El presente artículo describe un protocolo rápido para aislar eficazmente células mononucleares de tejidos de la médula espinal y el cerebro que puede ser efectivamente utilizado para el análisis de citometría de flujo.

Aislamiento de células del cerebro y la médula espinal mononucleares uso de gradientes de Percoll

Este protocolo de video demuestra la aplicación de el colorante fluorescente carboxifluoresceína succinimidil éster (CFSE) para la identificación y separación de los diferentes sub-poblaciones de células de glioblastoma humano en base de la frecuencia de la división celular.

La identificación y aislamiento de Slow división de las células de glioblastoma humano utilizando carboxi fluoresceína Succinimidyl Ester (CFSE)

El video muestra el aislamiento de células mononucleares de sangre periférica infiltrantes de tumores del cerebro de un ratón utilizando disociación mecánica y digestión enzimática. A esto le sigue la centrifugación en gradiente de densidad para recoger las células inmunitarias para su posterior análisis.

Aislamiento de células inmunitarias infiltrantes de tumores de un cerebro murino

La inflamación juega un papel central en la patogénesis del ictus isquémico. Cada vez hay más pruebas que sugieren que actúa como un arma de doble filo que exacerba las lesiones cerebrales tempranas, pero también contribuye a la reparación posterior. Este protocolo describe el aislamiento de células inmunitarias del cerebro isquémico y su posterior fenotipado por citometría de flujo.

Aislamiento y análisis de citometría de flujo de células inmunes del cerebro isquémico Ratón

Este protocolo proporciona un análisis de las subpoblaciones de macrófagos en el sistema nervioso central del ratón adulto mediante citometría de flujo y es útil para el estudio de múltiples marcadores expresados ​​por estas células.

Análisis de microglia y macrófagos derivados de monocitos del sistema nervioso central por citometría de flujo

Este protocolo fue desarrollado para identificar cuantitativamente los componentes del microambiente tumoral en resecciones de pacientes con glioblastoma usando inmunohistoquímica cromogénica e ImageJ.

Inmunohistoquímica Cuantitativa del Microambiente Celular en Resecciones de Glioblastoma Paciente

Este manuscrito presenta un protocolo para inducir la encefalomielitis autoinmune experimental activa (EAE) en ratones. También se presenta un método para el aislamiento y caracterización de los linfocitos infiltrados en el sistema nervioso central (SNC) para mostrar cómo los linfocitos participan en el desarrollo de la enfermedad autoinmune del SNC.

Análisis citométrico de flujo de infiltración de linfocitos en el sistema nervioso central durante la encefalomielitis autoinmune experimental

Presentamos un método para replicar el microambiente tumoral de glioma en el frente invasivo que incorpora flujo de líquido intersticial. Este modelo es un hidrogel de hialuronano-colágeno I en un inserto de cultivo de tejidos donde se puede aplicar un cabezal de presión de fluido. La invasión se puede cuantificar y las células se pueden aislar o lisar.

Un modelo fotopolimerizable de ácido hialurónico-colágeno del microambiente de glioma invasivo con flujo intersticial

La identificación de la microglía (MG) y los macrófagos infiltrantes periféricos (Mø) en la médula espinal lesionada es difícil. En este protocolo, se utilizó la citometría de flujo (FCM) para identificar MG similares a M1, MG similares a M2, Mø similares a M1 y Mø similares a M2, respectivamente. Esta tecnología también se puede aplicar a otras enfermedades del sistema nervioso central para comprender el papel de MG y Mø.

Identificación de microglía y macrófagos infiltrantes periféricos en la médula espinal lesionada mediante citometría de flujo

Aquí, presentamos un protocolo para evaluar la función de las células inmunitarias después de un accidente cerebrovascular isquémico utilizando el análisis de citometría de flujo en un modelo de mini-accidente cerebrovascular. Este método permite un examen detallado de las interacciones neuroinmunes y puede adaptarse para el estudio de otras enfermedades neurodegenerativas, mejorando nuestra comprensión de las respuestas inmunes en la patología del ictus.

Aislamiento y evaluación por citometría de flujo de las interacciones neuroinmunes en un modelo murino de mini-ictus

Aprende a aislar y analizar células mononucleares de sangre periférica infiltrantes en gliomas mediante citometría de flujo. Este método proporciona datos cuantitativos temporales sobre el número y estado de activación de leucocitos en el microambiente tumoral cerebral.

El aislamiento y la citometría de flujo análisis de las células mononucleares de sangre periférica Glioma infiltrantes

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