Name: Aislamiento de CD 90+ fibroblastos / miofibroblastos de congelados Humanos gastrointestinales Especímenes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 2 s
Description: Aprenda a aislar fibroblastos y miofibroblastos CD90+ viables a partir de tejidos gastrointestinales humanos congelados. Este protocolo permite el procesamiento diferido de muestras para estudios de reparación tisular y fibrosis.

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Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Salud (1R01DK103150-01A1, T32 DK007639, R01CA175803, K08CA125209) y el Instituto de Ciencias Traslacionales de la Rama Médica de la Universidad de Texas, y un Premio de Ciencias Clínicas y Traslacionales (8UL1TR000071).

El protocolo para la obtención de tejidos humanos descartados de pacientes quirúrgicos y el establecimiento de cultivos primarios fue aprobado por la Universidad de Texas Medical Branch y la Universidad de Nuevo México Juntas de Revisión Institucional. Los requisitos generales para la obtención de muestras de tejido humano se describen a continuación. Tenga en cuenta que desde MFs puede ser aislado de tejido congelado, bancos de datos genéticos y vendedores comerciales son también opciones viables. 1. Obtener Tejidos Humanos <ol><li> Presentar un protocolo para obtener tejido de colon humano a la junta de revisión institucional para su aprobación. </li><li> Establecer colaboraciones con los cirujanos generales y / o cirujanos colorrectales con el fin de obtener los tejidos humanos para la investigación. La colaboración con el departamento de patología también es obligatoria, ya que estarán determinando el tejido que no es necesaria para el diagnóstico y puede ser designado para la investigación. </li><li> Asesorar al patólogo para proporcionar tejido de la neoplasia y luego Grossly mucosa normal al menos 5 cm desde el tumor. Coloque inmediatamente las muestras en medios de lavado enfriado con hielo y colocarlo en hielo. El patólogo determinará la cantidad de tejido que se puede dar de forma segura para la investigación. El tejido mínima requerida para el aislamiento MF es 1,5 mm 2. </li><li> Utilice el tejido obtenido de forma inmediata para establecer los cultivos primarios o congelación y lugar a -80 ° C para el futuro aislamiento. <ol><li> Si la congelación para el aislamiento después, cortar el tejido en aproximadamente 1 - 2 mm 2 piezas, colocar en un tubo criogénico con 1 ml de medio de congelación (véase más adelante), y se almacena a -80 ° C. Nota: La utilización de este protocolo, se ha observado el aislamiento con éxito de FMs del tejido congelado durante más de 4 años. </li></ol></li></ol> 2. Prepare Reactivos <ol><li> Para la solución de colagenasa: Preparar 100 U / ml de colagenasa I, II y IV en solución salina equilibrada de Hank (HBSS) con Ca2 + / Mg2 + (ver Tabla Materiales </strong&gt;). PRECAUCIÓN: La colagenasa concentración unidad activa y la pureza puede varía de un proveedor a otro, lo que puede impedir la eficiencia de la digestión del tejido y / o conservación del epítopo en la superficie celular de la mucosa. Para evitar estos peligros potenciales, utilice la colagenasa con más alto grado de pureza (≥95%) y preparar la solución madre basado en la concentración de unidades activas. </li><li> Prepare la solución de DNasa social a base de agua a 10 mg / ml (3,55 UA / mg). </li><li> Preparar los medios de lavado: (MEM: 89 ml, antibiótico-antimicótico, 100x: 1 ml; FCS inactivado por calor: 10 ml) </li><li> Preparar fibroblastos crecimiento de los medios: MEM: botella de 500 ml; L-glutamina (200 mM): 5 ml; Aminoácidos no esenciales MEM, 100x solución: 5 ml; ciprofloxacina HCl (10 mg / ml): 570 l; Antibiótico-antimicótico, solución 100x: 10 ml; piruvato de sodio (100 mM): 5 ml; FCS inactivado por calor: 50 ml </li><li> Preparar medios Freeze: medios de crecimiento de fibroblastos (Reactivo 2,4) con la adición de 10% sulfóxido de dimetilo (DMSO), a continuación, filtrar-sterilize con un filtro de 0,22 micras. </li></ol> Tejido 3. enzimáticamente Digesto Humano <ol><li> Si el tejido se congeló en los medios de congelación, lugar criovial en caliente (~ 37 ° C) agua hasta que se descongela el tejido y medios de comunicación. </li><li> Para 4 - 5 de 2 mm 2 piezas de tejido, tejido lavar dos veces con 10 ml de HBSS sin Ca 2 + / Mg2 +. </li><li> Una vez que el tejido se ha asentado por gravedad, desechar cuidadosamente el sobrenadante sin girar la muestra. </li><li> Añadir 10 ml de la solución de colagenasa a la muestra y transferir la mezcla tejido-solución en un tubo estéril, DNasa / RNasa libre con una