La cuantificación de la actina filamentosa (F-actina) puntos lagrimales en las neuronas corticales de rata

El objetivo general de esta cuantificación de punta de actina filamentosa en neuronas cultivadas es presentar un método útil para estudiar la integridad y la funcionalidad cognitiva de las estructuras sinápticas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurociencia sobre espinogénesis, plasticidad sináptica y estabilidad sináptica. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona un protocolo detallado para el cultivo neuronal primario, seguido de la identificación y cuantificación de las puntas de actina filamentosa (F-actin).

Cuando el objetivo de logro es desconocido, es necesario estimar la integridad general de las estructuras fundantricas de la ratia. Tuvimos la idea inicial de este método cuando estábamos estudiando el daño neuronal inducido por drogas de abuso como la cocaína, y proteínas tóxicas del VIH como la tat y la JP 120. Dos días antes de preparar el cultivo, recubra 12 placas de fondo de vidrio de 35 milímetros con dos mililitros de solución de trabajo de poli-L-lisina. Y almacene las placas en la cabina de flujo laminar durante la noche para mantener su esterilidad.

Al día siguiente, deseche el agente de recubrimiento y enjuague los recipientes con agua doblemente destilada. Deje secar los recipientes durante una hora bajo la campana. Luego transfiera dos mililitros de medio de siembra a cada recipiente.

Y incubar los cultivos durante la noche a 37 grados Celsius y cinco por ciento de dióxido de carbono. En el día del cultivo, colocar el cerebro recolectado en una placa de Petri que contenga HBSS frío. A continuación, sujetando el cerebro con pinzas, usar las pinzas curvas para separar los hemisferios y eliminar las meninges.

Aisle los córtices frontales y transfiera los fragmentos a un tubo cónico estéril de 15 mililitros. Añada dos mililitros de HBSS fresco y 20 microlitros de tripsina-EDTA al tubo, e incube los tejidos nerviosos durante 10 a 15 minutos a temperatura ambiente, agitando suavemente cada pocos minutos.

Al final de la incubación, utilice una pipeta de vidrio para aspirar todo el HBSS viejo. Y enjuague los córtices dos veces con HBSS fresco. Después del segundo lavado, sumerja el tejido en inhibidor de tripsina.

Mezcle bien y deje reposar la muestra durante cinco minutos a temperatura ambiente. Luego lave los tejidos dos veces con HBSS fresco. Ahora use una pipeta de vidrio con una perilla de goma para triturar muy lentamente los fragmentos de cerebro de 10 a 15 veces.

Luego, utilizando una pipeta calibrada equipada con una punta estéril de diámetro reducido, triturar muy lentamente la suspensión de tejido nuevamente. Cuando la solución sea homogénea, sembrar las células a la densidad adecuada en las placas de cultivo previamente recubiertas para una incubación nocturna en el incubador de cultivo celular. Después de 24 horas, sustituir el medio de siembra por medio basal estrecho completo frescamente preparado y libre de suero.

Y devuelva las células al incubador de cultivo celular durante al menos 12 a 14 días. El siembra a baja densidad es importante para visualizar las neuronas individuales. Y el medio basal para neuronas es fundamental para minimizar la perforación de los astrocitos dentro de los cultivos celulares.

Para etiquetar las células para inmunocitoquímica, primero lave el recipiente de cultivo celular con fondo de vidrio dos veces con PBS. Luego fije las células con paraformaldehído al cuatro por ciento durante 15 minutos a temperatura ambiente. A continuación, realice dos lavados con PBS.

A continuación, permeabilice las células con Triton X-100 al 0,1 por ciento en PBS durante cinco minutos y márquelas con un colorante específico para F-actina a temperatura ambiente. Después de 20 minutos, enjuague las células dos veces con PBS y bloquee cualquier tinción no específica en la superficie celular con suero de cabra normal al 10 %. Al final de la incubación, marque las células durante la noche a cuatro grados centígrados con un anticuerpo policlonal de pollo anti-map dos.

