Name: Iniciando Diferenciación en inmortalizadas células pluripotentes Otic Progenitoras (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 17 s
Description: Aprenda a diferenciar células progenitoras óticas iMOP en tipos celulares del oído interno. Este método permite estudiar la regeneración auditiva y el desarrollo de células ciliadas y neuronas auditivas.

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El trabajo fue apoyado en parte por el Fondo de Dotación de la Cátedra de Desarrollo Docente Duncan y Nancy MacMillan (K.Y.K.), Busch Biomedical Research Grant (K.Y.K.) y la Rutgers Faculty Development Grant (K.Y.K.).

1. El mantenimiento de auto-renovación en células PIMO <ol><li> Preparar PIMO medios de cultivo: DMEM / F12, 1X suplemento B27, 25 mg / ml y carbenecillin 20 ng / ml bFGF. Hacer 50 ml de PIMO medios de cultivo utilizando reactivos estériles. Calentar 49 ml de DMEM / F12 en una cónica de 50 ml en un baño de agua a 37 ° C. <ol><li> Suplemento Descongele 50X B27 y 100 mg / carbenecillin alícuotas de filtro esterilizado ml durante 5 minutos en un baño de agua a 37 ° C. Descongelar 100 g / ml bFGF alícuota a RT. Añadir 1 ml de 50X B27, 10 l de 100 mg / ml bFGF y 12,5 l de 100 mg / ml carbenecillin en DMEM / F12. </li></ol></li><li> Utilice 3 ml de medio en un 60 mm placa de cultivo tisular de células PIMO cultivo. Añadir medio fresco a los cultivos cada dos días al duplicar el volumen de medios de comunicación. Asegúrese de que la concentración de bFGF no cae por debajo de 5 ng / ml. <ol><li> Células PIMO cultivo a 37 ° C con 5% de CO 2. Las células Passage después de 5 - 7 días en cultivo que se enumeran en los siguientes pasos. La cultura de transferencia a un 15ml cónica con una punta de pipeta de 10 ml. </li></ol></li><li> Hacer EDTA 1 mM en HBSS mediante la dilución de 0,1 ml de 0,5 M EDTA pH 8,0 en 50 ml de HBSS. Pre-caliente EDTA 1 mM hizo en HBSS en un 37 ° C baño de agua. </li><li> Cosecha células por sedimentación por gravedad o centrifugación a 200 xg durante 5 min. a TA. Para sedimentación por gravedad, coloque el cónico de 15 ml que contiene las culturas en el 37 ° C incubadora durante 5 a 10 min. Después de ese tiempo, observan los otospheres recogen en la parte inferior de la cónica 15 ml. NOTA: la fuerza centrífuga excesiva puede causar daño celular. </li><li> Cuidadosamente aspirado pasado multimedia usando una pipeta 2 ml de aspiración sin alterar el sedimento celular. Añadir 0,5 ml de la solución de pre-calentado 1 mM EDTA HBSS a la celda de pellets. Con una pipeta P1000, pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo 2 - 3 veces. Coloque cónica a 37 ° C y se incuba durante &lt;5 min para facilitar la disociación en células individuales. </li><li> Agite suavemente la solución de células para determinar si se disocian otospheres. Si no otoesferas de sedimentos para la parte inferior de la cónica, las células se disocian. El tiempo de incubación puede variar. NOTA: La prolongada incubación con EDTA puede provocar la muerte celular excesiva. </li><li> Retire las células de 37 ° C, añadir 2 ml de medio para neutralizar y diluir el EDTA. Recoger las células por centrifugación a 200 xg durante 5 min a TA. Aspirar diluyó EDTA utilizando una pipeta de 2 ml de aspiración y añadir 5 ml de 1X PBS para lavar las células. </li><li> Girar las células hacia abajo a 200 xg durante 5 min a RT y aspirar a cabo 1X PBS usando una pipeta de 2 ml de aspiración. Resuspender las células por medio de una pipeta P1000 en 0,5 ml de medio de cultivo PIMO pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo 2 - 3 veces. </li><li> Contar las células utilizando un contador de partículas de microfluidos con los cassettes apropiados 28. Una placa confluente de células PIMO contendrá ~ 6 X10 6 células. Diluir las células 1: 100 en los medios de comunicación y añadir 75 ul de solución de células en el cassette para el conteo. Plate 1 x 10 6 células en una placa de 6 cm en PIMO culture medios de comunicación (~ 1: 10 de dilución). IMOPs Passage cada 5 - 7 días. NOTA: Las células que forman grandes otospheres o se adhieren a la parte inferior de la placa de cultivo de tejido va a diferenciar. Las células también se mueren si las culturas son más confluentes. </li></ol> 2. congelación y descongelación células PIMO <ol><li> Preparar medio de congelación sintética de descongelación y equilibrar la solución a 4 ° C antes de células de congelación. </li><li> Recoger las células de un confluente placa de 6 cm de células PIMO. Usar una pipeta de 10 ml y las células de transferencia (~ 6 - 8 x 10 6 células) en un cónica 15 ml. </li><li> Cosecha células por sedimentación por gravedad o centrifugación a 200 xg durante 5 min a TA. Si los otospheres son pequeñas, las células no se asientan por sedimentación por gravedad. Opcional: Recuento de células utilizando el paso 1.9 para determinar el número de células totales. </li><li> Aspirar pasó multimedia usando una pipeta 2 ml de aspiración, dejando el sedimento celular suelta atrás. </li><li> Añadir 0,25 ml de medio