función de rotores para muestra de disociación. Utilice la colagenasa para disociar la matriz extracelular que rodea el aspecto basal de las células epiteliales y forma la fracción no celular de la lámina propia de la mucosa. </li><li> Cierre bien el tubo y coloque boca abajo en el manguito del disociador (por ejemplo, gentleMACS). Si el laboratorio no tiene acceso a la tél antes mencionados equipos, aumentar el tiempo de cada etapa de digestión de obtener resultados comparables. </li><li> Ejecute el h_tumor_01 Programa, un perfil preestablecido incluye con la máquina (duración total de 36 seg, con pulsos intermitentes que van desde 1.000 - 4.000 rpm, con 268 rondas por corrida). </li><li> Después de la terminación del programa, desconecte el tubo de la disociador. </li><li> Incubar la muestra durante 45 min a 37 ° C bajo rotación continua en agitador a 140 rpm. Nota: Para cantidades variables de muestras de tejido, el tiempo de digestión puede reducirse o aumentarse proporcionalmente (es decir, mayores cantidades de tejido pueden requerir tiempo adicional). </li><li> Conecte el tubo boca abajo en el manguito del disociador. </li><li> Elija y ejecutar el Programa h_tumor_02 (duración total de 37 seg, con pulsos intermitentes que van desde 1.000 - 4.000 rpm, con 235 rondas por corrida). </li><li> Después de la terminación del programa, desconecte el tubo de la disociador. </li><li> Añadir 50 l de solución de DNasa. Utilice DNAsa disociar / eliminar las células muertas y la fracción de ADN de los restos celulares que conduce a la celda aglutinación. </li><li> Incubar la muestra durante 30 min a 37 ° C bajo rotación continua en agitador a 60 rpm. </li><li> Conecte el tubo boca abajo en el manguito del disociador de nuevo. </li><li> Elija y ejecutar el Programa h_tumor_03 (duración total de 37 seg, con pulsos intermitentes que van desde 1.000 - 4.000 rpm, con 168 rondas por corrida). Nota: Si el tejido no se digiere completamente, centrifugar a 250 xg durante 10 min a 20 ° C, desechar el sobrenadante, resuspender en 2 ml de solución de disociación celular y se incuba a TA durante 10 min. </li><li> Pasar la suspensión celular a través estéril filtro celular 70 micras. </li><li> Centrifugar la suspensión celular a 250 × g durante 10 min a 20 ° C. Aspirar el sobrenadante por completo. </li><li> Pellet lavado de células dos veces con 25 ml de HBSS sin Ca 2 + / Mg2 + y descartar el sobrenadante. </li><li> Antes de la última erah, el recuento del número de células utilizando un sistema automatizado conteo de células disponibles en el laboratorio o manualmente mediante hemocitómetro. Para MF generación cultivo primario proceder para el paso 3.19.1, para el análisis o clasificación de FMs mediante citometría de flujo proceder para el paso 3.19.2. <ol><li> Para el aislamiento y el crecimiento de la cultura MF pura (Figura 1), descartar el sobrenadante de la última centrifugación, el sedimento celular se resuspende en la cantidad apropiada de medios de aislamiento de fibroblastos necesaria para sembrar hasta 4 x 10 6 células en 3 ml de los medios de comunicación por pocillo en 6 platos así, tratados con cultivo celular. Continúe con el paso 3.20. </li><li> Para el análisis o clasificación de FMs mediante citometría de flujo, colocar hasta 2 x 10 6 en 2 ml de medio de aislamiento de fibroblastos de 24 pocillos, placa de bajo vinculante e incubar O / N a 37 ° C con 5% de CO 2. Esta es restaurar los epítopos de la superficie celular que pueden ser afectados por el procedimiento enzimático. Luego recoger suspensión celular y contar células recuperadas y procederpara la inmunotinción y citometría de flujo análisis 8. </li></ol></li><li> Crecer células a 37 ° C con 5% de CO 2. Cambie los medios de comunicación cada 2 - 3 días hasta que la formación de ~ 80% de confluencia MF monocapa (Figura 1D-E). </li><li> Células pasaje en matraces T25 con de 6 placa de pocillos a una relación de 1: 1 y crecer durante ~ 10 - 14 días en medio de crecimiento de fibroblastos para alcanzar 80 - 100% de confluencia. </li><li> Expandir cultivo mediante pases de células T25 T75 a las células a una relación de 1: 2. Una vez que las células alcanzan la confluencia, puede utilizarse un matraz para el análisis de pureza MF aislado utilizando por citometría de flujo como se describió previamente 5. Congele o pasaje otro matraz T75 de la cultura MF en relación 1: 3. Nota: Cuando se analizaron por citometría de flujo, se espera que GI mucosa del estroma MF de origen mesenquimal al crecer en la cultura tendrá siguiente fenotipo: EpCAM-, CD31-, CD45-, vimentina +, α-SMA +, CD90 +. </li></ol>

