Name: Administrar y Detección de Marcas de proteínas de Artrópodos de Dispersión de Investigación (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Aprende técnicas de marcado proteico en artrópodos para investigar dispersión y migración de insectos usando ELISA. Este método simple permite estudiar patrones de migración y especies invasivas en hábitats naturales.

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El financiamiento fue proporcionado por el USDA CRIS 5347-22620-021-00D y, en parte, por la Agricultura y la Alimentación de Investigación Iniciativa Competitiva subvención no. 2011-67009-30141 del Instituto Nacional del USDA de la Agricultura y la Alimentación. Estamos muy agradecidos por el apoyo técnico de Johanna Nassif. También queremos agradecer a Paul Baker, David Horton, Diego Nieto, y Frances Sivakoff para proporcionar algunas de las imágenes utilizadas en la Figura 3.

1. Marque Interna, Retención y Procedimiento de Detección <ol><li> Procedimiento de marcación interna <ol><li> Recoge los insectos de interés (n ≈ 100 individuos) de una colonia de laboratorio criados con una dieta artificial o desde el campo y se dividen en dos contenedores de cría limpias. </li><li> Coloque un paquete regular de 20 ml de dieta (tratamiento control negativo sin marcar) en uno de los contenedores. Suplemento de un segundo paquete de 20 ml artificial dieta con 1,0 ml de una solución de 1,0 mg / ml de IgG de pollo / IgY, mezclar bien, y colocarlo en otro recipiente. Nota: Si el insecto de interés no tiene una dieta artificial, la marca se puede colocar sobre o en cualquiera que sea la dieta que normalmente se mantienen en (por ejemplo, judías verdes, huevos de la polilla, el agua, el azúcar, la miel). </li><li> Permitir a los insectos para reanudar su actividad de alimentación durante 24 horas. </li></ol></li><li> Procedimiento de retención de marca interna <ol><li> Retire los paquetes de la dieta de cada contenedor y suministrar los insectos wITH otra fuente de alimento para sostenerlos durante la duración del experimento (por ejemplo, judías verdes). </li><li> Recoger una cohorte (n = 20) de los insectos diariamente (o en cualquier intervalo de tiempo deseado) de cada tratamiento y congelar inmediatamente a -20 ° C. </li></ol></li><li> Sandwich procedimiento ELISA <ol><li> Añadir 50 l de conejo anti-pollo IgY anticuerpo primario diluido 1: 500 en solución salina amortiguadora Tris (TBS) a cada pocillo de una microplaca de ELISA limpia e incubar durante un mínimo de 1 hora a RT (nota: las microplacas también se pueden incubar O / N a 4 ° C). </li><li> Desechar el anticuerpo de la placa y bloquear cada pocillo con 300 l de una solución de leche seca no grasa 1,0% durante 30 min. </li><li> A la espera de los pasos de incubación anteriores, colocar insectos congelados individualmente en 1,6 ml tubos de microcentrífuga con 1,0 ml de TBS. </li><li> Moler cada insecto con una mano limpia hasta que se homogeneizó a fondo y añadir 100 l de cada muestra a un pocillo individual de la prueba ELISAplato. Permitir que las muestras se incuban a temperatura ambiente a durante 1 h. </li><li> Añadir 100 l de negativo (TBS solamente) y positivos (claras de huevo en TBS) controles a pozos en la primera columna de cada placa de ELISA. Además, añadir 100 l de controles negativos de insectos (insectos sin marcar) a los 8 pozos en la última columna de cada placa (Figura 1). Permitir que las muestras de control incubar a temperatura ambiente durante 1 hr. Tenga en cuenta que la plantilla proporcionada en la Figura 1 es la plantilla que utilizamos para nuestros ensayos estandarizados. La colocación de las muestras en los pocillos es a la discreción del investigador. </li><li> Lavar cada pocillo tres veces con tampón fosfato salino (PBS) Tween y luego añadir 50 l de IgG de conejo anti-pollo / IgY conjugado con peroxidasa de rábano picante diluida 1: 10.000 en solución de leche 1% y se incuba durante 1 hora a RT. </li><li> Lavar cada pocillo tres veces con PBS-Tween y añadir 50 l de tetrametilbencidina (TMB) a cada pocillo. </li><li> Después de 10 min, leer los pozoscon un espectrofotómetro de microplacas ajustado a una longitud de onda de 650 nm. </li></ol></li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53693/53693fig1.jpg" /> Figura 1. Un diagrama esquemático que muestra las designaciones así estandarizados utilizados para una típica de 96 pocillos ELISA microplaca. Cada placa contiene 7 pozos dedicados a controles negativos de solución salina tamponada con Tris (TBS), un pozo dedicados a un control de la proteína positivo (Pos Ctrl), 80 pozos individuales dedicadas a insectos recapturados (muestra 1 ... 