Iniciando Diferenciación en inmortalizadas células pluripotentes Otic Progenitoras

El objetivo general de este procedimiento es diferenciar las células progenitoras óticas multipotentes inmortalizadas en tipos de células del oído interno. Por lo tanto, este método puede ayudarnos a abordar preguntas clave en la regeneración auditiva, como cómo los progenitores óticos pueden convertirse en células ciliadas cocleares o neuronas auditivas. Es importante destacar que esta técnica proporciona un sistema celular in vitro que se puede utilizar en paralelo con sistemas de modelos animales de mamíferos in vivo.

Hoy demostrarán el procedimiento Azadeh Jadali, becaria postdoctoral en mi laboratorio, así como Zhichao Song y Alejandra Laureano, dos estudiantes de posgrado en el laboratorio. Después de preparar el medio de cultivo como se describe en el protocolo de texto, use tres mililitros de este líquido para colocar una placa de diez veces al sexto progenitor multipotente inmortalizado, o células IMOP, en una placa de cultivo de tejidos de 60 milímetros. Incubar las células durante cinco a siete días a 37 grados centígrados con cinco por ciento de dióxido de carbono.

Cada dos días, duplique el volumen de líquido en el cultivo agregando medio fresco. Para pasar las células, primero transfiéralas de la placa de cultivo a un tubo cónico de 15 mililitros. Y luego coloque el tubo, a 37 grados centígrados, durante cinco a diez minutos.

Durante este tiempo, se espera que las otosferas formadoras de colonias se acumulen en el fondo del cónico a través de la sedimentación por gravedad. A continuación, aspire el sobrenadante, teniendo cuidado de no alterar la paleta. Vuelva a suspender las otosferas añadiendo 0,5 mililitros de solución salina balanceada mejorada con EDTA o HBSS previamente precalentada, y luego pipeteando hacia arriba y hacia abajo dos o tres veces.

Para facilitar la disociación de las otosferas en células individuales, coloque el cónico en una incubadora a 37 grados centígrados. Agite periódicamente la solución y cuando no se observen otosferas como sedimentos en el fondo del tubo, muévala a temperatura ambiente. Se procede a añadir dos mililitros de medio de cultivo a las células para neutralizar el EDTA.

Y centrifugarlos a temperatura ambiente durante cinco minutos a 200 gs. A continuación, aspire la solución de EDTA diluida y lave las células con cinco mililitros de 1x PBS. Después de girar las celdas usando la misma configuración, aspire el 1x PBS.

A continuación, agregue 0,5 mililitros de medio de cultivo al cónico. Y vuelva a suspender la paleta de celdas. Para el recuento, diluya las células IMOP de 1 a cien en medio de cultivo.

A continuación, añada 75 microlitros de esta solución en un casete colocado en un contador de partículas microfluídicas y determine el número de células. A continuación, se coloque una placa por diez a la sexta célula IMOP en una placa de cultivo de tejidos de 60 milímetros como se ha descrito anteriormente y se repita este procedimiento de paso cada cinco a siete días. Tres días después de la siembra, utilice la sedimentación por gravedad para recolectar otosferas como se mostró anteriormente.

Proceda a aspirar el sobrenadante. Y resuspender suavemente las células en dos mililitros de medio de diferenciación epitelial sensorial. A continuación, utilice una pipeta de poro grande de diez mililitros para transferir las otosferas a una nueva placa de 60 milímetros.

Diferenciar las otosferas durante diez días. Añadiendo dos mililitros de medio de diferenciación fresco al cultivo cada dos días. Después, vuelve a cosechar las otosferas a través de la sedimentación por gravedad.

Y aspirar el medio gastado. A continuación, fije las otosferas en un cuatro por ciento de paraformaldehído en 1x PBS durante 15 minutos a temperatura ambiente. A continuación, retire la solución de formaldehído y lave las células con 1x PBS que contenga un 0,1 por ciento de Triton x100.

Proceda bloqueando las otosferas en 1x PBS suplementado con un diez por ciento de suero de cabra y un 0,1 por ciento de Triton x100. Después de una hora, sustituya el tampón de bloqueo por el que contenga la dilución adecuada del anticuerpo Cdkn1b o CDH1. A continuación, incubar las células en el anticuerpo primario durante la noche a cuatro grados centígrados.

Y al día siguiente continuar con la inmunotinción utilizando anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia, Phalloidin y Hoechst, como se describe en otra parte. Para prepararse para la toma de imágenes, coloque el medio de montaje en un portaobjetos de vidrio. Y luego introducir las otosferas teñidas en el medio.

A continuación, coloque un cubreobjetos encima de la muestra. Después de dejar que el medio de montaje se seque durante la noche a cuatro grados centígrados, coloque el portaobjetos en la platina de un microscopio invertido equipado con una cámara CCD de 16 bits. Con el objetivo de aire 20x 0,75, adquiera imágenes de epifluorescencia mediante la recopilación de datos de los canales azul, verde, rojo e infrarrojo.