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<li>Schiller, J. H., Bittner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+the+Tumorigenic+Phenotype+with+in+Vitro%2C+but+not+in+Vivo%2C+Passaging+of+a+Novel+Series+of+Human+Bronchial+Epithelial+Cell+Lines%3A+Possible+Role+of+an+%CE%B15%2F%CE%B21-Integrin-Fibronectin+Interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Loss of the Tumorigenic Phenotype with in Vitro, but not in Vivo, Passaging of a Novel Series of Human Bronchial Epithelial Cell Lines: Possible Role of an α5/β1-Integrin-Fibronectin Interaction.</a> Cancer Res. 55, 6215-6221 (1995).</li>
<li>Augello, A., Kurth, T. B., De Bari, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells%3A+a+perspective+from+in+vitro+cultures+to+in+vivo+migration+and+niches%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Cell+Mater%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells: a perspective from in vitro cultures to in vivo migration and niches.</a> Eur Cell Mater. 20, 121-133 (2010).</li>
<li>Meller, D., Pires, R. T. F., Tseng, S. C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+preservation+and+expansion+of+human+limbal+epithelial+stem+cells+on+amniotic+membrane+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Ex vivo preservation and expansion of human limbal epithelial stem cells on amniotic membrane cultures.</a> Br J Ophthalmol. 86, 463-471 (2002).</li>
<li>Kuhlmann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prophylactic+use+of+antibiotics+in+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">The prophylactic use of antibiotics in cell culture.</a> Cytotechnology. 19, 95-105 (1995).</li>
<li>Morris, K. T., Nofchissey, R. A., Pinchuk, I. V., Beswick, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+Macrophage+Migration+Inhibitory+Factor+Exposure+Induces+Mesenchymal+Epithelial+Transition+and+Promotes+Gastric+and+Colon+Cancers%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Chronic Macrophage Migration Inhibitory Factor Exposure Induces Mesenchymal Epithelial Transition and Promotes Gastric and Colon Cancers.</a> PLoS ONE. 9, e98656(2014).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Aunque este protocolo fue desarrollado para la aplicación de investigación única, a la luz de la creciente importancia crítica de las células del estroma como un posible cáncer de biomarcadores pronósticos y diana terapéutica, la capacidad de congelar bioespecímenes &quot;funcionales&quot; para su uso posterior ofrece una ventaja significativa. Esto representa una ventaja única para la creación de biorepositorio clínica, que puede servir como herramientas adicionales que sirven para avanzar en el desarrollo de la medici...