80), y 8 pozos dedicados a controles sin marcar (negativos) de insectos (Neg Ctrl 1 ... 8). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53693/53693fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> 2. Marque externa, Retención y Procedimiento de Detección <ol><li> Procedimiento de marcado externo <ol><li> Recoge los insectos de interés (n ≈ 100individuos) de una colonia de laboratorio o de campo y el lugar en dos recipientes de plástico 1.0 L con un agujero de 2,5 cm de diámetro perforados por el lado de cada contenedor. </li><li> Pulverizar los insectos en el primer recipiente con 1,0 ml de dH 2 O (tratamiento control negativo) utilizando un nebulizador médico. Pulverizar los insectos en el segundo recipiente con 1,0 ml de una solución 5,0% de claras de huevo de pollo usando un nebulizador médico. </li><li> Conecte la manguera del nebulizador a una toma de aire estándar de laboratorio y luego insertar la desembocadura del nebulizador en el agujero de 2,5 cm del recipiente. A continuación, encienda la salida de aire gradualmente hasta que el nebulizador produce un vapor. </li><li> Continuar pulverización (marcado) hasta que la solución claras de huevo se ha dispensado (aprox. 2-5 minutos). </li><li> Retire el nebulizador y colocar un tapón en el orificio del recipiente de plástico. Permita que los insectos que están a temperatura ambiente hasta que la solución se haya secado completamente. </li></ol></li><li> Procedimiento de retención de marca externa<ol><li> Coloque cada tratamiento de los insectos secos en un recipiente de cría limpia separada para evitar una mayor exposición a la marca. </li><li> Añadir alimentos y agua a los recipientes limpios para sostener los insectos durante la duración del estudio. </li><li> Recoge una cohorte (n = 20) de los insectos de cada tratamiento diario y congelar inmediatamente a -20 ° C. </li></ol></li><li> Procedimiento ELISA indirecto <ol><li> Coloque los insectos congelados individualmente en tubos de microcentrífuga de 1,6 ml y añadir 1,0 ml de TBS. </li><li> Remoje las muestras durante 1 hora en un conjunto agitador orbital a 120 rpm. </li><li> Añadir controles positivos y negativos como se describe en el Paso 1.3.5. </li><li> Después de remojar, pipetear una parte alícuota de 100 l de cada muestra en uno de los 80 pocillos de muestras designadas en una nueva placa de ELISA de 96 como se muestra en la Figura 1 Permitir que las muestras se incuban durante 1 hora a RT (nota:. Las microplacas También puede haber O incubado / N a 4 ° C). </li><li> Lavar éstos tres veces conPBS-Tween y luego añadir 300 l de fosfato salino tamponada que contiene 1% de albúmina de suero bovino (PBS-BSA) a cada pocillo. </li><li> Después de 30 min a TA lavar dos veces con PBS-Tween. </li><li> Añadir 50 l de conejo anti-albúmina de huevo anticuerpo primario diluido 1: 8000 en PBS-BSA-Silwet (0,05%) a cada pocillo e incubar durante 1 hora a RT. </li><li> Lavar cada pocillo tres veces con PBS-Tween y luego añadir 50 l de IgG de cabra anti-conejo conjugado con peroxidasa de rábano diluida 1: 2000 en PBS-BSA-Silwet (0,05%) durante 1 hora a RT. </li><li> Lavar cada pocillo tres veces con PBS-Tween y se añaden 50 l de sustrato TMB a cada pocillo. </li><li> Después de 10 min, leer los pocillos con un espectrofotómetro de microplacas ajustado a una longitud de onda de 650 nm. </li></ol></li></ol> Análisis 3. Datos <ol><li> Calcular el valor medio de absorbancia de los insectos de control negativo 8 en cada placa ELISA y luego calcular la desviación estándar a partir de los controles negativos agrupados lado a otrom todas las placas de ELISA de un estudio dado 12. </li><li> Añadir seis veces la desviación estándar combinada con la media obtenida para cada placa ELISA para obtener un valor umbral positivo ELISA. Cualquier muestra de insectos obteniéndose un valor de absorbancia igual o mayor que este valor se considera que es positivo para la presencia de la marca de la proteína. </li></ol>

