Name: La cuantificación de la actina filamentosa (F-actina) puntos lagrimales en las neuronas corticales de rata (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: Aprende a cuantificar F-actina en neuronas corticales de rata mediante inmunocitoquímica y microscopía de fluorescencia. Este protocolo permite evaluar la integridad sináptica y la plasticidad dendrítica en estudios de neurociencia.

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Este trabajo fue financiado por las subvenciones de los NIH DA013137, DA031604 y HD043680. El apoyo parcial fue proporcionado por una beca de capacitación T32 de los NIH en ciencias biomédicas y del comportamiento.

Todos los animales protocolos fueron revisados ​​y aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Carolina del Sur (número de aseguramiento: A3049-01). 1. baja densidad cultivos neuronales embrionarias <ol><li> Preparación para el cultivo de neuronas corticales primaria <ol><li> soluciones: <ol><li> Preparar poli-L-lisina solución madre disolviendo 5 mg de poli-L-lisina en 10 ml de tampón de borato. </li><li> Preparar la solución de trabajo diluyendo 1 ml de poli-L-lisina en 49 ml de tampón borato. </li><li> Preparar tampón borato, pH 8,4, comenzando con 395 ml de H2O destilada y luego añadir todos los ingredientes (1,24 g de ácido bórico + 1,9 g de bórax). Ajustar el pH a 8,4 con NaOH 1 M. Ajuste a 400 ml y filtrar con un filtro de membrana de nylon de 0,2 micras bajo el capó. </li><li> Preparar la solución de HBSS, pH 7,2, comenzando con 445 ml de H2O destilada y añadir todos los demás ingredientes (50 ml 10X HBSS archivo + 1,2 g de HEPES). Ajustar el pH a 7,2 por N HCl 1, bring a 500 ml y filtrar con 0,2 micras filtro de membrana de nylon bajo el capó. </li><li> Preparar medio en placa: DMEM / F12 con suero bovino fetal 10%. Filtro con 0,2 micras filtro de membrana de nylon bajo el capó. </li><li> Preparar medio de crecimiento completo: Para 50 ml de medio Neurobasal, añadir los suplementos (500 l glutamax (100X) + 500 l Glucosa + 1 ml de B-27 (50X) + 500 l de solución de antibiótico-antimicótico (100X) + 100 l 7,5% El bicarbonato de sodio. filtro con 0,2 micras filtro de membrana de nylon bajo el capó. </li></ol></li><li> Dos días antes del cultivo: <ol><li> Escudo vidrio platos de fondo doce de 35 mm con 2 ml de solución de trabajo de poli-L-lisina, y mantener bajo el capó O / N. </li></ol></li><li> Un día antes de la cultura: <ol><li> Agente de recubrimiento de vacío de los platos y enjuagar con ddH2O Permitir que los platos se sequen durante una hora bajo el capó. </li><li> Preparar medio en placa (DMEM / F12 con suero bovino fetal al 10% (10% de la solución total). Pipeta 2 ml de medio encada plato, y se incuba O / N a 37 ° C, 5% de CO 2. Nota: Es importante evitar placas de cultivo de plástico cuando se cultiva. El uso de vidrio platos de fondo (para microscopios invertidos) o cubreobjetos de vidrio (para microscopios verticales) produce imágenes nítidas y claras. En comparación con un plato de plástico de fondo, el plato de fondo de vidrio evita reflejos no deseados o el deslumbramiento durante la microscopía fluorescente. </li></ol></li></ol></li><li> Protocolo de cultivo celular: <ol><li> Pon refrigerada HBSS Buffer (100-150 ml), platos de Petri de 100 mm, pinzas, tijeras, tubos de 50 ml, 15 ml y tubos bajo la luz UV en la campana. </li><li> La eutanasia a ratas preñadas con la inhalación letal de 5% de sevoflurano bajo el capó fuera de la habitación de cultivo. </li><li> Esterilizar con un 70% de EtOH, tienda de la piel del abdomen inferior utilizando fórceps durante el corte de la cola hacia arriba en el medio de cavity.Open abdominal del útero con unas tijeras para exponer la placenta. </li><li> Retire 8-10 fetos E18. Place 8-10 fetos en placas de Petri que contienen solución de HBSS. </li><li> Mantenga la parte posterior de la cabeza del feto con una pinza, a continuación, utilizar tijeras para cortar la cabeza del cuerpo. Colocarlo en otra placa de Petri llena con 5-7 ml de HBSS. Llevar la cápsula a la campana. </li><li> Llenar dos placa de Petri de 100 mm adicional con HBSS frío. </li><li> Pelar un lado del cráneo y cerebro en primicia una nueva placa de Petri llena de HBSS. </li><li> El uso de fórceps curvos afilados, cerebelo y tronco cerebral separada del cerebro, a continuación, transferir cerebro a una nueva placa de Petri con HBSS fría en ella. </li><li> Use pinzas para sujetar, separar los hemisferios con pinzas curvas. Retire las meninges; aislar la corteza frontal y piezas de transferencia en tubos de centrífuga de 15 ml marcados. </li><li> Llenar el tubo 15 ml con 2 ml de HBSS fresco y añadir 20 l de tripsina EDTA (10x mezcla concentrada con 0,5% de tripsina y EDTA 5,3 mM.) A cada tubo de 15 ml. </li><li> Incubar 10-15 min a TA. homogeneizar suavemente el tubo