de congelación sintéticos de volver a suspender ceLLS a una densidad de 5 x 10 ~ 5 a 3 x 10 6 células / ml. Pipetear suavemente las células con una pipeta P1000. Transferir la suspensión celular a viales criogénicos utilizando una pipeta P1000 con 1 ml filtradas punta. </li><li> Colocar los viales en un recipiente de congelación libre de alcohol y coloque el recipiente de congelación a -80 ° C para reducir la temperatura de 1 ° C por minuto hasta que la temperatura alcanza -80 ° C. </li><li> Para el almacenamiento a largo plazo de las células, la transferencia de los viales a la fase de vapor de un tanque de almacenamiento de nitrógeno líquido. Para descongelar las células para la cultura, equilibre vial criogénico que contiene células congeladas a -80 ° C. </li><li> Pre-caliente medios de cultivo PIMO en un 37 ° C baño de agua. </li><li> Descongele el vial congelado rápidamente agitando el fondo del vial en un 37 ° C baño de agua. Añadir 1 ml de medios de cultivo pre-calentado PIMO a las células descongeladas una vez que el cristal de hielo pasada desaparece. La transferencia de células en un ml cónica 15 y añadir otros 4 ml de PIMO medios de cultivo </li><li> Gira la 15 ml conica durante 5 min. a 200 xg y aspirar los medios gastados. Resuspender las células en 2 ml de medio de cultivo PIMO y células de la placa en una placa de 6 cm. Incubar los cultivos a 37 ° C con 5% de CO 2 para la expansión. </li></ol> 3. Diferenciar las células PIMO en sensorial epitelios <ol><li> Preparar 50 ml de PIMO medio de diferenciación epitelios sensoriales: DMEM / F12, suplementos 1X B27, 25 mg / ml carbenecillin. Hacer 50 ml de medio de diferenciación PIMO sensorial epitelios. Calentar 49 ml de DMEM / F12 en una cónica de 50 ml en un baño de agua a 37 ° C. Suplemento de B27 Descongelar 50X y 100 mg / ml para carbenecillin alícuotas de 5 min. en un 37 ° C baño de agua. Añadir 1 ml de 50X B27 y 12,5 l de 100 mg / ml carbenecillin en DMEM / F12. </li><li> Para cosechar, disociar, resuspender y contar células Repita los pasos 1,4 a 1,9 </li><li> Plate 1 x 10 6 células en una placa de 6 cm en el Día -3 utilizando PIMO medios de cultivo. En el Día 0, los cultivos de transferencia utilizando una pipeta de 10 ml en un cónica 15 ml. Recoger el otoesferas de sedimentación por gravedad como se indica en el paso 1.6. Aspirar pasó multimedia usando un 2 ml de aspiración pipeta y dejar las otospheres en la parte inferior de la cónica. </li><li> Añadir suavemente en 2 ml de medio de diferenciación sensorial epitelios. Transferencia otospheres a un plato de 6 cm utilizando un gran ml pipeta de diámetro 10. NOTA: esquila mecánica de duras pipeteo puede disociar las células de los otospheres. </li><li> Añadir 2 ml de los medios de comunicación sensorial diferenciación epitelial fresco a culturas cada dos días. Si es necesario, las células pueden ser recogidos por sedimentación por gravedad y los medios reemplazado. </li><li> Recoger otospheres en el día 10 mediante la transferencia a un ml cónica 15 y permitiendo que los otospheres que sedimentan como se indica en el paso 1.6.Aspirate los medios de comunicación dedicado al uso de 2 ml de aspiración pipeta y dejan los otospheres sin ser molestados. </li><li> Fijar otospheres incubando en 4% de formaldehído en PBS 1X durante 15 min a RT. Retire solución de formaldehído, lavar otospheres con tampón de lavado (1X PBS que contenía 0,1% Triton X-100) antes de incubar en tampón de bloqueo (1X PBS que contenía 10% de suero normal de cabra y 0.1% de Triton X-100) durante 1 hora. <ol><li> Reemplazar tampón y se incuba las muestras en tampón de bloqueo con anticuerpo diluido. Se incuba a 4 ° C. Lávese las muestras con 1X PBS que contenía 0,1% de Triton X-100 sujetos del otosphere a inmunotinción 27. Otospheres transferencia en 1X PBS y otospheres lugar en los medios de montaje sobre un portaobjetos de vidrio usando una pipeta P1000. Ponga un cubreobjetos sobre la muestra y permitir que los medios de montaje se sequen a 4 ° C. </li></ol></li><li> Adquirir imágenes de epifluorescencia utilizando una configuración de microscopio invertido equipado con una cámara CCD de 16 bits y, o bien un aire 20X 0.75 o una NA objetivo de inmersión en aceite 40X 1,3. Recoger fluorescencia de canales de color diferentes utilizando el longitudes de onda que aparece (excitación y emisión): azul (377 ± 25 nm / 447 ± 30 nm), verde (475 ± 25 nm / 540 ± 25 nm), rojo (562 ± 20 nm / y 625 20 nm ±) e infrarrojo (628 ± 20 nm / 692 ± 20 yNuevo Méjico). </li></ol> 4. Ensayo de EdU Incorporación <ol><li> En el Día -3, placa 1 x 10 6 células PIMO en un plato de 6 cm. Tres días más tarde en el día 0, cosecha, disociar, resuspender las células y contar por pasos 1,4-1,9 repetir. </li><li> Placa de 2,5 x 10 5 células en medios de cultivo PIMO y 5 x10 5 células en medio de diferenciación sensorial epitelios en diferentes pocillos de una placa de 6 pocillos. </li><li> Determinar el porcentaje de células en fase S mediante la incorporación EdU en día 3 mediante el uso de un ensayo de incorporación