La mención de nombres comerciales o productos comerciales en esta publicación es únicamente con el propósito de proporcionar información específica y no implica recomendación ni aprobación por el Departamento de Agricultura de Estados Unidos. USDA es un proveedor de igualdad de oportunidades.

El procedimiento inmunomarcaje proteína artrópodos fue descrita por primera vez casi un cuarto de siglo atrás 9. Desde entonces, el procedimiento se ha adaptado para estudiar los patrones de dispersión de una amplia variedad de artrópodos utilizando administrados tanto interna como externamente IgG / IgY. Estas proteínas han demostrado marcadores firmes para la amplia variedad de especies de insectos ensayadas hasta el momento. Sin embargo, como se mencionó anteriormente, la principal limitación para el uso d...

Seguimiento de los movimientos de plagas de artrópodos, enemigos naturales (parasitoides y depredadores), y polinizadores en la naturaleza es esencial para comprender mejor la manera de mejorar los servicios de los ecosistemas. El componente clave para la mayoría de tipos de investigación dispersión está teniendo un método fiable para etiquetar el artrópodo (s) de interés. Una variedad de materiales (por ejemplo, pinturas, tintes, polvos de colores, etiquetas, elementos raros, proteínas) se han utilizado para marcar los artrópodos para evaluar su dinámica poblacional, la capacidad de dispersión, la alimentación de comportamientos y otras interacciones ecológicas 1,2. La idoneidad de un marcador utilizado para cualquier investigación dispersión dada dependerá del tipo de estudio que se llevó a cabo. Hay tres grandes categorizaciones para marcar artrópodos: (1) la marca de liberación y recaptura (MRR), (2) la marca de captura, y (3) la auto-marca-de captura. Para la investigación signo de liberación y recaptura, el investigador normalmente marca los artrópodos colectivamente en el Laboratory y los libera en un punto central en el campo. Los artrópodos son luego recapturados en distintos intervalos espaciales y temporales utilizando diferentes dispositivos de recogida (por ejemplo, la red de barrido, vacío, trampa pegajosa) 3,4,5. Los ejemplares recapturados se examinan a continuación, para la marca específica para distinguir liberado de personas nativas. Para la investigación marca de captura, el investigador normalmente se aplica la marca directamente en el equipo de aspersión campo utilizando (por ejemplo, pulverizador de mochila, la pluma y el pulverizador de boquilla). Los mejores marcadores para la investigación marca de captura son de bajo costo y de fácil aplicación para el hábitat de los artrópodos. Para la investigación propia marca de captura, el investigador suele aplicar marcas a un cebo artrópodos 6,7 o nido de entrada 8. A su vez, el artrópodo marca internamente devorando el cebo marcado o externamente por &quot;cepillado&quot; en contra de la marca a medida que sale del nido. Como se mencionó anteriormente, muchos tipos de marcadores nos han sidoed para etiquetar una variedad de especies de artrópodos. Sin embargo, muy pocos son útiles para estas tres categorías de investigación de dispersión. El desarrollo del procedimiento inmunomarcaje proteína fue un gran avance para el marcado de los insectos. Inmunomarcaje pone una etiqueta de proteínas en los artrópodos, ya sea interna o externamente, que, a su vez, se detecta mediante un ensayo anti-proteína específica inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA). Los primeros marcadores tales proteínas utilizadas fueron inmunoglobulina de conejo (IgG) y pollo IgG / IgY 9,10. Demostraron ser marcas muy eficaces para MRR y la investigación propia marca de captura (véase el debate). Por desgracia, las proteínas de IgG / IgY son costosos y por lo tanto no son prácticos para la investigación mark-captura y la mayoría de los tipos de investigación propia marca de captura. Posteriormente, los ELISA de detección de proteínas de segunda generación fueron desarrollados para las proteínas contenidas en la clara de huevo de pollo (albúmina), la leche de vaca (caseína) y la leche de soja (proteína inhibidora de tripsina). Cada ensayo es muy sensible, específico, y, lo másimportante, utiliza las proteínas que son mucho menos costosas que las proteínas de IgG / 11 IgY. Estas proteínas han demostrado ser eficaces para el MRR, marca de captura, y la investigación propia marca de captura (véase el debate). En este artículo, describimos y demostramos cómo llevar a cabo estudios de retención de laboratorio marca proteína. Tales estudios son la primera fase de la investigación necesaria para cualquier tipo de estudio de campo de dispersión. En concreto, es fundamental que los investigadores saben cuánto tiempo se mantendrá la marca en las especies de artrópodos dirigidos antes de embarcarse en estudios de campo de dispersión. A continuación, describimos y demostramos cómo marcar interna y externamente insectos para MRR, marca de captura, y estudios de campo de tipo auto-marca-de captura. A continuación, mostramos la forma de detectar la presencia de las marcas con los ELISA indirectos y sándwich.