A la mañana siguiente, enjuague las células dos veces con PBS y márquelas con el anticuerpo secundario adecuado. Después de dos horas a temperatura ambiente, enjuague nuevamente las células con PBS y márquelas con 10 microlitros de huxs durante tres minutos a temperatura ambiente. Luego, lave las células dos veces más con PBS y consérvelas con 100 microlitros de reactivo antidesvanecimiento.

En un plazo de tres días después de esta tinción, encienda el microscopio de fluorescencia y seleccione el objetivo de 20 X. A continuación, en el software del microscopio, configure el tamaño de imagen del píxel a 1600 por 1200 y la resolución de imagen de 0,17 micrones por píxel a un zoom de 1 X. Transfiera el cultivo de células a la platina del microscopio.

Y adquiera imágenes del mapa de F-actina marcado con co en neuronas MAP2 mediante los canales fluorescentes verde y rojo. Una vez que se hayan obtenido todas las imágenes, seleccione cinco imágenes de neuronas individuales en los canales verde, rojo y azul con arborizaciones dendríticas claramente definidas. Y utilice la inmunofluorescencia continua con MAP2 para identificar las estructuras ricas en F-actina en los segmentos dendríticos de segundo orden.

Gire horizontalmente la región seleccionada de las imágenes. Luego copie y pegue la región como una nueva imagen. A continuación, reste la fluorescencia de fondo de la imagen y utilice el software para contar el número de puntos brillantes verdes de F-actina.

Utilice observadores independientes capacitados para medir la longitud de los segmentos dendríticos seleccionados. Luego exporte los números de puntos y los datos de longitud del segmento dendrítico a un archivo de hoja de cálculo. Asegúrese de que los observadores incluyan los puntos de postura de F-actina con una intensidad de fluorescencia rosa de al menos 50 % superior a la intensidad promedio de tinción en el eje dendrítico de cada segmento seleccionado.

Finalmente, calcule la densidad según la fórmula, expresando los datos como el número de puntos de F-actina por diez micrones de dendrita. Aquí, las imágenes de contraste de interferencia diferencial muestran los cambios morfológicos observados en neuronas corticales fetales de rata en desarrollo entre los días 4 y 27 en cultivo. Observe el aumento en la longitud y el número de las dendritas a medida que las neuronas primarias de rata en cultivo maduran.

Dado que la marcación con faloidina del F-actina es muy rápida, es posible estimar visualmente la integridad de la red sinapto-dendrítica antes de proceder con la marcación por inmunocitoquímica con anticuerpos. Map2 tiñe las dendritas intactas, lo que confirma que las púnticas de F-actina se localizan en las dendritas neuronales y no en otras células, como los astrocitos. En imágenes de alta resolución, pueden observarse estructuras ricas en F-actina que contienen filopodios phi, protrusiones de espinas y parches de F-actina.

En este experimento para evaluar el daño sinapto-dendrítico inducido por la proteína tat del VIH-1, la tinción de Map2 reveló menos ramas dendríticas y una reducción del F-actina en neuronas corticales de rata tras el tratamiento con la proteína tat del VIH-1. De hecho, los puntos de F-actina aumentan o disminuyen en respuesta al tratamiento experimental. Por ejemplo, en este experimento, cuando las neuronas en cultivo fueron tratadas con el antagonista no competitivo del receptor NMDA, memantina, los puntos positivos para F-actina experimentaron un aumento significativo en su densidad.

En contraste, el tratamiento con la combinación de metanfetamina más la proteína HIV1 tat provocó una pérdida significativa de los puntos de F-actina. Después de obtener imágenes de alta resolución de las neuronas Map2 con F-actina marcada, recuerde que dos observadores entrenados deben seleccionar segmentos de las dendritas de segundo orden para analizar las densidades de los puntos. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para los investigadores en el campo de la investigación en neurociencia.

No solo para el monitoreo de la sinaptopatía aguda, sino también para el estudio de la recuperación sináptica y los procesos experimentales de restauración neural. Después de ver este video, debería tener una comprensión clara de cómo desarrollar un método confiable para medir la integridad sináptica de la red dendrítica neural.