de EdU <ol><li> Añadir EdU acciones directamente a las culturas PIMO para obtener una concentración final de 1 mM EdU en los medios de cultivo. </li><li> Incubar EdU en cultivos PIMO durante 2 horas y se incuba a 37 ° C con 5% de CO 2. Cosecha, disociar y recoger células repita los pasos 1.4-1.9. Añadir en 4% de formaldehído en PBS 1X durante 15 min. a temperatura ambiente para fijar las células. Cosecha células por centrifugación a 200 xg durante 5 min a TA. Retire solución de formaldehído y properly deseche. </li><li> Núcleos de la etiqueta de células con Hoechst y incorporados EdU con el verde de fluorescencia tinte azida de acuerdo con el protocolo del fabricante. NOTA: Todos los lavados se realizan con 1X PBS, BSA al 3% y 0,1% de células Tween 20. Lave con 1X PBS dos veces. </li><li> Células de montaje en una diapositiva utilizando antifade reactivo y coloque un vaso 1,5 cubierta sobre la muestra. Adquirir imágenes fluorescentes de células marcadas usando un microscopio de epifluorescencia. </li></ol></li></ol> 5. Diferenciar neuronas PIMO-Derivado <ol><li> Hacer 50 ml de medio de diferenciación neuronal: medios Neurobasal, 1X suplemento B27, 2 mM L-glutamina. Botella Deshielo de 50X B27 y 200 mM de L-glutamina en 37 ° C baño de agua durante 5 minutos. Añadir 1 ml de 50X B27 y 0,5 ml de 200 mM de L-glutamina a 48,5 ml de medio Neurobasal. </li><li> Escudo mediante la colocación de cubreobjetos redondos de 12 mm de 1,5 cubreobjetos de vidrio en una placa de 10 cm estéril y añadir 70% de EtOH a la placa para esterilizar y limpiar los cubreobjetos. </li><li> Agitar suavemente la calarslips para asegurarse de que están cubiertos en etanol. Deja la placa durante 10 minutos a temperatura ambiente. Enjuague los cubreobjetos 3 veces con 1X PBS estéril para lavar el etanol restante. Enjuague el portaobjetos una vez con H 2 0 estéril para lavar restante 1X PBS. </li><li> Aspirar el H 2 0 utilizando un 2 ml de aspiración pipeta y dejar que los cubreobjetos seco. Exponga los cubreobjetos a la luz UV en la campana de cultivo de tejidos de 15 min. Tienda cubreobjetos en un ambiente estéril si no se utiliza de inmediato. </li><li> Coloque cubreobjetos uno 12 mm redondo en cada pocillo de una placa de 24 pocillos. Agitar suavemente la placa para asegurarse de que los cubreobjetos se acueste en el fondo del pozo. </li><li> Descongelar 2 mg / ml de poli-D-lisina solución madre a TA y se diluye a un / ml de concentración de poli-D-lisina 10 mg en 1X PBS. Añadir 0,25 ml de 10 ug / ml de poli-D-lisina a los pocillos. Deja la placa en la incubadora a 37ºC durante 1 hora. </li><li> Lavar los pocillos 3 veces con 1X PBS estéril. Descongele 10 mg solución de laminina / ml a temperatura ambiente y diluir a 10 g / ml en 1X PBS. Añadir 0,25 ml de 10 mg / ml de laminina solución de trabajo en un solo pocillo de una placa de 24 pocillos múltiples. Incubar la placa a 37 ° C incubadora. Aspirar la solución laminina usando una pipeta 2 ml de aspiración. </li><li> Lavar el cubreobjetos 3 veces con PBS 1X mediante la adición de 1 ml de PBS 1X con una pipeta P1000 y retirar el PBS 1X por aspiración con una pipeta de 2 ml de aspiración. Deja 1X PBS del último lavado en el pozo hasta que las células están listas para ser plateado. Iniciar la diferenciación neuronal por la cosecha, disociando y contando las células en los pasos células 1.4-1.9.Plate 1 x 10 6 en una placa de 6 cm en el Día -3. </li><li> En el Día 0, cosecha, disociar y contar las células mediante la repetición de 1,4 a 1,9. Seed 1 x 10 5 - 1.5 x 10 5 células PIMO en 0,5 ml pre-calentado medio de diferenciación neuronal por pocillo en una placa de 24 pocillos múltiples. Aspirar y añadir precalentado medio de diferenciación neuronal de culturas cada dos días. </li><li> Fijar neuronas derivadas de PIMO en formaldehído al 4% durante 15 min. lat RT en el Día 7. Retire solución de formaldehído, lavar neuronas derivadas de PIMO con tampón de lavado (1X PBS que contenía 0,1% Triton X-100) antes de incubar en tampón de bloqueo (1X PBS que contenía 10% de suero normal de cabra y 0.1% de Triton X-100) durante 1 h. <ol><li> Reemplazar tampón y se incuba las muestras en tampón de bloqueo con anticuerpo diluido. Se incuba a 4 ° C. Lávese las muestras con 1X PBS que contenía 0,1% de Triton X-100 células sometidas a inmunotinción 27. Lave el cubreobjetos con PBS 1X antes de colocar en soportes de montaje. Permita que los medios de montaje se sequen a 4 ° C antes de la adquisición de imágenes de epifluorescencia que se enumeran en el paso 3.8. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Monitoreo de Cultivos PIMO Un protocolo para el mantenimiento de auto-renovación y promoción de la diferenciación de una novela línea celular PIMO se describe y formatos de chapado adicionales se incluyen (Tabla 1). Se observan varios pasos críticos que ayudan con la expansión de la rutina y la diferenciación de las células PIMO. Al igual que en cultivos de células madre pluripotentes, células PIMO teóricamente tienen una vida útil indefinida. Para asegurars...