<table><tbody><tr><td>Contenedor de almacenamiento de alimentos (para la cría de insectos)</td><td>Rubbermaid/Tupperware</td><td>Varios tamaños</td><td>Varios fabricantes y proveedores. La tela de malla se pega en una ventana</td></tr><tr><td>Nebulizador de pequeño volumen (Micro Mist)</td><td>Teleflex-Hudson RCI</td><td>1881</td><td>Disponible en línea y en tiendas de suministros médicos. Otras marcas también funcionarán.</td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga, 1,6 ml con tapa</td><td>Productos de laboratorio Continental</td><td>4445.X</td><td>Cualquier tipo similar funcionará. Preferimos marcas que tengan tapas fáciles de abrir.</td></tr><tr><td>Caja de almacenamiento de espuma de poliestireno para tubos de microcentrífuga (rejilla de 5x20)</td><td>RPI Corp.</td><td>145746</td><td>Este diseño es agradable porque no abarrota los tubos.</td></tr><tr><td>Dispensador, repetidor</td><td>Eppendorf</td><td>4982000322</td><td>Cualquier cosa similar ayudará a acelerar la dispensación.</td></tr><tr><td>Majas, molinillos de papel desechables de plástico, 1,5 ml</td><td>Kimble Chase</td><td>749521-1500</td><td>Disponible con varios proveedores. Los morteros se pueden limpiar y esterilizar en autoclave para su reutilización.</td></tr><tr><td>Placas BD Falcon ELISA, 96 pocillos (fondo plano)</td><td>Pipeta BD</td><td>351172</td><td></td></tr><tr><td>Ovation, manual (20-200 y micro; l)</td> <td>VistaLab</td><td>1057-0200 o 1070-0200</td><td>Cualquier tipo similar funcionará. Este modelo es ergonómico.</td></tr><tr><td>Depósitos, reactivo estéril</td><td>VistaLab</td><td>4054-1000</td><td>Cualquier cosa similar funcionará.</td></tr><tr><td>Pipeta electrónica, 8 canales (50-1.200 y micro; l) (Biohit eLine)</td><td>Sartorius</td><td>730391</td><td>Si tuvieras que elegir un modelo electrónico, este tamaño es el más útil.</td></tr><tr><td>Pipeta electrónica, 8 canales (10-300 y micro; l) (Biohit eLine)</td><td>Sartorius</td><td>730361</td><td>Cualquier cosa similar funcionará.</td></tr><tr><td>Colector, arandela de placas multipocillo (8 posiciones, recta)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z369802&nbsp;</td><td>Cualquier cosa similar funcionará para el lavado manual de platos.</td></tr><tr><td>Lector de microplacas con detección de absorbancia</td><td>Molecular Devices</td><td>SpectraMax 250</td><td>Cualquier cosa similar funcionará.</td></tr><tr><td>Pollo IgG/IgY</td><td>Estados Unidos Biológico</td><td>I1903-15R</td><td>También disponible en otras fuentes</td></tr><tr><td>Claras de huevo</td><td>Tienda de comestibles</td><td>" Todos los blancos", " Batidores de huevos", etc.</td><td>Mezcle 5 ml con 95 ml dH2O para solución al 5%</td></tr><tr><td>Tris (Trizma Base)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>2.42 g/L para hacer TBS</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td>29.22 g/L para hacer TBS y 8.0&nbsp; g&#8288;/&#8288; L para PBS</td></tr><tr><td>Fosfato de sodio dibásico (Na2HPO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0876</td><td>1,14 g/L para PBS</td></tr><tr><td>Fosfato de potasio monobásico (KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td>0,2 g/L para PBS</td></tr><tr><td>Cloruro de potasio (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td>0,2 g/L para PBS</td></tr><tr><td>Tween 20, Grado EIA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td>Agregue 0,5 ml por L al PBS después de que se disuelvan las sales.</td></tr><tr><td>PBS con 1% BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3688</td><td>Mix 1 paquete en 1 L dH2O</td></tr><tr><td>Anti-Chicken IgY (IgG) (molécula entera) anticuerpo producido en conejo (1:500)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6409</td><td>Mix 100 &micro; l en 50 ml de</td></tr><tr><td>leche en polvo o fresca TBS (1%)</td><td>Tienda de comestibles</td><td></td><td>Mezcla 10 g con 1 L dH2O para solución al 1%</td></tr><tr><td>Anti-pollo IgY (IgG) (molécula entera)-Anticuerpo peroxidasa producido en conejo (1:10.000)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9046</td><td>Mix 100 &micro; l en 1 L de leche al 1% Anticuerpo</td></tr><tr><td>anti-albúmina de huevo de gallina producido en conejo (1:8.000)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6534</td><td>Diluido 125 &micro; l en 1 L PBS-BSA</td></tr><tr><td>Cabra Anti-Conejo IgG Peroxidasa Conjugado (1:2.000)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6154</td><td>Diluir 0,5 ml en 1 L PBS-BSA, luego añadir 1,3&nbsp; ml Silwet</td></tr><tr><td>Vac-In-Stuff (Silwet L-77) copolímero de silicio-poliéter</td><td>Lehle Seeds</td><td>VIS-01</td><td>Añadir como último ingrediente</td></tr><tr><td>TMB Microwell Sustrato de peroxidasa de un componente</td><td>SurModics</td><td>TMBW-1000-01</td><td></td></tr></tbody></table>