Los miofibroblastos / fibroblastos (MFS) representan una abundante población de células en el tracto gastrointestinal (GI) mucosa. Estas células estromales se encuentran justo por debajo del epitelio y forman una red interconectada dentro de la lámina propia de la mucosa en el intestino. MFs no sólo sean responsables de la deposición de la matriz extracelular, pero a través de la regulación paracrina puede influir en el transporte de electrolitos, restitución, y la función de barrera del epitelio adyacente 1, 2. Además, MFs han demostrado que desempeñan un papel clave en la inflamación y el tejido remodelación de 3, 4. Los miofibroblastos son una parte crítica del microambiente tumoral, en donde también se les conoce como los fibroblastos asociados al cáncer, y contribuyen al crecimiento de las células tumorales y sirven como un nicho de células madre del cáncer 3. Datos emergentes sugieren que FMs también puede servir células presentadoras de antígenos como locales. Además, la función FMs como reguladores importantes de la respuesta inmune innata y adaptativa, producing una variedad de citocinas y factores de crecimiento 5. En individuos sanos, las células MFS se cree que diferenciar de las células madre mesenquimales y expresar en su superficie celular, el marcador mesenquimal, CD90 3, 5. Estas células también son positivas para vimentina, pero negativo para epitelial y marcador de células hematopoyéticas, EpCAM y CD45 , respectivamente. Los miofibroblastos se sugieren para ser una forma activada de los fibroblastos y pueden distinguirse de los fibroblastos no activadas por la expresión de α-SMA 5. Durante la última década, múltiples enfoques para el aislamiento de miofibroblastos de colon humanos mucosa han sido publicados-en su mayoría basados ​​en el método descrito originalmente por Mahida et al. 5-8. Mientras que los estudios individuales reportan procedimientos de aislamiento de diversos mucosa intestinal, no protocolo universal para el aislamiento de MFs desde múltiples áreas del tracto GI (es decir, gástrica, pequeño y lmucosa intestinal arge) ha sido publicado. El protocolo presentado en el presente documento ha sido probado y utilizado con éxito para los tres tipo de tejido se ha mencionado anteriormente. . Además, no se han informado procedimientos para aislar MFs de la mucosa GI congelados. A continuación, presentamos un método optimizado, que se basa en la digestión enzimática, y al mismo tiempo permite el aislamiento de la mucosa intestinal humana FMs de la cultura y la citometría de flujo análisis, unicelulares, preparaciones mucosas digeridos recientemente. Esta técnica produce de forma fiable cultivos primarios con un fenotipo MF. Además, los mismos métodos pueden ser utilizados para aislar a partir de muestras MFs congeladas de tejidos intestinales y gástricos pequeñas también. Aislamiento de miofibroblastos a partir de tejido fresco GI se ha descrito previamente; sin embargo, la utilización de muestras congeladas presenta muchos beneficios. A saber, los investigadores podrán recoger y almacenar los tejidos de cualquier número de colaboradores de todo el mundo que tienen la capabidad para enviar muestras de tejido congelado. Por otra parte, los investigadores pueden encontrar la colección de tejidos descartados de la sala de operaciones y / o sala de endoscopia e inmediato procesamiento de tejido para el aislamiento de conflicto con su horario de experimentación actual. También, debido a la naturaleza impredecible de la cirugía, la obtención de tejidos puede ocurrir muy tarde en el día, lo que limitará el tiempo que queda para el tejido procesado. La congelación de tejido para su posterior procesamiento será mejorar estos desafíos. Por último, estos métodos se han utilizado con éxito en el aislamiento de miofibroblastos intestinales del colon, gástricos y pequeños en estados de enfermedad tales como carcinoma colorrectal y enfermedades inflamatorias del intestino.

<table><tbody><tr><td>MEM, 1x</td><td>Corning</td><td>MT-10-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina equilibrada de Hanks</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6648</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>Antibiótico-antimicótico, 100x</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Ciprofloxacina HCl</td><td>Corning</td><td>61-277-RF</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina, 100x</td><td>Corning</td><td>25-005-CI</td><td></td></tr><tr><td>MEM Aminoácidos no esenciales</td><td>Corning</td><td>25-025-CI</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO) Hybri-Max</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol solución (DTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>646563</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M EDTA, pH 8,0</td><td>Cellgro</td><td>46-034-CI</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Worthington LS002139</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa de&nbsp; Clostridium histolyticum, Tipo I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1639</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa de&nbsp; Clostridium histolyticum, Tipo II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1764</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa de Clostridium histolyticum, Tipo IV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td>Solución de disociación celular Accumax</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7089</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS C Tubos</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS Disociador</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>Contador de células automatizado Countess</td><td>Invitrogen</td><td>C10227</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de células (70 &micro; m)</td><td>Corning</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>PE Ratón Anti-Humano Vimentina</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>562337 Clon RV202</td></tr><tr><td>FITC Anti-Actina Monoclonal, &alpha;-Músculo Liso</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3777</td><td>Clon 1A4</td></tr><tr><td>APC Ratón Anti-Humano CD90</td><td>BD Biosciences</td><td>559869</td><td>Clon 5E10</td></tr></tbody></table>

aislamiento de cd 90+ fibroblastos / miofibroblastos de congelados humanos gastrointestinales especímenes