cada pocos minutos, no permitirá cancelar. </li><li> after 10-15 minutos, el uso de pipetas de vidrio para eliminar edad HBSS y se enjuaga dos veces con HBSS nueva. </li><li> Sumergir en inhibidor de tripsina (1 mg / ml, 2 mg de inhibidor de tripsina en 2 ml de HBSS), mezclar bien y dejar reposar 5 minutos. Lavar dos veces con HBSS fresco. </li><li> Usando pipeta de vidrio con el bulbo de caucho, piezas cerebrales triturado en 10-15 veces muy lentamente a fin de evitar bubbles.Triturate de nuevo usando una pipeta calibrada y una punta estéril con un diámetro de la punta reduce muy lentamente hasta homogeneidad. </li><li> Transferencia disoció las células a una densidad deseada para pre-preparadas placas de cultivo recubiertas (50 células / mm2). Incubar O / N a 37 ° C, 5% de CO2. </li><li> Después de 24 horas, sustituya medio DMEM / F12 con medio libre de suero Neurobasal crecimiento completo recién hecho. </li><li> Mantener las células en todo momento en un CO2 / 95% incubador humidificado aire de la habitación 5% durante al menos 12-14 días antes de la experimentación. Suplemento las células cada 5-6 días con medio Neurobasal fresco sustitución de aproximadamente 50% de la edad media. </li></ol></li></ol> 2. Marcaje fluorescente y inmunocitoquímica Nota: El etiquetado de inmunofluorescencia de cultivos de células primarias corticales se llevó a cabo en placas de cultivo de vidrio de células de fondo 35 mm con un volumen de trabajo de 1 ml. <ol><li> Lavar el plato con fondo de vidrio dos veces con solución salina tamponada con fosfato de pH 7,4 (PBS). </li><li> Fijar las células con 4% de paraformaldehído durante 15 min a RT. </li><li> Lavar las células dos veces con PBS y se permeabilizan con 0,1% Triton X-100 en PBS durante 5 min. </li><li> Tratar las células durante 20 min a RT con una tinción específica de F-actina, AlexaFluor 488 faloidina (1:40, 25 l de faloidina en 1 ml de PBS). </li><li> Enjuagar las células dos veces con PBS y bloquear con suero de cabra normal al 10% a temperatura ambiente durante 1-2 horas. </li><li> Diluir el anticuerpo policlonal de pollo anti-MAP2 (1: 2.500) en PBS con suero normal de cabra al 2% y se incuba O / N a 4 ° C. </li><li> Después de la incubación, enjuague en PBS dos veces. </li><li> Diluir el anticuerpo secundario (Alexa Red cabra 594 conjugado con IgG anti-pollo (1: 500) con suero de cabra normal al 2% y se incuba durante 2 horas a RT. </li><li> Enjuague con PBS y añadir 10 l / placa de tinte Hoescht. </li><li> Incubar 3 min a TA y se lava con PBS dos veces. Nota: Las células marcadas ya está listo para el paso 3 (F-actina conteo de puntos lagrimales). </li><li> Preservar muestra de células con 100 l de reactivo antifade como agente de cubreobjetos y mantenerse a 4 ° C en la oscuridad durante el almacenamiento a largo plazo. Nota: faloidina es relativamente estable en PBS a 4 ° C en la oscuridad durante hasta 1 semana y la fluorescencia puede ser conservado con Antifade reactivos cubrición. Sin embargo, las imágenes óptimas se obtienen a partir de 1-3 días después de la tinción desde faloidina puede empezar a difundirse fuera con un almacenamiento prolongado. </li></ol> 3. F-actina Conteo puntos lagrimales <ol><li> Encienda el microscopio de fluorescencia y cambiar a 20 × objetivo. software de microscopio abierta, y estableció el programa de 1280 × 960 píxeles de tamaño de la imagen, y 0,1resolución de imagen / píxeles de 7 micras, con 1 × zoom. </li><li> Adquirir imágenes de co-etiquetado de actina F / neuronas MAP2 con bandera verde (495 nm) / rojo (613 nm) canales fluorescentes. </li><li> Elija 5 Green (F-actina) / rojo (MAP2) immunolabeled / azul (Hoescht) imágenes fluorescentes de neurona individual con árboles dendríticos claramente definidos. </li><li> Identificar las estructuras ricas F-actina en segundo orden segmento dendrítico (intervalo de longitudes de 25-75 micras) con inmunofluorescencia MAP2 continua. </li><li> Rotar la región seleccionada de imágenes a un nivel horizontal. Copiar y pegar como una nueva imagen. </li><li> Restar el fondo de imágenes, utilizando una serie de ajustes constantes para cada plato. </li><li> Contar el brillante F-actina puntos lagrimales verde y rastrear la longitud del segmento dendrítico seleccionada manualmente por observadores independientes entrenados. Exportar los datos a un archivo de hoja de cálculo. </li><li> Calcular la densidad dividiendo F-actina total de puntos lagrimales marcado (N) por la longitud (L) de la etiqueta MAP2 dendritas. expresas de datos como el número de F-acpuncta estaño por 10 m de dendrita Nota: puntos lagrimales (tamaño ≤1.5 m) de la fluorescencia F-actina con una intensidad máxima de al menos 50% por encima de la intensidad media de la tinción en el eje dendríticas fueron incluidos en cada segmento dendríticas seleccionado. </li></ol>