administrar y detección de marcas de proteínas de artrópodos de dispersión de investigación

Administering and Detecting Protein Marks on Arthropods for Dispersal Research

Monitoreo movimiento artrópodos se requiere a menudo para comprender mejor la dinámica de población asociados, patrones de dispersión, las preferencias de la planta huésped, y otras interacciones ecológicas. Los artrópodos suelen ser rastreados en la naturaleza mediante el etiquetado con una marca única y luego vuelven a su recogida en el tiempo y en el espacio para determinar sus capacidades de dispersión. Además de las etiquetas físicas reales, como el polvo o pintura de color, varios tipos de proteínas han demostrado ser muy eficaz para el marcado de los artrópodos para la investigación ecológica. Las proteínas se pueden administrar internamente y / o externamente. Las proteínas pueden entonces ser detectados en los artrópodos recapturados con un ensayo ligado a enzimas específico de la proteína de inmunoabsorción (ELISA). Aquí se describen los protocolos para la externa como internamente etiquetado artrópodos con la proteína. Dos ejemplos experimentales sencillos se demuestran: (1) una marca de proteína interna presenten a un insecto, proporcionando una dieta enriquecida con proteínas y (2) una marca de proteína externa tópicamente unpplied a un insecto usando un nebulizador médico. A continuación relacionamos una guía paso a paso del sándwich y métodos indirectos de ELISA utilizados para detectar signos de proteínas en los insectos. En esta demostración, se discuten diversos aspectos de la adquisición y la detección de marcadores de proteínas en los artrópodos para la marca de liberación y recaptura, marca de captura, y los tipos de auto-marca-captura de la investigación, junto con las diversas formas en que el procedimiento inmunomarcaje ha sido adaptado para adaptarse a una amplia variedad de objetivos de investigación.

