Diferencias de sexo en el ratón del hipocampo después de astrocitos

El objetivo general de esta técnica es preparar cultivos enriquecidos de astrocitos hipocampales específicos por sexo a partir de ratones recién nacidos, como herramienta para estudiar los roles específicos por sexo de los astrocitos tras la privación de oxígeno y glucosa y la posterior reoxigenación, con el fin de imitar in vitro la isquemia hipóxica en un entorno de cultivo celular. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre mecanismos y traslación relacionadas con el papel específico por sexo de los astrocitos hipocampales tras la isquemia hipóxica en cerebros en desarrollo de machos y hembras. Diseque el cerebro de la cabeza de un ratón recién nacido utilizando tijeras pequeñas para realizar una incisión media de posterior a anterior a través de la piel, con el fin de exponer el cráneo.

Corte cuidadosamente la línea media del cráneo desde el cuello hasta la nariz. Utilice pinzas estériles de punta plana para separar el cráneo. Retire el bulbo raquídeo con la ayuda de pinzas curvas y coloque el cerebro restante en una cubeta de disección.

Utilizando fórceps curvos, gire el cerebro para que la superficie ventral quede hacia arriba y luego separe los hemisferios con una hoja quirúrgica estéril y afilada. Con fórceps curvos planos, retire los hemisferios cerebrales y extraiga cuidadosamente el tejido abultado del mesencéfalo y del tálamo para revelar el hipocampo, una pequeña estructura con forma de caballito de mar ubicada en el lóbulo temporal medial. Retire ambos lóbulos del hipocampo y limpie cuidadosamente las meninges y los fibroblastos de la superficie de los lóbulos tirando con fórceps finos.

Transfiera ambos lóbulos hipocampales de un solo ratón a un segundo recipiente lleno con aproximadamente 5 mililitros de HBSS y colóquelo en hielo. Pique los lóbulos aproximadamente 4 veces utilizando una cuchilla quirúrgica estéril y afilada. Use una pipeta estéril de 1 mililitro para transferir el HBSS y el tejido a un tubo cónico estéril de 50 mililitros y luego centrifugue a 300 ×g durante 5 minutos.

Después de la centrifugación, aspire el sobrenadante. Añada 3 mililitros de tripsina al 0,25 por ciento, mezcle e incube el tejido a 37 grados Celsius durante 20 minutos con agitación suave. Tras la incubación, centrifugue el tubo a 300 × g durante 5 minutos.

Después de la centrifugación, use una pipeta de vidrio estéril para aspirar cuidadosamente el sobrenadante y luego añada 10 mililitros de medio de siembra para astrocitos precalentado. Realice de 20 a 30 pasos de trituración utilizando una pipeta de vidrio pulida con llama. Tras otra centrifugación de 5 minutos a 300 × g, aspire el sobrenadante y añada 2 mililitros de medio de siembra para astrocitos.

Pase la suspensión celular a través de un filtro de malla de 70 micrones hacia un nuevo tubo cónico de 50 mililitros. Añada toda la suspensión celular a un matraz de cultivo T-25 estéril recubierto que contenga 3 mililitros de medio de siembra para astrocitos. Incube el matraz a 37 grados Celsius en una incubadora con 5% de dióxido de carbono.

Al día siguiente, observe la progresión de la confluencia astrocitaria bajo un microscopio óptico, aspire el medio y reemplácelo con 2 mililitros de medio fresco para siembra de astrocitos. Alrededor del día 11 in vitro, recolecte los astrocitos confluentes aspirando el medio y luego agregue 2 mililitros de tripsina al 0,25 %. Gire suavemente el matraz varias veces y luego aspire la tripsina utilizando una pipeta de vidrio estéril.

Añada otros 2 mililitros de tripsina al 0,25 % y deje el frasco a temperatura ambiente durante 4-5 minutos. Después de eliminar la tripsina, coloque el frasco a 37 grados Celsius en un incubador con 5 % de CO₂ durante 10 minutos. Tras la incubación, agregue 5 mililitros de medio de siembra para astrocitos y desprenda la capa astrocitaria golpeando el frasco de 3 a 4 veces.

Triture suavemente la suspensión celular a lo largo del fondo del frasco para lograr la completa desprendimiento y luego recolecte los astrocitos en un tubo cónico de 15 mililitros. Centrifugue el tubo a 300 ×g durante 5 minutos. Aspire el sobrenadante y luego agregue 1 mililitro de medio fresco para siembra de astrocitos.

Añada 10 microlitros de la suspensión celular a un hemocitómetro y utilice un microscopio invertido de contraste de fases con un objetivo de 10x para contar las células en el área central grande con cuadrícula. Diluya las células hasta aproximadamente 1 × 10⁵ células por 2 mililitros de medio de siembra para astrocitos. Pipetee 2 mililitros de la suspensión celular sobre un cubreobjetos de vidrio recubierto con poli-d-lisina en el pocillo de una placa de cultivo de 24 pocillos.

Incubar a 37 grados Celsius en un incubador con 5% de dióxido de carbono. Para iniciar la privación de oxígeno y glucosa, aspire el medio del portaobjetos que contiene astrocitos adherentes y enjuague una vez con 1 mililitro de solución OGD isotónica. Añada 0,2 mililitros de solución OGD al pocillo y colóquelo en un incubador hipóxico.

Mezcle suavemente con un agitador orbital ajustado a 50 rpm durante los primeros 30 minutos de hipoxia. Para la reoxigenación, sustituya la solución de OGD por 2 mililitros de medio de siembra de astrocitos e incube en 5 % de dióxido de carbono y aire atmosférico a 37 grados Celsius durante 5 horas. Esta imagen de inmunofluorescencia muestra la pureza del cultivo primario de astrocitos hipocampales de ratón.

El cultivo de astrocitos se inmunotincionó para mostrar el marcador de dendrita neuronal, MAP2, en rojo, y el marcador de microglía, IBA1, en verde. Los núcleos se tiñen con DAPI, que aparece azul. La flecha indica contaminación por microglía.

Esta imagen inmunofluorescente representativa de astrocitos del hipocampo cultivados en condiciones normóxicas muestra la inmunorreactividad de GFAP en rojo y la marcación de HIF1-alfa en verde. Nuevamente, los núcleos se tiñen con DAPI, que aparece en azul. La flecha indica una baja expresión de HIF1-alfa.

Después de 2 horas de privación de oxígeno y glucosa y 5 horas de reoxigenación, la expresión de HIF1-alfa aumentó en astrocitos del hipocampo cultivados, como lo indica la punta de flecha que señala la expresión nuclear elevada de HIF1-alfa. La expresión de GFAP y la expresión de S100b se reguló al alza en cultivos de astrocitos del hipocampo de ratones macho tras la privación de oxígeno y glucosa y la reoxigenación. También se observó una regulación al alza de S100b y GFAP en astrocitos obtenidos de ratones hembra.

Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como PCR cuantitativa, inmunotransferencia, ARNsi y tinciones inmunohistoquímicas para responder preguntas adicionales, como los cambios específicos por sexo en la expresión de ciertos genes y proteínas tras la isquemia in vitro. Tras su desarrollo, esta técnica puede allanar el camino para que los investigadores en el campo de las neurociencias exploren los efectos y consecuencias del accidente cerebrovascular en el hipocampo, estudiando los astrocitos en cultivo.