Isolation of CD 90+ Fibroblast/Myofibroblasts from Human Frozen Gastrointestinal Specimens

Fibroblastos / miofibroblastos (MFS) han ido ganando cada vez más atención por su papel en la patogénesis y sus contribuciones a tanto la cicatrización de heridas y la promoción del microambiente tumoral. Si bien en la actualidad hay muchas técnicas para el aislamiento de FMs de (GI) tejidos gastrointestinales, este protocolo introduce un elemento novedoso de aislamiento de estas células del estroma de tejido congelado. Congelar las muestras de tejido GI no sólo permite al investigador para adquirir muestras de colaboradores en todo el mundo, los biobancos y proveedores comerciales, sino que también permite el procesamiento retardado de muestras frescas. El protocolo descrito producirá consistentemente células fusiformes característicos con el fenotipo MF que expresan los marcadores CD90, α-SMA y vimentina. A medida que estas células se derivan de muestras de los pacientes, el uso de células primarias también confiere el beneficio de MFs que imitan estrechamente a partir de los estados-a saber, la enfermedad del cáncer y enfermedades inflamatorias del intestino. Esta técnica tiene la abejan validado en gástrico, intestino delgado, colon y MF generación cultivo primario. Culturas MF primarios se pueden utilizar en una amplia gama de experimentos sobre un número de pasaje y su pureza evaluados tanto por inmunocitoquímica y análisis de citometría de flujo.

El uso de este protocolo de digestión enzimática, hemos sido siempre capaz de aislar y crecer CD90 + células estromales de la mucosa intestinal MF población a partir de muestras y biopsias (Figura 1) quirúrgicas gastrointestinales. Visible la proliferación de colonias MF se pudo observar en el día 2 - 5 después de la siembra suspensiones de células mononucleares en placas de 6 pocillos (Figura 1A-B). Los cultivos primarios MF alcanzan ~ 50 - 7...

Aquí, se presenta un protocolo para aislar y establecer cultivos primarios de fibroblastos/miofibroblastos (MF) a partir de células gástricas, del intestino delgado y de colon congeladas productoras de tejido con un fenotipo MF. Estas células expresan CD90, α-SMA y vimentina. Los MF se pueden utilizar para una variedad de ensayos funcionales, incluida la actividad enzimática y la producción de citocinas.

Aislamiento de CD 90+ fibroblastos / miofibroblastos de congelados Humanos gastrointestinales Especímenes


Fibroblasts/myofibroblasts (MFs) have been gaining increasing attention for their role in pathogenesis and their contributions to both wound healing and ...