Marcado interno: Los resultados de la prueba de retención marca interna se muestran en la Figura 2A. El valor umbral crítico ELISA calculado era 0.054. En general (en todas las cuatro fechas muestra combinada), los insectos tratados sin proteínas dieron valores constantemente bajos de ELISA (x = 0,038 ± 0,002, n = 80). Por el contrario, todos los insectos alimentados con la dieta enri...

Las proteínas se utilizan a menudo para marcar artrópodos para la investigación de dispersión. Se demuestran los métodos para administrar marcas de proteínas internas y externas en artrópodos. También se ilustran las técnicas de detección de marcas de proteínas, ya sea a través de ensayos inmunoenzimáticos indirectos o en sándwich (ELISA).

Administrar y Detección de Marcas de proteínas de Artrópodos de Dispersión de Investigación

Monitoring arthropod movement is often required to better understand associated population dynamics, dispersal patterns, host plant preferences, and other ...

El objetivo general de esta demostración es describir cómo marcar insectos con proteínas para la investigación de dispersión o migración. En esta demostración se incluyen métodos sobre cómo detectar las marcas mediante un sándwich o un ensayo de inmunoabsorción indirecta ligado a enzimas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la investigación sobre la dispersión de insectos.Se puede utilizar para estudiar los patrones de migración de insectos, las preferencias de las plantas hospedadoras y la propagación de especies invasoras. Las ventajas de esta técnica son que el método de detección es sencillo y económico. Adecuado para un alto rendimiento, y los animales se pueden marcar fácilmente directamente en su hábitat natural.Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades, porque parece más difícil de lo que es, porque la mayoría de los investigadores de campo no tienen experiencia con esta técnica simple. La primera vez que tuve la idea de este método fue en 1989. Estábamos criando insectos depredadores de ojos grandes con una dieta artificial.Nos preocupaba que estos insectos no fueran depredadores efectivos de una plaga de insectos Lygus después de haber sido criados en cautiverio durante mucho tiempo con una dieta antinatural. En otras palabras, serían domesticados. Necesitábamos un método seguro, eficaz y barato para distinguirlos de sus homólogos nativos después de su liberación en el campo.Ninguno de los métodos de marcado actuales se ajusta a estos criterios. Una experiencia previa que tuve utilizando el procedimiento ELISA para realizar análisis del contenido intestinal de los depredadores para los restos de proteínas específicas de Lygus, me dio la idea de aplicar una marca de proteína extraña en el depredador criado en el laboratorio. A su vez, se pudieron analizar en el campo los restos de Lygus y los restos de proteínas foráneas.Para empezar, recoja unos 100 insectos de interés de una colonia de laboratorio o del campo, y divídalos en dos contenedores de cría limpios. Cargue un recipiente con un paquete de dieta regular de 20 mililitros, para que sirva como control negativo. Por el otro, mezcle un paquete de dieta con un miligramo de pollo IgG-IgY.Agregue un mililitro de solución y mezcle bien. Si es necesario, use los insectos con los que normalmente se alimentan en lugar del paquete. Después de 24 horas de haber sido criados con estos paquetes de dieta, suministre a ambos grupos de insectos alimento normal sin marcar.En los intervalos de tiempo deseados, recoja 20 insectos individuales de cada cohorte. Congélelos a menos 20 grados centígrados, hasta que se recolecten todas las cohortes necesarias para el experimento. Para preparar una placa de 96 pocillos para el ELISA, a cada pocillo se añadan 50 microlitros de anticuerpo primario IgY anti-pollo de conejo diluido uno en 500 en solución salina tamponada Tris, o TBS.Deje incubar la placa cargada durante al menos una hora a temperatura ambiente o toda la noche a cuatro grados centígrados. Más tarde, vacíe los pocillos y agregue 300 microlitros de solución de bloque a cada pocillo. Esta es una solución de leche en polvo descremada al uno por ciento.Deje incubar la placa durante 30 minutos a temperatura ambiente. Durante la incubación en bloque, transfiera los insectos congelados individuales a tubos de microcentrífuga cargados con un mililitro de TBS. Luego, homogeneice bien cada insecto con un mortero limpio.Cuando la placa esté lista, cargue cada pocillo con 100 microlitros de una muestra de insecto homogeneizada. Cada placa de 96 pocillos tiene capacidad para 80 especímenes. Deje la primera y la última columna de la placa vacías para los controles.En la primera columna, cargue siete alícuotas de 100 microlitros de TBS solo y cargue un pozo con 100 microlitros de TBS con control positivo de clara de huevo. En la última columna, cargue 100 microlitros de ocho