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Jadali Azadeh
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Azadeh Jadali

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Erratum: Initiating Differentiation in Immortalized Multipotent Otic Progenitor Cells

Los órganos del oído interno, la cóclea, el utrículo, el sáculo y tres canales semicirculares, median la capacidad de oír y equilibrarse. Dentro de la cóclea, las células ciliadas convierten los sonidos en señales eléctricas que se transmiten a las neuronas ganglionares espirales (SGN). Los SGN disparan potenciales de acción para propagar señales neuronales a través del circuito auditivo. Las mutaciones genéticas, los fármacos ototóxicos y la exposición a sonidos fuertes contribuyen a la muerte de las células ciliadas y del SGN, lo que provoca la pérdidade audición 1-4. Una vez perdidas, estas células no se reemplazan. El uso de iPSC y ESC para generar células ciliadas nacientes o SGN es muy prometedor para las terapias de reemplazo de células del oído interno5-8. Una oleada de avances ha demostrado que las células madre pluripotentes y los progenitores derivados del oído interno pueden diferenciarse en células ciliadas y SGN en varias etapas de madurez. Las células madre embrionarias de mamíferos (ESC) y las células madre pluripotentes inducidas (iPSC) se pueden utilizar para generar células ciliadas funcionales y SGN9-11. También se ha demostrado que las células madre y las células progenitoras derivadas del oído interno de los mamíferos forman células ciliadas y neuronas con propiedades de sus contrapartes celulares in vivo 12-16. 
El uso de progenitores óticos derivados de iPSC o ESC para reemplazar las células ciliadas perdidas y las SGN requiere una diferenciación eficiente. La diferenciación inadecuada o la proliferación continuada de progenitores derivados del tallo injertados en el oído interno pueden exacerbar la función del oído interno y plantear un riesgo tumorigénico, como la formación de teratomas en el oído interno17. Existe una clara necesidad de desarrollar las condiciones de la cultura y comprender la diferenciación de los progenitores óticos. Una estrategia en el desarrollo de estos métodos es recapitular las decisiones sobre el destino celular tomadas por los progenitores neurosensoriales durante el desarrollo del oído interno. Los protocolos que evitan la proliferación y dirigen los progenitores óticos a las células ciliadas o SGN ayudarán a mejorar la seguridad y la eficacia de las terapias de reemplazo. 
Durante el desarrollo, el oído interno comienza con el engrosamiento del ectodermo superficial en una región restringida entre los rombómeros 5 y 6 para convertirse en la placa ótica. A medida que la placoda ótica se invagina para formar una copa ótica, una colección de células en la región anterior de la copa ótica da lugar al dominio neurosensorial-competente (NSD), que contiene precursores de las células ciliadas y las neuronas del oído interno18. Los estudios de mapeo del destino del oído interno en desarrollo de ratones, pollos y peces cebra sugieren múltiples poblaciones de progenitores neurosensoriales que dan lugar a las células ciliadas sensoriales, las células de soporte circundantes y las neuronas óticas19-22. El factor de transcripción del grupo de alta movilidad, Sox2, se ha implicado en la especificación de las células sensoriales y se ha utilizado como marcador para los progenitores del oído interno23,24. Las mutaciones hipomórficas que disminuyen los niveles de expresión de Sox2 en el oído interno dan lugar a la pérdida de las células ciliadas, las células de soporte y las SGN en la cóclea25,26. 
Para estudiar las células progenitoras óticas sometidas a decisiones sobre el destino celular, se estableció previamente una línea celular de progenitores óticos multipotentes inmortalizados (iMOP) con destino restringido a partir de Sox2 que expresan progenitores cocleares. Las células iMOP se derivaron originalmente de una cóclea embrionaria E12.5-13.5 y se infectaron con un retrovirus c-Myc27. Las células iMOP pueden proliferar continuamente como células formadoras de colonias conocidas como otosferas y tienen la capacidad de diferenciarse en células ciliadas, células de soporte y SGN27. La comprensión de la capacidad de las células iMOP para diferenciarse en linajes óticos distintos permite la aplicación de estos hallazgos para generar de manera eficiente células ciliadas y SGN derivadas de iPSC o ESC. Los protocolos de diferenciación eficientes abrirán nuevas vías para las terapias de reemplazo celular de las enfermedades del oído interno que son recalcitrantes a los tratamientos convencionales. Una cuestión crucial en la generación de células óticas mediante cultivo celular in vitro es tener marcadores de diferenciación que ayuden a determinar si las células están en proceso de diferenciación. Cdkn1b (p27KIP) se ha utilizado ampliamente como un marcador temprano para la diferenciación en el oído interno en desarrollo, sin embargo, no se ha abordado la expresión de Cdkn1b en células iMOP y cómo se correlaciona con la diferenciación. En este estudio, se describen las condiciones actuales del cultivo y cómo la expresión de Cdkn1b se correlaciona con otros marcadores de diferenciación de iMOP.

