Poligráfico Procedimiento de Grabación en medición del sueño en ratones

El objetivo general de este procedimiento de registro poligráfico es determinar el estado de vigilancia de los ratones y medir el tiempo que pasan en vigilia, sueño con movimientos oculares rápidos o sueño con movimientos oculares no rápidos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en casi todos los campos de la neurociencia que buscan correlacionar el comportamiento y la fisiología con la actividad de las neuronas corticales en animales que se comportan. La principal ventaja de esta técnica es que puede registrar una gran cantidad de ganglios, electroencefalograma y electromiograma y se puede combinar con otros implantes cerebrales como fibras ópticas y cánulas de infusión.

La demostración visual de este método es muy importante porque la implantación del electrodo debe realizarse correctamente y la calidad del electrodo es extremadamente crítica para juzgar los estados físicos. El encargado de demostrar el procedimiento será Yohko Takata, un postdoc de mi laboratorio. Antes de comenzar, esterilice todas las herramientas quirúrgicas en un esterilizador de perlas calientes.

Una vez que se confirme que el ratón está anestesiado con un pellizco en el dedo del pie, afeita el vello de la cabeza y el cuello. A continuación, asegure la casa al marco estereotáxico y fije la cabeza entre las dos barras de la oreja. Luego, aplique ungüento oftálmico en los ojos para evitar la sequedad.

Proceda a limpiar la piel afeitada con exfoliantes a base de alcohol y yodo. Luego, corte a lo largo de la línea media con un bisturí para exponer el cráneo y asegure la piel a un lado con clips para mantener abierta el área quirúrgica. Con un cortador de carburo con un taladro de 0,8 milímetros, haga dos agujeros.

Coloque un orificio sobre el área cortical frontal. Coloque el segundo orificio sobre el área parietal del hemisferio derecho. A continuación, con un destornillador de joyero, atornille los tornillos de registro de EEG de acero inoxidable en los agujeros.

Inserte los tornillos con solo dos vueltas y media para obtener el posicionamiento epidural sobre la corteza. Los tornillos no deben moverse una vez insertados. Esto es muy importante.

Ahora, fije el conjunto de electrodos con las clavijas hacia arriba hasta el cráneo. Los electrodos deben colocarse en línea recta. Use un hisopo de algodón para ayudar a asegurar la posición del electrodo y pegue el electrodo con cianoacrilato seguido de cemento dental.

A continuación, haga pequeños agujeros en el trapecio e inserte el electrodo EMG en esos agujeros. A continuación, sutura la piel con hilo de seda de 0,1 milímetros de diámetro. Ahora, retire el mouse del marco estereotáxico y colóquelo en una almohadilla térmica.

Administre al ratón inyecciones intraperitoneales de ampicilina y meloxicam y controle al ratón hasta que recupere la decúbito esternal. Luego, aloja al ratón solo. Una semana después de implantar los electrodos, transfiera el ratón a una jaula experimental en una cámara de grabación insonorizada.

Fije el conjunto de electrodos de EEG/EMG del ratón a un cable de grabación conectado a un anillo colector. Conecte el cable convertidor AD a un amplificador de filtro de señal EEG/EMG conectado al anillo colector. Utilice un convertidor AD para convertir la señal en una señal digital de 128 hercios y, finalmente, grabe la señal en una computadora.

Habitúa al ratón durante dos o tres días en la cámara de grabación. Si el registro de EEG/EMG incluye la administración de fármacos, manipule suavemente el ratón cada día como aquellos en los que se administró un fármaco. A continuación, inicie el software de registro de EEG/EMG.

Para comenzar, haga clic en la pestaña Información del archivo de datos y haga clic en el cuadro junto al Nombre del archivo. Introduzca un nombre de archivo y haga clic en Guardar. A continuación, en la pestaña Condición de grabación, seleccione todos los canales de EEG/EMG que deben registrarse.

Además, seleccione la Frecuencia de muestreo en esta pestaña. Ahora, en la pestaña Información del canal, verifique si los canales seleccionados se muestran correctamente. Una vez confirmado, inicie el registro seleccionando primero la pestaña Configuración del temporizador.

A continuación, haga clic en monitor para mostrar EEG y EMG. Si las señales se muestran correctamente, configure la hora del reloj para el inicio y el final de la grabación en el área del temporizador principal. A continuación, haz clic en el botón Monitor para iniciar la grabación.

Ahora, registre las señales en condiciones de referencia y diferentes condiciones de tratamiento durante varios días. Cuando termine el experimento, eutanasia al ratón con pentobarbital. Inicie el software para el análisis de EEG/EMG.

Abra los datos sin procesar de EEG/EMG, que es un archivo KCD. Haga clic en la pestaña Suspensión y establezca el tiempo de época en 10 segundos. A continuación, seleccione Cribado múltiple para puntuar automáticamente las diez épocas de segundos en tres etapas en función de las amplitudes del EEG y el EMG y en función del análisis espectral de potencia del EEG.

A continuación, haga clic en la pestaña Condición FFT para EEG. Allí, establezca los parámetros para el análisis espectral de potencia. Utilice 256 puntos de referencia correspondientes a cada dos segundos de EEG, utilice la función de ventana de Hamming y utilice una media de cinco espectros por época.

A continuación, haga clic en Aceptar.Ahora, haga clic en Iniciar cribado para comenzar el cribado automático. A continuación, abra los datos almacenados, que se guardan en un formato de archivo RAF y compruebe los resultados del cribado automático. Según sea necesario, corrija los resultados si no cumplen con los criterios estándar.

Para realizar una corrección, haga clic y mantenga pulsado el botón izquierdo del ratón en una época puntuada incorrectamente y arrastre el cursor por la cadena de épocas puntuadas incorrectamente. Suelte el botón izquierdo del ratón y seleccione el estado de comportamiento correcto en la ventana emergente. En condiciones basales, los ratones exhibieron un claro ritmo circadiano de sueño-vigilia consistente con su naturaleza nocturna.

Durante el período de luz de 12 horas, los ratones tuvieron un promedio de 6,7 horas de sueño NREM y 0,9 horas de sueño REM. Mientras que, durante su período de oscuridad de 12 horas, predominó la vigilia. También se registraron otras mediciones.

Estos incluyeron la distribución de la época de sueño, sus duraciones medias y las transiciones de etapa para cada estado de vigilancia. Los espectros de potencia de EEG para el sueño NREM y REM muestran una fuerte densidad de potencia de EEG en el rango de frecuencia de 0,5 a cuatro hercios para el sueño NREM en comparación con una densidad de potencia de seis a 10 hercios para el sueño REM. Para evaluar el impacto de la cafeína en el sueño, los ratones C57 black 6 fueron tratados con un vehículo un día y con cafeína al día siguiente.

Las inyecciones intraperitoneales de cafeína se administraron al principio del ciclo de luz. Como se esperaba, la grabación reveló que la cafeína aumentó la cantidad de vigilia en los ratones. Se produjo un aumento de tres veces en la vigilia durante tres horas después de la inyección.

Una vez dominado, el procedimiento de implantación de electrodos se puede realizar en menos de 20 minutos. La puntuación y corrección de los datos del EEG durante un período de 24 horas se puede realizar en unos 30 minutos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo configurar la grabación del electroencefalograma y el electromiograma en ratones y cómo evaluar si un animal está despierto o dormido y cuánto tiempo.