preparaciones individuales de insectos sin marcar. Deje que las muestras se incuben a temperatura ambiente durante al menos una hora.Después de la incubación, lave cuidadosamente los pocillos tres veces con solución salina tamponada con fosfato Tween, o PBS-Tween. A través de nuestra experiencia, hemos aprendido que la mayoría de los errores ocurren durante los pasos de lavado. Las salpicaduras pueden provocar una alta incidencia de reacciones falsas positivas, así que tenga cuidado.Después de los lavados, agregue 50 microlitros de IgG-IgY anti-pollo de conejo conjugado con peroxidasa de rábano picante y diluya de uno a 10, 000 en una solución de leche al uno por ciento. Deje que la solución se incube en los pocillos durante al menos una hora a temperatura ambiente. Más tarde, lave la placa tres veces con PBS-Tween como antes.A continuación, cargue los pozos con 50 microlitros de sustrato TMB. Es posible que comiences a ver un cambio de color de inmediato. Deje incubar la placa durante 10 minutos antes de leerla con un espectrofotómetro de microplacas.Lea la placa a 650 nanómetros y registre los valores. Para marcar externamente los insectos, prepare botellas de plástico de un litro con orificios de acceso y divida 100 insectos en dos botellas. Luego, rocíe los insectos en un recipiente con un mililitro de agua destilada, que sirve como control negativo.A continuación, conecte un nebulizador médico a una salida de aire y ajuste el flujo de aire para que el nebulizador produzca vapor. Rocíe los otros insectos con un mililitro de solución de clara de huevo de gallina al cinco por ciento. El proceso de pulverización debería tardar entre dos y cinco minutos en completarse.Luego, tapona los agujeros y deja que la solución se seque completamente a temperatura ambiente. Una vez secos, transfiera los insectos a sus contenedores de cría normales, con su dieta estándar y manténgalos como de costumbre. Más tarde, recoja los insectos a intervalos de tiempo predeterminados para realizar las pruebas.Para comprobar la retención de la marca externa, utilice un procedimiento idéntico al ensayo ELISA para probar la retención de la marca interna, con pequeñas modificaciones. Después de que los insectos se transfieran a tubos de microcentrífuga con TBS, déjelos en remojo en un agitador orbital a 120 RPM durante una hora, en lugar de homogeneizarlos. Después de remojar los insectos, pipetee 100 microlitros de la solución en los pocillos de la placa y deje que la placa incube durante al menos una hora.Después de lavar las muestras de insectos, agregue 300 microlitros de PBS con un uno por ciento de BSA a cada pocillo. Después de 30 minutos a temperatura ambiente, lave los pocillos dos veces con PBS-Tween. Luego, a cada pocillo, agregue 50 microlitros de anticuerpo primario anti-albúmina de huevo de conejo, diluido uno en ocho mil en la silueta PBS-BSA.Incube la placa durante al menos una hora y lave los pocillos como antes. Luego, a cada pocillo, se añaden 50 microlitros de IgG anti-conejo de cabra conjugada con peroxidasa de rábano picante, y diluido uno en dos mil, en silueta PBS-BSA. Deje incubar la placa durante al menos una hora, a temperatura ambiente y luego proceda con el protocolo como se describió anteriormente.La retención de la marca interna se probó en cuatro puntos temporales. En general, los insectos tratados sin proteína produjeron valores de ELISA consistentemente bajos. Mientras que, todos los insectos alimentados con la dieta enriquecida con proteínas produjeron valores de ELISA consistentemente fuertes.Las marcas externas también se probaron en cuatro puntos temporales. Los insectos que se marcaron tópicamente con claras de huevo arrojaron valores consistentemente fuertes. Como era de esperar, los controles negativos rociados con agua registraron valores de ELISA muy bajos.Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo marcar insectos y analizarlos para detectar la presencia de la marca. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en cuatro horas y 30 minutos si se realiza correctamente. En el transcurso de un día, se pueden procesar 16 placas de ensayo con más de 1000 muestras.Al intentar este procedimiento, es importante recordar que el ensayo es extremadamente sensible. Como tal, es imperativo que todas las superficies, recipientes y equipos estén libres de contaminación por proteínas. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores exploraran los patrones de dispersión de insectos locales y en toda el área en hábitats agrícolas, urbanos, forestales y otros hábitats naturales.Hemos demostrado en un ejemplo a pequeña escala aquí, sin embargo, la técnica se ha utilizado a una escala mucho mayor para etiquetar a los insectos directamente en su hábitat natural utilizando equipos comerciales de pulverización. Nos hemos sorprendido con las aplicaciones creativas de nuestros colaboradores.