<table><tbody><tr><td>CoolCell LX Contenedores de congelación celular sin alcohol</td><td>BioCision</td><td>BCS-405</td><td></td></tr><tr><td>Viales criogénicos (2 ml)&nbsp;</td>Cubreobjetos de vidrio <td>Corning</td><td>430654</td><td></td></tr><tr><td>de 1,5 de espesor (redondo 12 mm)</td><td>Ciencias de la microscopía electrónica</td><td>72230-01</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>11320-082</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal Medium Life</td><td>Technologies</td><td>21103</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS) pH 7.4</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Hank's Solución salina equilibrada (HBSS)</td><td>Life Technologies</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>B27 Suplemento (50X) Libre de suero</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td>Almacenado como alícuotas de 1 ml</td></tr><tr><td>L-Glutamina (200 mM)&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td>Almacenado como alícuotas de 5 ml</td></tr><tr><td>Natural Mouse Laminin</td><td>Life Technologies</td><td>23017-015</td><td>Almacenado como alícuotas de 1 mg/ml</td></tr><tr><td>Click-iT EdU Alexa Fluor 488&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>C10337</td><td></td></tr><tr><td>Synth-A-Freeze Medios de criopreservación</td><td>Life Technologies</td><td>A12542-01</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold Antifade</td><td>Mountant Life Technologies</td><td>47743-736</td><td>Almacenado como 10 mg/ml 100 y micro; l alícuotas Moxi</td></tr><tr><td>Z Mini Contador de celdas automatizado</td><td>Orflo&nbsp;</td><td>MXZ001</td><td></td></tr><tr><td>Moxi Z Cassette Tipo S</td><td>Orflo&nbsp;</td><td>MXC002</td><td></td></tr><tr><td>Factor de crecimiento de fibroblastos murinos recombinante, básico (bFGF)</td><td>Peprotech</td><td>450-33</td><td>Resuspendido en 0.1% BSA en H20 y almacenado como alícuotas de 20 mg/ml</td></tr><tr><td>Poly-D-Lisine</td><td>Sigma</td><td>P7886</td><td>Resuspendido en 1X PBS y almacenado como 10 mg/ml 100 &micro; l alícuotas</td></tr><tr><td>Carbenicilina, sal disódica</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP2648-1</td><td>Resuspendido en hepes de 10 mM pH 7,4 y almacenado como alícuotas de 100 mg/ml</td></tr> 5 <tr><td>ml pipeta envuelta individualmente en rústica (200/caja)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1367811D</td><td></td></tr><tr><td>pipeta de 10 ml envuelta individualmente en rústica (200/caja)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1367811E</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 24 pocillos Biolite tratada para cultivo de tejidos</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>130188</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 6 pocillos tratada con cultivo de tejidos</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>130184&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Plato de cultivo de tejidos tratado de 6 cm</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>130181&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>EMD Millipore Millex Jeringa estéril PVDF Filtro Tamaño de poro: 0.22 &mu; m</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SLGV033RS</td><td></td></tr><tr><td>TipOne puntas de pipeta con filtro 0,1 - 10 &mu; l punta de filtro alargada</td><td>USA Scientific</td><td>1120-3810</td><td></td></tr><tr><td>TipOne puntas de pipeta de filtro 1 - 20 &mu; l punta de filtro</td><td>USA Scientific</td><td>1120-1810</td><td></td></tr><tr><td>TipOne puntas de pipeta de filtro 1 - 200 &mu; l&nbsp; punta de filtro</td><td>USA Scientific</td><td>1120-8810</td><td></td></tr><tr><td>TipOne puntas de pipeta de filtro 101 - 1000 &mu; l punta de filtro</td><td>USA Scientific</td><td>1126-7810</td><td></td></tr><tr><td>15 ml tubos cónicos estériles 20 bolsas de 25 tubos (500 tubos)</td><td>USA Scientific</td><td>1475-0511</td><td></td></tr> tubos <tr><td>cónicos de 50 ml estériles 20 bolsas de 25 tubos (500 tubos)</td><td>USA Scientific</td><td>1500-1211</td><td></td></tr></tbody></table>