<ol><li>Heller, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biochemical+anatomy+of+cortical+inhibitory+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The biochemical anatomy of cortical inhibitory synapses.</a> PLoS One. 7, e39572(2012).</li>
<li>Craig, A. M., Blackstone, C. D., Huganir, R. L., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+clustering+of+glutamate+and+gamma-aminobutyric+acid+receptors+opposite+terminals+releasing+the+corresponding+neurotransmitters%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Selective clustering of glutamate and gamma-aminobutyric acid receptors opposite terminals releasing the corresponding neurotransmitters.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 91, 12373-12377 (1994).</li>
<li>Johnson, O. L., Ouimet, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+regulatory+role+for+actin+in+dendritic+spine+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">A regulatory role for actin in dendritic spine proliferation.</a> Brain Res. 1113, 1-9 (2006).</li>
<li>Rao, A., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+between+the+actin+cytoskeleton+and+the+postsynaptic+density+of+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Signaling between the actin cytoskeleton and the postsynaptic density of dendritic spines.</a> Hippocampus. 10 (5), 527-541 (2000).</li>
<li>Matus, A., Ackermann, M., Pehling, G., Byers, H. R., Fujiwara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+actin+concentrations+in+brain+dendritic+spines+and+postsynaptic+densities%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">High actin concentrations in brain dendritic spines and postsynaptic densities.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 79, 7590-7594 (1982).</li>
<li>Allison, D. W., Gelfand, V. I., Spector, I., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+actin+in+anchoring+postsynaptic+receptors+in+cultured+hippocampal+neurons%3A+differential+attachment+of+NMDA+versus+AMPA+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Role of actin in anchoring postsynaptic receptors in cultured hippocampal neurons: differential attachment of NMDA versus AMPA receptors.</a> J Neurosci. 18, 2423-2436 (1998).</li>
<li>Sekino, Y., Kojima, N., Shirao, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+actin+cytoskeleton+in+dendritic+spine+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochem+Int%22%5BJournal%5D)">Role of actin cytoskeleton in dendritic spine morphogenesis.</a> Neurochem Int. 51, 92-104 (2007).</li>
<li>Zhang, W., Benson, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+synapse+development+defined+by+dependence+on+F-actin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Stages of synapse development defined by dependence on F-actin.</a> J Neurosci. 21 (14), 5169-5181 (2001).</li>
<li>Bertrand, S. J., Aksenova, M. V., Mactutus, C. F., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+Tat+protein+variants%3A+Critical+role+for+the+cysteine+region+in+synaptodendritic+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">HIV-1 Tat protein variants: Critical role for the cysteine region in synaptodendritic injury.</a> Exp Neurol. 248, 228-235 (2013).</li>
<li>Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Aksenova, M. V., Espensen-Sturges, T. D., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptodendritic+recovery+following+HIV+Tat+exposure%3A+neurorestoration+by+phytoestrogens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Synaptodendritic recovery following HIV Tat exposure: neurorestoration by phytoestrogens.</a> J Neurochem. 128 (1), 140-151 (2014).</li>
<li>Lau, P. M., Zucker, R. S., Bentley, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+filopodia+by+direct+local+elevation+of+intracellular+calcium+ion+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Induction of filopodia by direct local elevation of intracellular calcium ion concentration.</a> J Cell Biol. 145, 1265-1275 (1999).</li>
</ol>