El objetivo general de este método es aislar miofibroblastos y fibroblastos viables de mucosas a partir de muestras de tejido gastrointestinal congelado, obtenidas originalmente a partir de biopsias o muestras quirúrgicas. El aislamiento de miofibroblastos y fibroblastos a partir de tejido gastrointestinal debidamente congelado permite retrasar el procesamiento de muestras frescas. Esto facilita el uso de muestras de diferentes fuentes en todo el mundo.Si el tejido se conservó en medio de congelación, coloque el criovial en un baño de agua a 37 grados centígrados hasta que el tejido y el medio se descongelen. Para cuatro o cinco fragmentos de tejido de dos milímetros cuadrados, agregue 10 mililitros de HBSS sin calcio ni magnesio, cierre herméticamente la tapa y lave el pañuelo invirtiendo suavemente el tubo una vez. Una vez que el tejido se haya asentado por gravedad, deseche cuidadosamente el sobrenadante y vuelva a lavar los tejidos.A continuación, añada 10 mililitros de solución de colagenasa al tubo y transfiera la suspensión de tejido a un tubo estéril libre de DNasa/RNasa con rotores incorporados. Cierre herméticamente el tubo del rotor y fíjelo boca abajo en el manguito de un disociador. A continuación, ejecute el programa preestablecido H-tumor cero uno.Al final del programa, incubar la suspensión de tejido durante 45 minutos a 37 grados centígrados, bajo una rotación continua de 140 RPM en un agitador. A continuación, devuelva el tubo al disociador y ejecute el programa H-tumor cero dos. Después de la segunda disociación, agregue 50 microlitros de solución madre de ADN a la solución celular durante 30 minutos a 37 grados Celsius, bajo una rotación continua de 60 RPM en el agitador.Al final de la segunda incubación, ejecute el programa H-tumor cero tres. Ahora, filtre la suspensión a través de un filtro de células estéril de 70 micras, en un tubo cónico de 50 mililitros para la centrifugación. Deseche el sobrenadante y lave el pellet celular en 25 mililitros de HBSS sin calcio y magnesio dos veces, contando las células después del primer lavado.Para la generación de cultivo primario de miofibroblastos, vuelva a suspender el pellet en hasta 4 x 10 a la 6ª célula por tres mililitros de medio, y siembrójelos en placas tratadas con cultivo celular de 6 pocillos. Cultive las células a 37 grados centígrados y cinco por ciento de dióxido de carbono, cambiando el medio cada dos o tres días hasta la formación de una monocapa de miofibroblastos confluente en un 80 por ciento. A continuación, las células están listas para ser pasadas en matraces de cultivo T25.Para analizar o clasificar los miofibroblastos aislados por citometría de flujo, coloque una placa de hasta 2 x 10 a la sexta célula por cada dos mililitros de medio de aislamiento de fibroblastos, en una placa de baja unión de 24 pocillos para la incubación nocturna a 37 grados Celsius y cinco por ciento de dióxido de carbono. Usando este protocolo de digestión enzimática, los miofibroblastos y fibroblastos obtuvieron poblaciones de células estromales de la mucosa CD-90 positivas, se pueden aislar y cultivar de manera consistente a partir de muestras quirúrgicas gastrointestinales y biopsias. Si bien hay una ligera disminución en la viabilidad de la preparación de la mucosa de una sola célula después de congelar las muestras quirúrgicas, hay un aumento en la eficiencia de la generación de miofibroblastos y cultivos de fibroblastos debido a una disminución concomitante en la concentración bacteriana y fúngica.Después de dos pasajes, los miofibroblastos y fibroblastos son positivos para CD90, el marcador de linaje marcador mesenquimatoso, Vimentina, y actina de músculo liso, un marcador de células mesenquimales diferenciadas, según lo determinado por microscopía confocal y análisis de citometría de flujo. Una vez dominada, si se realiza correctamente, esta técnica se puede completar en aproximadamente dos horas. Al intentar este procedimiento, es importante recordar dejar el tiempo necesario para que el tejido se digiera completamente enzimáticamente.Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la citometría de flujo, la inmunocitoquímica y varios ensayos funcionales. Pueden utilizarse para determinar la contribución de miofibroblastos y fibroblastos a la homeostasis de la mucosa intestinal, así como a la patología de la enfermedad gastrointestinal inflamatoria aguda y crónica. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar miofibroblastos y fibroblastos del tejido gastrointestinal congelado.No olvide que el tejido humano no fijado puede estar contaminado por microorganismos patógenos. Siempre se deben tomar precauciones universales al trabajar con muestras biológicas humanas al realizar este procedimiento.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Cáncer de fibroblastos asociados (CAF) facilitar la iniciación del crecimiento del tumor y la progresión a través de señalización que promueve la proliferación, la angiogénesis y la inflamación. Aquí se describe un método para aislar poblaciones puras de los fibroblastos normales y CAFS de ratón fresco y tejidos humanos por clasificación de células, usando PDGFR como un marcador de superficie.

Aislamiento de fibroblastos normales y el cáncer asociado-de los tejidos frescos por Clasificación células activadas por fluorescencia (FACS)

El miofibroblastos es una célula estromal influyente del tracto gastrointestinal que regula importantes procesos fisiológicos en los estados tanto normales y de enfermedad. Se describe una técnica que permite el aislamiento de miofibroblastos primarios de ratón y tejido de colon humano, que puede ser utilizado para la experimentación in vitro.

Aislamiento de Miofibroblastos primarias de ratón y el tejido del colon humano

Los principales tipos de células adherentes derivadas del músculo humano son las células miogénicas y los fibroblastos. Aquí, las poblaciones celulares se enriquecen mediante la clasificación de células activadas magnéticamente basadas en el antígeno CD56. El posterior inmunomarcaje con anticuerpos específicos y el uso de técnicas de análisis de imagen permiten cuantificar las características citoplasmáticas y nucleares de las células individuales.