iniciando diferenciación en inmortalizadas células pluripotentes otic progenitoras

Initiating Differentiation in Immortalized Multipotent Otic Progenitor Cells

El uso de células madre pluripotentes inducidas humanas (iPSC) o células madre embrionarias (ESC) para terapias de reemplazo celular es muy prometedor. Varias limitaciones, como los bajos rendimientos y las poblaciones heterogéneas de células diferenciadas, obstaculizan el progreso de las terapias con células madre. Se generó una línea celular progenitora ótica multipotente inmortalizada (iMOP) de destino restringido para facilitar la diferenciación eficiente de un gran número de células ciliadas funcionales y neuronas ganglionares espirales (SGN) para terapias de reemplazo de células del oído interno. A partir de cultivos disociados de células iMOP individuales, se describieron protocolos que promueven la salida del ciclo celular y la diferenciación por retirada del factor de crecimiento básico de fibroblastos (bFGF). Se confirmó una disminución significativa de las células proliferantes después de la retirada de bFGF mediante un ensayo de proliferación de células EdU. Concomitante con una disminución de la proliferación, la diferenciación exitosa resultó en la expresión de marcadores moleculares y cambios morfológicos. La inmunotinción de Cdkn1b (p27,KIP) y Cdh1 (E-cadherina) en otosferas derivadas de iMOP se utilizó como indicador de diferenciación en epitelios sensoriales del oído interno, mientras que la inmunotinción de Cdkn1b y Tubb3 (β-tubulina neuronal) se utilizó para identificar las neuronas derivadas de iMOP. El uso de células iMOP proporciona una herramienta importante para comprender las decisiones sobre el destino de las células tomadas por los progenitores neurosensoriales del oído interno y ayudará a desarrollar protocolos para generar grandes cantidades de células ciliadas derivadas de iPSC o ESC y SGN. Estos métodos acelerarán los esfuerzos para generar células óticas para terapias de reemplazo.

bFGF Retiro disminuye la proliferación de células PIMO Para disminuir la capacidad proliferativa de las células PIMO e iniciar la diferenciación de las células PIMO, bFGF fue retirado de los cultivos. Para confirmar que la retirada del factor de crecimiento disminuye la proliferación, la incorporación EdU fue empleado como un ensayo de proliferación. El porcentaje de células que incorporaba EdU de otospheres c...

Se describen los protocolos actuales para mantener células progenitoras óticas multipotentes inmortalizadas (iMOP) y la diferenciación ótica. Se destacan las condiciones de cultivo y los marcadores moleculares que indican la diferenciación en epitelios sensoriales y neuronas ganglionares espirales (SGN).

Iniciando Diferenciación en inmortalizadas células pluripotentes Otic Progenitoras

Use of human induced pluripotent stem cells (iPSC) or embryonic stem cells (ESC) for cell replacement therapies holds great promise. Several limitations ...