Ninguno de los autores tiene conflictos de intereses que declarar.

En este protocolo, se describe el cultivo de neuronas corticales de rata a baja densidad en placas con fondo de vidrio de 35 mm, que nos permite identificar las dendritas de las neuronas individuales. A continuación, utilizamos faloidina y tinción MAP2 para detectar cambios dendríticas. A continuación, se utilizó un software especializado para cuantificar los cambios en puntos lagrimales F-actina. Para determinar los cambios en puntos lagrimales F-actina toda la red neuronal de una neurona i...

El objetivo principal de este estudio es desarrollar un método fiable de medida (estimación) de la integridad sináptica de la red dendrítica neuronal. A continuación se describe la cuantificación de los puntos lagrimales F-actina en la rata primaria neuronas cultivadas utilizando una combinación de tinción faloidina y detección inmunocitoquímica (CPI) de las dendritas con posterior análisis utilizando software especializado (NIS-Elements). Falotoxinas etiquetados tienen afinidad similar para los filamentos tanto grandes como pequeñas (F-actina), pero no se unen a la actina monomérica globular (G-actina), a diferencia de algunos anticuerpos de actina 1. La unión no específica de faloidina es despreciable, lo que proporciona el fondo de imagen mínima durante celular. Faloidina es mucho más pequeño que los anticuerpos que normalmente se utilizan para etiquetar proteínas celulares por microscopía de fluorescencia, que permite mucho más intensa etiquetado de F-actina por faloidina. Por lo tanto, a los detalles de la localización de F-actina en neuronas pueden serobtenido mediante el uso de faloidina marcada. Faloidina (F-actina) tinción de dendritas neuronales discretas genera &quot;puntos calientes&quot; o &quot;puntos lagrimales&quot; brillante, que representan una variedad de estructuras dendríticas maduras, incluyendo las espinas, las sinapsis no espinosas 2 y espinas inmaduras. Espinas inmaduras incluyen filopodios delgadas y algunas formas de la morfología de parches, y pueden representar el inicio de espinogénesis 3. Espinas inmaduras y parches no espinosas carecen PSD95 4. Los cambios en la producción de plomo F-actina a los cambios posteriores en no sólo las espinas dendríticas, sino también estructuras adicionales, con lo que faloidina una herramienta importante para la investigación de la integridad synaptodendritic 5-7. En general, el número de puntos lagrimales faloidina-positivo (F-actina) reflejan un equilibrio entre las sinapsis activas (excitatorias e inhibitorias), la dinámica de actina y la estabilidad sinapsis 8. Aunque es importante para estudiar t específicaipos de sinapsis (es decir, espinas dorsales excitatorios), cuando se desconoce el objetivo de un tratamiento, es necesario estimar primero la integridad general de una variedad de estructuras dendríticas. Desde F-actina es un componente principal de las espinas dendríticas y otras estructuras, incluyendo las sinapsis inhibidoras, un número alterado de puntos lagrimales F-actina puede indicar un synaptopathy. Este synaptopathy puede entonces investigarse más a fondo de las alteraciones más específicas. Nuestro método de cuantificación para la detección de múltiples tipos / estructuras sinápticas se obtiene una estimación global de las alteraciones sinápticas dendríticas (aumentos y disminuciones) después de varios tratamientos experimentales.