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La capacidad para detectar con precisión las transcripciones o las proteínas en los tejidos de la Drosophila es fundamental para el estudio de su abundancia y localización relacionada con el proceso de desarrollo. Aquí está la descripción de un sencillo procedimiento para disecar alas pupas. Estas alas pueden utilizarse como muestras en diversas técnicas (análisis de PCR, immunohistochemistry, etc.).

Un método rápido y eficiente para disecar alas Pupal de Drosophila apto para Immunodetections o ensayos PCR

Este protocolo describe los pasos para utilizar el nuevo software, SwarmSight, para el rastreo de cuadro por cuadro de insectos antena y proboscis de vídeos de cámara web convencional utilizando equipos convencionales. El software libre, código abierto procesos Marcos cerca de 120 veces más rápido que los seres humanos y se realiza en mejor que la precisión humana.

SwarmSight: Seguimiento en tiempo real de movimientos de insecto de antena y reflejo de extensión probóscide utilizando una preparación común y Hardware convencional

Describimos cómo cuantificar los artrópodos de morada de las hojas sellando las hojas y el extremo de las ramas en una bolsa, cortando y congelando el material embolsado, y encerrando el material previamente congelado en agua para separar los artrópodos del sustrato para la cuantificación.

Un método para cuantificar artrópodos que habitan en el follaje

El presente protocolo describe un método para recolectar suficiente saliva de insectos perforantes-chupadores utilizando un medio artificial. Este es un método conveniente para recolectar saliva de insectos y estudiar la función salival en el comportamiento de alimentación de insectos y la transmisión de virus transmitidos por vectores.

Método sándwich de membrana de dos capas para la recolección de saliva de Laodelphax striatellus

Describimos un método para recolectar hemolinfa cuantificable de manera eficiente de artrópodos pequeños para su posterior análisis.

Un método preciso y cuantificable para recolectar hemolinfa de artrópodos pequeños

Se describen procedimientos para estudiar los comportamientos de sondeo e ingestión de mosquitos Culex tarsalis en manos humanas utilizando electropenetrografía AC-DC.

Electropenetrografía AC-DC para el estudio de los comportamientos de sondaje e ingestión de mosquitos Culex tarsalis en manos humanas

Este artículo describe un protocolo eficiente de disección imaginaria de discos y tinción de anticuerpos que es económico con los reactivos y facilita el manejo de discos imaginarios en pequeñas cantidades.

Disección a pequeña escala y tinción por anticuerpos de discos imaginales de antenas oculares y de alas de Drosophila melanogaster

Aprende técnicas de marcado proteico en artrópodos para investigar dispersión y migración de insectos usando ELISA. Este método simple permite estudiar patrones de migración y especies invasivas en hábitats naturales.

Administrar y Detección de Marcas de proteínas de Artrópodos de Dispersión de Investigación

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