El objetivo general de este procedimiento es diferenciar las células progenitoras óticas multipotentes inmortalizadas en tipos de células del oído interno. Por lo tanto, este método puede ayudarnos a abordar preguntas clave en la regeneración auditiva, como cómo los progenitores óticos pueden convertirse en células ciliadas cocleares o neuronas auditivas. Es importante destacar que esta técnica proporciona un sistema celular in vitro que se puede utilizar en paralelo con sistemas de modelos animales de mamíferos in vivo.Hoy demostrarán el procedimiento Azadeh Jadali, becaria postdoctoral en mi laboratorio, así como Zhichao Song y Alejandra Laureano, dos estudiantes de posgrado en el laboratorio. Después de preparar el medio de cultivo como se describe en el protocolo de texto, use tres mililitros de este líquido para colocar una placa de diez veces al sexto progenitor multipotente inmortalizado, o células IMOP, en una placa de cultivo de tejidos de 60 milímetros. Incubar las células durante cinco a siete días a 37 grados centígrados con cinco por ciento de dióxido de carbono.Cada dos días, duplique el volumen de líquido en el cultivo agregando medio fresco. Para pasar las células, primero transfiéralas de la placa de cultivo a un tubo cónico de 15 mililitros. Y luego coloque el tubo, a 37 grados centígrados, durante cinco a diez minutos.Durante este tiempo, se espera que las otosferas formadoras de colonias se acumulen en el fondo del cónico a través de la sedimentación por gravedad. A continuación, aspire el sobrenadante, teniendo cuidado de no alterar la paleta. Vuelva a suspender las otosferas añadiendo 0,5 mililitros de solución salina balanceada mejorada con EDTA o HBSS previamente precalentada, y luego pipeteando hacia arriba y hacia abajo dos o tres veces.Para facilitar la disociación de las otosferas en células individuales, coloque el cónico en una incubadora a 37 grados centígrados. Agite periódicamente la solución y cuando no se observen otosferas como sedimentos en el fondo del tubo, muévala a temperatura ambiente. Se procede a añadir dos mililitros de medio de cultivo a las células para neutralizar el EDTA.Y centrifugarlos a temperatura ambiente durante cinco minutos a 200 gs. A continuación, aspire la solución de EDTA diluida y lave las células con cinco mililitros de 1x PBS. Después de girar las celdas usando la misma configuración, aspire el 1x PBS.A continuación, agregue 0,5 mililitros de medio de cultivo al cónico. Y vuelva a suspender la paleta de celdas. Para el recuento, diluya las células IMOP de 1 a cien en medio de cultivo.A continuación, añada 75 microlitros de esta solución en un casete colocado en un contador de partículas microfluídicas y determine el número de células. A continuación, se coloque una placa por diez a la sexta célula IMOP en una placa de cultivo de tejidos de 60 milímetros como se ha descrito anteriormente y se repita este procedimiento de paso cada cinco a siete días. Tres días después de la siembra, utilice la sedimentación por gravedad para recolectar otosferas como se mostró anteriormente.Proceda a aspirar el sobrenadante. Y resuspender suavemente las células en dos mililitros de medio de diferenciación epitelial sensorial. A continuación, utilice una pipeta de poro grande de diez mililitros para transferir las otosferas a una nueva placa de 60 milímetros.Diferenciar las otosferas durante diez días. Añadiendo dos mililitros de medio de diferenciación fresco al cultivo cada dos días. Después, vuelve a cosechar las otosferas a través de la sedimentación por gravedad.Y aspirar el medio gastado. A continuación, fije las otosferas en un cuatro por ciento de paraformaldehído en 1x PBS durante 15 minutos a temperatura ambiente. A continuación, retire la solución de formaldehído y lave las células con 1x PBS que contenga un 0,1 por ciento de Triton x100.Proceda bloqueando las otosferas en 1x PBS suplementado con un diez por ciento de suero de cabra y un 0,1 por ciento de Triton x100. Después de una hora, sustituya el tampón de bloqueo por el que contenga la dilución adecuada del anticuerpo Cdkn1b o CDH1. A continuación, incubar las células en el anticuerpo primario durante la noche a cuatro grados centígrados.Y al día siguiente continuar con la inmunotinción utilizando anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia, Phalloidin y Hoechst, como se describe en otra parte. Para prepararse para la toma de imágenes, coloque el medio de montaje en un portaobjetos de vidrio. Y luego introducir las otosferas teñidas en el medio.A continuación, coloque un cubreobjetos encima de la muestra. Después de dejar que el medio de montaje se seque durante la noche a cuatro grados centígrados, coloque el portaobjetos en la platina de un microscopio invertido equipado con una cámara CCD de 16 bits. Con el objetivo de aire 20x 0,75, adquiera imágenes de epifluorescencia mediante la recopilación de datos de los canales azul, verde, rojo e infrarrojo.Primero, limpie los cubreobjetos redondos de vidrio colocándolos en una placa estéril de 100 milímetros y sumergiéndolos en etanol al 70 por ciento. Agite suavemente las fundas para asegurarse de que estén cubiertas