<table><tbody><tr><td>35 mm Fondo de vidrio Platos Nº 1.5 cubreobjetos</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.5-20-C</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 medio</td><td>Life Technologies</td><td>10565-018</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lisina</td><td>Sigma</td><td>P9155</td><td></td></tr><tr><td>Ácido bórico</td><td>Sigma</td><td>B0252</td><td></td></tr><tr><td>Bórax</td><td>Sigma</td><td>B9876</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td>100X</td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>VWR</td><td>101174Y</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Sigma</td><td>H4641</td><td>10X</td></tr><tr><td>Medio Neurobasal</td><td>Life Technologies</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>B-27 suplemento</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td>50X</td></tr><tr><td>Antibiótico-Antimicótico solución</td><td>Cellgro</td><td>30004CI</td><td>100X</td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio</td><td>Life Technologies</td><td>25080</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras Vannas</td><td>World Precision Instruments</td><td>500086</td><td></td></tr><tr><td>Mundo de Tijeras de Iris</td><td>Instrumentos de precisión</td><td>500216</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas de iris</td><td>World Instrumentos de precisión</td><td>15914</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #7 Pinzas</td><td>del mundo Instrumentos de precisión</td><td>14097</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinzas</td><td>World Precision Instruments</td><td>14095</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold</td><td>Life Technologies</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos</td><td>VWR</td><td>631-0137</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 488 Phalloidin</td><td>Life Technologies</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Suero de caballo normal</td><td>Life Technologies</td><td>26050-070</td><td></td></tr><tr><td>Pollo policlonal anti-MAP2</td><td>abcam</td><td>Ab92434</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Red 594-conjugado cabra anti-pollo IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A11042</td><td></td></tr><tr><td>NucBlue Tinción de células vivas ReadyProbes Reactivo Hoescht 33342</td><td>Life Technologies</td><td>R37605</td><td></td></tr><tr><td>Paquete de software NIS-Elements</td><td>Nikon Instruments</td> Nikon Eclipse <td></td><td></td></tr><tr><td>TE2000-E microscopio fluorescente invertido controlado por ordenador&nbsp;</td><td>Instrumentos</td><td></td><td></td>Nikon</tr><tr><td>0.2 &mu; m Nalgene filtro de membrana de nailon</td><td>Fishersci</td><td>151-4020</td><td></td></tr></tbody></table>

la cuantificación de la actina filamentosa (f-actina) puntos lagrimales en las neuronas corticales de rata

Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons

proteína actina filamentosa (F-actina) juega un papel importante en espinogénesis, la plasticidad sináptica, y la estabilidad sináptica. Los cambios en las estructuras dendríticas ricas F-actina sugieren alteraciones en la integridad y la conectividad sináptica. Aquí se proporciona un protocolo detallado para el cultivo de neuronas corticales de rata primaria, tinción faloidina para puntos lagrimales F-actina, y técnicas de cuantificación posteriores. En primer lugar, la corteza frontal de embriones de rata E18 se disocia en cultivo de células de baja densidad, a continuación, las neuronas cultivadas in vitro durante al menos 12-14 días. Después del tratamiento experimental, las neuronas corticales se tiñeron con faloidina AlexaFluor 488 (para etiquetar los puntos lagrimales F-actina dendríticas) y la proteína asociada a microtúbulos 2 (MAP2, para validar las células neuronales y la integridad dendríticas). Finalmente, el software especializado se utiliza para analizar y cuantificar las dendritas neuronales seleccionados al azar. F-actina estructuras ricas están identificados en las ramas dendríticas de segundo orden (rango de longitud y 25-75# 181; m) con inmunofluorescencia MAP2 continua. El protocolo presentado aquí será un método útil para la investigación de cambios en las estructuras de la sinapsis dendríticas posteriores a los tratamientos experimentales.

En los presentes procedimientos, en primer lugar la cultura de rata neuronas corticales a baja densidad en placas con fondo de vidrio de 35 mm, la cual nos permite identificar las dendritas de las neuronas individuales. En la Figura 1, el contraste de interferencia diferencial (DIC) imágenes muestran los cambios morfológicos en el desarrollo de rata fetal neuronas corticales en los días 4, 6, 10, 14, 21 y 27 in vitro. Tenga en cuenta que la long...

La actina filamentosa (F-actina) juega un papel importante en la espinogénesis, la plasticidad sináptica y la estabilidad sináptica. Por lo tanto, la cuantificación de los puntos de F-actina es una herramienta útil para estudiar la integridad de las estructuras sinápticas. Este protocolo describe los procedimientos de cuantificación de los puntos de F-actina marcados con faloidina en cultivos de neuronas corticales primarias de baja densidad.