Primero, limpie los cubreobjetos redondos de vidrio colocándolos en una placa estéril de 100 milímetros y sumergiéndolos en etanol al 70 por ciento. Agite suavemente las fundas para asegurarse de que estén cubiertas y deje el plato a temperatura ambiente durante diez minutos. A continuación, enjuague los cubreobjetos tres veces en 1x PBS estéril y luego una vez con agua estéril.

A continuación, deje que las fundas se sequen exponiéndolas a la luz ultravioleta en una campana de cultivo de tejidos durante 15 minutos. Para uso inmediato, coloque un cubreobjetos estéril en cada pocillo de una placa de 24 pocillos. Y agite suavemente la placa para asegurarse de que todos los cubreobjetos queden planos.

A continuación, cubra los cubreobjetos añadiendo 0,25 mililitros de 1x PBS que contenga 10 micrógamas por mililitro de lisina poli D a cada pocillo. Después de que la placa haya incubado durante una hora a 37 grados centígrados, retire la solución de lisina poli D y lave los pocillos tres veces con PBS estéril 1x. Una vez aspirado el líquido del último lavado, introducir 0,25 mililitros de 1x PBS que contenga 10 microgramos por mililitro de laminina, en cada uno de los 24 pocillos.

Después de incubar la placa durante la noche a 37 grados centígrados, aspire la solución de laminina, luego lave cada pocillo con un mililitro de 1x PBS tres veces, pero deje el PBS del último lavado en los pocillos hasta que las células estén listas para ser plateadas. Para comenzar la diferenciación neuronal, cuente las células de las otosferas disociadas como se describió anteriormente. Y luego resuspenderlos en un medio de diferenciación neuronal precalentado.

Proceda sembrando entre uno y un punto cinco veces diez hasta la quinta celda IMOP en cada pocillo de la placa que contiene los cubreobjetos recubiertos. Incubar la placa a 37 grados centígrados, con cinco por ciento de dióxido de carbono. Sustituyendo el medio de diferenciación neuronal cada dos días.

Después de siete días, aspire el medio y fije las celdas, que deben estar unidas a los cubreobjetos, agregando un cuatro por ciento de formaldehído en cada pocillo. Y dejándolos durante 15 minutos a temperatura ambiente. A continuación, retire el formaldehído y lave las células una vez en 1x PBS que contenga un 0,1 por ciento de Triton x100.

A continuación, retire el tampón de lavado. Y agregue un tampón de bloqueo que consta de 1x PBS que contiene un diez por ciento de suero de cabra normal y un 0,1 por ciento de Triton x100 a cada pozo. Deje las celdas durante una hora a temperatura ambiente.

Y luego retire el líquido y reemplácelo con un tampón de bloqueo que contenga la dilución adecuada del anticuerpo Cdkn1b o Tubb3. Después de una incubación nocturna a cuatro grados centígrados, lave las células una vez con 1x PBS que contenga un uno por ciento de Triton x100. Y luego proceda con la inmunotinción como se describió anteriormente.

Una vez que se haya completado la tinción, realice un lavado final agregando 1x PBS a los pocillos. Para prepararlos para el análisis, retire los cubreobjetos a los que se adhieren las células teñidas de la placa de 24 pocillos. Y colóquelos en un medio de montaje en un portaobjetos de vidrio.

Después de dejar que el medio de montaje se seque durante la noche a cuatro grados centígrados, adquiera imágenes de epifluorescencia como se describió anteriormente. Las otosferas cultivadas durante diez días en un medio de diferenciación epitelial muestran un aumento de la expresión de Cdkn1b, un inhibidor de la quinasa dependiente del ciclo, y un marcador de diferenciación en el oído interno, en comparación con las células indiferenciadas. En este caso, la tinción de Hoechst sí detectó núcleos celulares.

Estas células también exhiben cambios morfológicos en los filamentos de actina y en las regiones de adhesión célula-célula características de los epitelios. Indicado por la aparición de faloidina y el marcaje de Cdh1 en las periferias celulares. Las otosferas también se pueden dirigir para formar neuronas.

Esta imagen de campo claro muestra que después de siete días en un medio de diferenciación neuronal, las células IMOP exhiben neuritas. La inmunotinción de estas células con un marcador neuronal Tubb3 confirma su diferenciación. Y también expresan de forma robusta Cdkn1b.

Esto sugiere que la señal dual Tubb3, Cdkn1b puede usarse como un indicador de diferenciación neuronal en células IMOP. Las células diferenciadas e indiferenciadas de fluorescencia de Cdkn1b también se normalizaron determinando su relación con la señal de Hoechst, proporcionando resultados cuantitativos. Aquí se muestran histogramas de estos datos.

En estos gráficos se presentan los porcentajes de células IMOP indiferenciadas y diferenciadas por encima de un umbral predeterminado de Cdkn1b normalizado. Ambas poblaciones diferenciadas muestran un aumento significativo en el porcentaje de células que expresan Cdkn1b en comparación con los controles indiferenciados, lo que confirma la diferenciación sugerida por la inmunofluorescencia. Una vez dominado, el cultivo rutinario y la diferenciación de las células IMOP se pueden realizar en 30 minutos, si se realiza correctamente.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo iniciar la diferenciación de las células IMOP. Gracias por ver este video. Y buena suerte con tus experimentos.