y deje el plato a temperatura ambiente durante diez minutos. A continuación, enjuague los cubreobjetos tres veces en 1x PBS estéril y luego una vez con agua estéril.A continuación, deje que las fundas se sequen exponiéndolas a la luz ultravioleta en una campana de cultivo de tejidos durante 15 minutos. Para uso inmediato, coloque un cubreobjetos estéril en cada pocillo de una placa de 24 pocillos. Y agite suavemente la placa para asegurarse de que todos los cubreobjetos queden planos.A continuación, cubra los cubreobjetos añadiendo 0,25 mililitros de 1x PBS que contenga 10 micrógamas por mililitro de lisina poli D a cada pocillo. Después de que la placa haya incubado durante una hora a 37 grados centígrados, retire la solución de lisina poli D y lave los pocillos tres veces con PBS estéril 1x. Una vez aspirado el líquido del último lavado, introducir 0,25 mililitros de 1x PBS que contenga 10 microgramos por mililitro de laminina, en cada uno de los 24 pocillos.Después de incubar la placa durante la noche a 37 grados centígrados, aspire la solución de laminina, luego lave cada pocillo con un mililitro de 1x PBS tres veces, pero deje el PBS del último lavado en los pocillos hasta que las células estén listas para ser plateadas. Para comenzar la diferenciación neuronal, cuente las células de las otosferas disociadas como se describió anteriormente. Y luego resuspenderlos en un medio de diferenciación neuronal precalentado.Proceda sembrando entre uno y un punto cinco veces diez hasta la quinta celda IMOP en cada pocillo de la placa que contiene los cubreobjetos recubiertos. Incubar la placa a 37 grados centígrados, con cinco por ciento de dióxido de carbono. Sustituyendo el medio de diferenciación neuronal cada dos días.Después de siete días, aspire el medio y fije las celdas, que deben estar unidas a los cubreobjetos, agregando un cuatro por ciento de formaldehído en cada pocillo. Y dejándolos durante 15 minutos a temperatura ambiente. A continuación, retire el formaldehído y lave las células una vez en 1x PBS que contenga un 0,1 por ciento de Triton x100.A continuación, retire el tampón de lavado. Y agregue un tampón de bloqueo que consta de 1x PBS que contiene un diez por ciento de suero de cabra normal y un 0,1 por ciento de Triton x100 a cada pozo. Deje las celdas durante una hora a temperatura ambiente.Y luego retire el líquido y reemplácelo con un tampón de bloqueo que contenga la dilución adecuada del anticuerpo Cdkn1b o Tubb3. Después de una incubación nocturna a cuatro grados centígrados, lave las células una vez con 1x PBS que contenga un uno por ciento de Triton x100. Y luego proceda con la inmunotinción como se describió anteriormente.Una vez que se haya completado la tinción, realice un lavado final agregando 1x PBS a los pocillos. Para prepararlos para el análisis, retire los cubreobjetos a los que se adhieren las células teñidas de la placa de 24 pocillos. Y colóquelos en un medio de montaje en un portaobjetos de vidrio.Después de dejar que el medio de montaje se seque durante la noche a cuatro grados centígrados, adquiera imágenes de epifluorescencia como se describió anteriormente. Las otosferas cultivadas durante diez días en un medio de diferenciación epitelial muestran un aumento de la expresión de Cdkn1b, un inhibidor de la quinasa dependiente del ciclo, y un marcador de diferenciación en el oído interno, en comparación con las células indiferenciadas. En este caso, la tinción de Hoechst sí detectó núcleos celulares.Estas células también exhiben cambios morfológicos en los filamentos de actina y en las regiones de adhesión célula-célula características de los epitelios. Indicado por la aparición de faloidina y el marcaje de Cdh1 en las periferias celulares. Las otosferas también se pueden dirigir para formar neuronas.Esta imagen de campo claro muestra que después de siete días en un medio de diferenciación neuronal, las células IMOP exhiben neuritas. La inmunotinción de estas células con un marcador neuronal Tubb3 confirma su diferenciación. Y también expresan de forma robusta Cdkn1b.Esto sugiere que la señal dual Tubb3, Cdkn1b puede usarse como un indicador de diferenciación neuronal en células IMOP. Las células diferenciadas e indiferenciadas de fluorescencia de Cdkn1b también se normalizaron determinando su relación con la señal de Hoechst, proporcionando resultados cuantitativos. Aquí se muestran histogramas de estos datos.En estos gráficos se presentan los porcentajes de células IMOP indiferenciadas y diferenciadas por encima de un umbral predeterminado de Cdkn1b normalizado. Ambas poblaciones diferenciadas muestran un aumento significativo en el porcentaje de células que expresan Cdkn1b en comparación con los controles indiferenciados, lo que confirma la diferenciación sugerida por la inmunofluorescencia. Una vez dominado, el cultivo rutinario y la diferenciación de las células IMOP se pueden realizar en 30 minutos, si se realiza correctamente.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo iniciar la diferenciación de las células IMOP. Gracias por ver este video. Y buena suerte con tus experimentos.

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