La cuantificación de la actina filamentosa (F-actina) puntos lagrimales en las neuronas corticales de rata

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich ...

El objetivo general de esta cuantificación de punta de actina filamentosa en neuronas cultivadas es presentar un método útil para estudiar la integridad y la funcionalidad cognitiva de las estructuras sinápticas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurociencia sobre espinogénesis, plasticidad sináptica y estabilidad sináptica. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona un protocolo detallado para el cultivo neuronal primario, seguido de la identificación y cuantificación de las puntas de actina filamentosa (F-actin).Cuando el objetivo de logro es desconocido, es necesario estimar la integridad general de las estructuras fundantricas de la ratia. Tuvimos la idea inicial de este método cuando estábamos estudiando el daño neuronal inducido por drogas de abuso como la cocaína, y proteínas tóxicas del VIH como la tat y la JP 120. Dos días antes de preparar el cultivo, recubra 12 placas de fondo de vidrio de 35 milímetros con dos mililitros de solución de trabajo de poli-L-lisina. Y almacene las placas en la cabina de flujo laminar durante la noche para mantener su esterilidad.Al día siguiente, deseche el agente de recubrimiento y enjuague los recipientes con agua doblemente destilada. Deje secar los recipientes durante una hora bajo la campana. Luego transfiera dos mililitros de medio de siembra a cada recipiente.Y incubar los cultivos durante la noche a 37 grados Celsius y cinco por ciento de dióxido de carbono. En el día del cultivo, colocar el cerebro recolectado en una placa de Petri que contenga HBSS frío. A continuación, sujetando el cerebro con pinzas, usar las pinzas curvas para separar los hemisferios y eliminar las meninges.Aisle los córtices frontales y transfiera los fragmentos a un tubo cónico estéril de 15 mililitros. Añada dos mililitros de HBSS fresco y 20 microlitros de tripsina-EDTA al tubo, e incube los tejidos nerviosos durante 10 a 15 minutos a temperatura ambiente, agitando suavemente cada pocos minutos.Al final de la incubación, utilice una pipeta de vidrio para aspirar todo el HBSS viejo. Y enjuague los córtices dos veces con HBSS fresco. Después del segundo lavado, sumerja el tejido en inhibidor de tripsina.Mezcle bien y deje reposar la muestra durante cinco minutos a temperatura ambiente. Luego lave los tejidos dos veces con HBSS fresco. Ahora use una pipeta de vidrio con una perilla de goma para triturar muy lentamente los fragmentos de cerebro de 10 a 15 veces.Luego, utilizando una pipeta calibrada equipada con una punta estéril de diámetro reducido, triturar muy lentamente la suspensión de tejido nuevamente. Cuando la solución sea homogénea, sembrar las células a la densidad adecuada en las placas de cultivo previamente recubiertas para una incubación nocturna en el incubador de cultivo celular. Después de 24 horas, sustituir el medio de siembra por medio basal estrecho completo frescamente preparado y libre de suero.Y devuelva las células al incubador de cultivo celular durante al menos 12 a 14 días. El siembra a baja densidad es importante para visualizar las neuronas individuales. Y el medio basal para neuronas es fundamental para minimizar la perforación de los astrocitos dentro de los cultivos celulares.Para etiquetar las células para inmunocitoquímica, primero lave el recipiente de cultivo celular con fondo de vidrio dos veces con PBS. Luego fije las células con paraformaldehído al cuatro por ciento durante 15 minutos a temperatura ambiente. A continuación, realice dos lavados con PBS.A continuación, permeabilice las células con Triton X-100 al 0,1 por ciento en PBS durante cinco minutos y márquelas con un colorante específico para F-actina a temperatura ambiente. Después de 20 minutos, enjuague las células dos veces con PBS y bloquee cualquier tinción no específica en la superficie celular con suero de cabra normal al 10 %. Al final de la incubación, marque las células durante la noche a cuatro grados centígrados con un anticuerpo policlonal de pollo anti-map dos.A la mañana siguiente, enjuague las células dos veces con PBS y márquelas con el anticuerpo secundario