Aislamiento y Caracterización cuantitativa inmunocitoquímica de células miogénicas Primarias y fibroblastos de músculo esquelético humano

Presentamos un protocolo para generar cultivos primarios de células estromales murinas y humanas con un fenotipo de miofibroblastos. Las células cultivadas tienen morfología fusiforme, expresan α-SMA y vimentina, y carecen de marcadores de superficie celular epiteliales, hematopoyéticos y endoteliales. Las células estromales caracterizadas se pueden utilizar en estudios funcionales de las interacciones epitelio-estromales.

Aislamiento de Miofibroblastos de Mouse y Esófago Humano

Este protocolo describe técnicas para el aislamiento de células vivas y el cultivo primario de líneas celulares miogénicas y fibroblastas a partir de tejido muscular o cutáneo.  También se describe una técnica para la inmortalización de estas líneas celulares.  En conjunto, estos protocolos proporcionan una herramienta fiable para generar y preservar células derivadas de pacientes para aplicaciones posteriores.

El aislamiento y la inmortalización de líneas celulares derivados de los pacientes a partir de una biopsia muscular para Modelado de Enfermedades

El comportamiento de los fibroblastos subyace en un espectro de entidades clínicas, pero siguen estando mal caracterizadas, en gran parte debido a su heterogeneidad inherente. La investigación tradicional de fibroblastos se basa en la manipulación in vitro, enmascarando el comportamiento de los fibroblastos in vivo. Describimos un protocolo basado en FACS para el aislamiento de fibroblastos de piel de ratón que no requiere cultivo celular.

Murino fibroblastos dérmicos aislamiento por FACS

Este manuscrito describe un protocolo basado en FACS para el aislamiento de fibroblastos papilares y reticulares de la piel humana. Elude la cultura in vitro que era inevitable con el protocolo de aislamiento de uso común a través de culturas explantes. Los subconjuntos de fibroblastos que emanan son funcionalmente distintos y muestran la expresión génica diferencial y la localización dentro de la dermis.

Aislamiento de fibroblastos papilares y reticulares de la piel humana mediante la clasificación celular activada por fluorescencia

Presentamos un protocolo para aislar los fibroblastos adultos primarios de una manera fácil, rápida y confiable, realizable por principiantes (por ejemplo, estudiantes). El procedimiento combina la digestión del tejido enzimático y la agitación mecánica con ondas ultrasónicas para obtener fibroblastos primarios. El protocolo se puede adaptar fácilmente a requisitos experimentales específicos (por ejemplo, tejido humano).

Aislamiento de fibroblastos para adultos primarios aumentados por ultrasonidos

La reprogramación celular requiere la introducción de genes clave, que regulan y mantienen el estado celular pluripotente. El protocolo descrito permite la formación de colonias de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) a partir de fibroblastos dérmicos humanos sin métodos virales/integradores pero utilizando ARN no modificados (NM-RNA) combinados con factores de evasión inmune que reducen los mecanismos de defensa celular.

Aislamiento de fibroblastos dérmicos humanos adultos de la piel abdominal y generación de células madre pluripotentes inducidas utilizando un método no integrador

La obtención de una población pura de fibroblastos es crucial para estudiar su papel en la reparación de heridas y fibrosis. Aquí se describe un método detallado para aislar fibroblastos y miofibroblastos de corazones de ratón no lesionados y lesionados seguidos de la caracterización de su pureza y funcionalidad por inmunofluorescencia, RTPCR, clasificación celular asistida por fluorescencia, y contracción del gel de colágeno.

Aislamiento y caracterización de fibroblastos cardíacos adultos y miofibroblastos

Este estudio describe un protocolo optimizado para establecer fibroblastos primarios a partir de tejidos queloides que puedan proporcionar fibroblastos puros y viables de manera efectiva y constante.

Aislamiento, cultivo y caracterización de fibroblastos dérmicos primarios a partir de tejido queloide humano

Aprenda a aislar fibroblastos y miofibroblastos CD90+ viables a partir de tejidos gastrointestinales humanos congelados. Este protocolo permite el procesamiento diferido de muestras para estudios de reparación tisular y fibrosis.

Aislamiento de CD 90+ fibroblastos / miofibroblastos de congelados Humanos gastrointestinales Especímenes

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