adecuado. Después de dos horas a temperatura ambiente, enjuague nuevamente las células con PBS y márquelas con 10 microlitros de huxs durante tres minutos a temperatura ambiente. Luego, lave las células dos veces más con PBS y consérvelas con 100 microlitros de reactivo antidesvanecimiento.En un plazo de tres días después de esta tinción, encienda el microscopio de fluorescencia y seleccione el objetivo de 20 X. A continuación, en el software del microscopio, configure el tamaño de imagen del píxel a 1600 por 1200 y la resolución de imagen de 0,17 micrones por píxel a un zoom de 1 X. Transfiera el cultivo de células a la platina del microscopio.Y adquiera imágenes del mapa de F-actina marcado con co en neuronas MAP2 mediante los canales fluorescentes verde y rojo. Una vez que se hayan obtenido todas las imágenes, seleccione cinco imágenes de neuronas individuales en los canales verde, rojo y azul con arborizaciones dendríticas claramente definidas. Y utilice la inmunofluorescencia continua con MAP2 para identificar las estructuras ricas en F-actina en los segmentos dendríticos de segundo orden.Gire horizontalmente la región seleccionada de las imágenes. Luego copie y pegue la región como una nueva imagen. A continuación, reste la fluorescencia de fondo de la imagen y utilice el software para contar el número de puntos brillantes verdes de F-actina.Utilice observadores independientes capacitados para medir la longitud de los segmentos dendríticos seleccionados. Luego exporte los números de puntos y los datos de longitud del segmento dendrítico a un archivo de hoja de cálculo. Asegúrese de que los observadores incluyan los puntos de postura de F-actina con una intensidad de fluorescencia rosa de al menos 50 % superior a la intensidad promedio de tinción en el eje dendrítico de cada segmento seleccionado.Finalmente, calcule la densidad según la fórmula, expresando los datos como el número de puntos de F-actina por diez micrones de dendrita. Aquí, las imágenes de contraste de interferencia diferencial muestran los cambios morfológicos observados en neuronas corticales fetales de rata en desarrollo entre los días 4 y 27 en cultivo. Observe el aumento en la longitud y el número de las dendritas a medida que las neuronas primarias de rata en cultivo maduran.Dado que la marcación con faloidina del F-actina es muy rápida, es posible estimar visualmente la integridad de la red sinapto-dendrítica antes de proceder con la marcación por inmunocitoquímica con anticuerpos. Map2 tiñe las dendritas intactas, lo que confirma que las púnticas de F-actina se localizan en las dendritas neuronales y no en otras células, como los astrocitos. En imágenes de alta resolución, pueden observarse estructuras ricas en F-actina que contienen filopodios phi, protrusiones de espinas y parches de F-actina.En este experimento para evaluar el daño sinapto-dendrítico inducido por la proteína tat del VIH-1, la tinción de Map2 reveló menos ramas dendríticas y una reducción del F-actina en neuronas corticales de rata tras el tratamiento con la proteína tat del VIH-1. De hecho, los puntos de F-actina aumentan o disminuyen en respuesta al tratamiento experimental. Por ejemplo, en este experimento, cuando las neuronas en cultivo fueron tratadas con el antagonista no competitivo del receptor NMDA, memantina, los puntos positivos para F-actina experimentaron un aumento significativo en su densidad.En contraste, el tratamiento con la combinación de metanfetamina más la proteína HIV1 tat provocó una pérdida significativa de los puntos de F-actina. Después de obtener imágenes de alta resolución de las neuronas Map2 con F-actina marcada, recuerde que dos observadores entrenados deben seleccionar segmentos de las dendritas de segundo orden para analizar las densidades de los puntos. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para los investigadores en el campo de la investigación en neurociencia.No solo para el monitoreo de la sinaptopatía aguda, sino también para el estudio de la recuperación sináptica y los procesos experimentales de restauración neural. Después de ver este video, debería tener una comprensión clara de cómo desarrollar un método confiable para medir la integridad sináptica de la red dendrítica neural.

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Este protocolo detalla la forma de cuantificar el número de sinapsis en cultivos neuronales disociadas y en las secciones del cerebro utilizando inmunocitoquímica. Utilizando anticuerpos específicos contra el compartimiento, que etiqueta los terminales presinápticos, así como los sitios de especialización post-sináptica. Se define como puntos de sinapsis de colocalización entre las señales generadas por estos marcadores.

Las sinapsis cuantificar: un ensayo basado en inmunocitoquímica para cuantificar número de sinapsis

Un método para visualizar y cuantificar la F-actina fines de púas en los conos de crecimiento neuronal se describe. Después de las neuronas de cultivo en cubreobjetos de vidrio, las células se permeabilized con una solución de saponina que contiene. A continuación, un corto de incubación con el tampón de saponina que contiene rodamina-actina incorpora actina fluorescente en los extremos de actina de púas libre.

Etiquetado de la F-actina Finaliza púas con Rodamina-actina en permeabilizadas Conos de Crecimiento Neuronal

Este video muestra el procedimiento para teñir fluorescentemente neuronas corticales de rata para microscopía. Se dirige a las proteínas F-actina y dendríticas para analizar la integridad estructural y calcular la densidad de F-actina, que es crucial para estudiar la función y la salud neuronal.

Cuantificación de actina puncta filamentosa en neuronas corticales de rata

Presentamos una solución de software para el seguimiento semi-automatizado de la concentración relativa de proteínas a lo largo de la longitud de protrusiones celulares dinámicas.

Una interfaz gráfica de usuario para el seguimiento asistido por software de la concentración de proteínas en protones dinámicos celulares

Primeras funciones de endosome dependen de polimerización de la actina F. Aquí, describimos un análisis basado en la microscopía en vitro que reconstituye la nucleación y polimerización de la actina F en membranas de endosomal temprana en tubos de ensayo, por lo que esta serie compleja de reacciones susceptibles de Bioquímica y genética manipulaciones.

In Vitro Polimerización de la F-actina en endosomas tempranos

Presentado aquí es un método de tubo de rodillo modificado para cultivo e intermitente proyección de imagen de alta resolución del cerebro de roedor rodajas durante muchas semanas con reposicionamiento preciso en photoetched cubreobjetos. Viabilidad neuronal y la morfología de la rebanada se mantienen bien. Se proporcionan aplicaciones de este sistema totalmente cerrado con virus para la expresión específica de tipo celular.

Método de tubo de rodillo modificado precisamente localizada y repetitiva imagen intermitente durante el cultivo a largo plazo de las rebanadas de cerebro en un sistema cerrado

Presentamos un protocolo para etiquetar y analizar las neuronas piramidales, que es fundamental para evaluar posibles alteraciones morfológicas en neuronas y espinas dendríticas que pueden subyacen a anomalías neuroquímicas y conductuales.

Etiquetado balístico de las neuronas piramidales en las rebanadas cerebrales y en el cultivo celular primario

Divulgamos un ensayo simple, eficiente en el tiempo y de alto rendimiento basado en espectroscopia de fluorescencia para la cuantificación de filamentos de actina en muestras biológicas ex vivo de tejidos cerebrales de roedores y sujetos humanos.

Un Ensayo Basado En Espectroscopia De Fluorescencia Eficiente En El Tiempo Para Evaluar El Estado De Polimerización De Actina En Roedores Y Tejidos Cerebrales Humanos

Se describen dos métodos relacionados para visualizar los eventos subcelulares necesarios para la transmisión sináptica. Estos protocolos permiten el monitoreo en tiempo real de la dinámica de la afluencia de calcio presináptico y la fusión de la membrana de vesícula sináptica utilizando imágenes de células vivas de neuronas cultivadas in vitro .

Medición fluorescente en tiempo real de las funciones sinápticas en modelos de esclerosis lateral amiotrófica

DetectSyn es un ensayo fluorescente rápido e imparcial que mide los cambios en el número relativo de sinapsis (compromiso pre y postsináptico) en todos los tratamientos o estados de enfermedad. Esta técnica utiliza una técnica de ligadura de proximidad que se puede utilizar tanto en neuronas cultivadas como en tejido fijo.

DetectSyn: un método fluorescente rápido e imparcial para detectar cambios en la densidad de la sinapsis

El presente protocolo describe un método para visualizar y medir anillos de actina y otros componentes del esqueleto periódico de membrana del segmento inicial del axón utilizando neuronas del hipocampo de rata cultivadas y microscopía de iluminación estructurada en 3D (3D-SIM).

Medición de las propiedades del esqueleto periódico de membrana del segmento inicial del axón mediante microscopía de iluminación estructurada en 3D (3D-SIM)

Aprende a cuantificar F-actina en neuronas corticales de rata mediante inmunocitoquímica y microscopía de fluorescencia. Este protocolo permite evaluar la integridad sináptica y la plasticidad dendrítica en estudios de neurociencia.

La cuantificación de la actina filamentosa (F-actina) puntos lagrimales en las neuronas corticales de rata

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