La cuantificación de la actina filamentosa (F-actina) puntos lagrimales en las neuronas corticales de rata

El objetivo general de esta cuantificación de la actina filamentosa punta en neuronas cultivadas es introducir un método útil para estudiar la integridad y la cognitividad de las estructuras sinápticas. Este método puede ayudar a abordar preguntas clave en el campo de la neurociencia sobre la espinogenisis, la plasticidad sináptica y la estabilidad sináptica. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona un protocolo detallado para el cultivo neuronal primario, siguiendo la identificación y cuantificación de los puntos de F-actina.

Cuando se desconoce el objetivo de logro, es necesario estimar la integridad general de las estructuras fundántricas de ratia. Tuvimos la idea de este método por primera vez cuando estábamos estudiando el daño neuronal inducido por drogas de abuso como la cocaína y las proteínas tóxicas para el VIH como el tat y el JP 120. Dos días antes de montar el cultivo recubría 12 platos de 35 milímetros con fondo de vidrio, con dos mililitros de solución de trabajo de poli-L lisina. Y guarde los platos en la campana durante la noche para mantener su esterilidad.

Al día siguiente, deseche el agente de recubrimiento y enjuague los platos con agua destilada doble. Deje que los platos se sequen durante una hora bajo el capó. Luego transfiera dos mililitros de medio para enchapar a cada plato.

E incubar los platos durante la noche a 37 grados centígrados y cinco por ciento de dióxido de carbono. El día del cultivo, coloque el cerebro cosechado en una placa de Petri que contenga HBSS frío. Luego, asegurando un cerebro con pinzas, use las pinzas curvas para separar los hemisferios y quitar las meninges.

Aísle las cortezas frontales y transfiera las piezas a un tubo de centrífuga estéril de 15 mililitros. Agregue dos mililitros de HBSS fresco y 20 microlitros de tripsina EDTA al tubo e incube los tejidos neurales durante 10 a 15 minutos a temperatura ambiente. Con suaves remolinos cada pocos minutos.

Al final de la incubación, use una pipeta de vidrio para aspirar todo el HBSS viejo. Y enjuague las cortezas dos veces con HBSS fresco. Después del segundo lavado, sumerja el tejido en el inhibidor de tripsina.

Mezcle bien y deje reposar la muestra durante cinco minutos a temperatura ambiente. A continuación, lave los pañuelos dos veces con HBSS fresco. Ahora use una pipeta de vidrio con una pera de goma para triturar muy lentamente las piezas del cerebro de 10 a 15 veces.

A continuación, utilizando una pipeta calibrada equipada con una punta estéril de diámetro reducido, triture muy lentamente la suspensión de tejidos. Cuando la solución sea homogénea, coloque las células a la densidad adecuada en las placas de cultivo prerrevestidas para una incubación nocturna en la incubadora de cultivo celular. Después de 24 horas, reemplace el medio de siembra con un medio basal estrecho sin suero de crecimiento completo recién preparado.

Y regrese las células a la incubadora de cultivos celulares durante al menos 12 a 14 días. El recubrimiento de baja densidad es importante para visualizar las neuronas individuales. Y el medio basal de la neurona es fundamental para minimizar la perforación de la astrocisa dentro de los cultivos celulares.

Para marcar las células para la inmunocitoquímica, primero lave el plato de cultivo celular con fondo de vidrio dos veces con PBS. A continuación, fije las células con un cuatro por ciento de paraformaldehído durante 15 minutos a temperatura ambiente. Seguido de dos lavados PBS.

A continuación, permeable las células con Triton X 100 al 0,1 por ciento en PBS durante cinco minutos y etiquételas con una tinción específica de F-actina a temperatura ambiente. Después de 20 minutos, enjuague las células dos veces con PBS y bloquee cualquier tinción inespecífica de la superficie celular con suero de cabra normal al 10%. Al final de la incubación, marque las células durante la noche a cuatro grados centígrados con el anticuerpo policlonal de pollo anti-map two.

A la mañana siguiente, enjuague las células dos veces con PBS y etiquételas con el anticuerpo secundario adecuado. Después de dos horas a temperatura ambiente, enjuague las células con PBS nuevamente y etiquételas con 10 microlitros de huxs durante tres minutos a temperatura ambiente. A continuación, lavar las células dos últimas veces con PBS y conservarlas con 100 microlitros de reactivo antidecoloración.

Dentro de los tres días posteriores a esta tinción, encienda el microscopio fluorescente y seleccione el objetivo 20 X. A continuación, en el software del microscopio, establezca el tamaño de la imagen en píxeles en 1600 por 1200 y la resolución de la imagen de 0,17 micras por píxel en un zoom de 1 X. Transfiera la placa de células a la platina del microscopio.

Y adquirir imágenes de las neuronas del mapa 2 de F-actina comarcadas bajo los canales fluorescentes verde y rojo. Cuando se hayan obtenido todas las imágenes, elija cinco imágenes de neuronas individuales en los canales verde, rojo y azul con árboles dendríticos claramente definidos. Y use la inmunofluorescencia continua del mapa dos para identificar las estructuras ricas en F-actina en los segmentos dendríticos del segundo orden.

Gire horizontalmente la región seleccionada de las imágenes. Y copie y pegue la región como una nueva imagen. A continuación, reste la fluorescencia de fondo de la imagen y utilice el software para contar el número de puntos de F-actina de color verde brillante.

Utilice observadores independientes entrenados para medir la longitud de los segmentos dendríticos seleccionados. Y luego exporte los números de puntos y los datos de longitud del segmento dendrítico a un archivo de hoja de cálculo. Asegúrese de que los observadores incluyan puntos de postura de F-actina con una intensidad de fluorescencia rosa de al menos un 50% por encima de la intensidad media de tinción en el eje dendrítico en cada segmento seleccionado.

Finalmente, calcule la densidad de acuerdo con la fórmula, expresando los datos como el número de puntos de F-actina por diez micras de dendrita. Aquí, las imágenes de contraste de interferencia diferencial demuestran los cambios morfológicos observados en las neuronas corticales fetales en desarrollo de rata a los 4 a 27 días in vitro. Obsérvese el aumento en la longitud y el número de las dendritas a medida que maduran las neuronas primarias de rata cultivadas.

Dado que el marcaje de falodina de F-actina es muy rápido, es posible estimar visualmente la integridad de la red sinapto-dendrítica antes de proceder con el marcaje inmunocitoquímico de anticuerpos. Map2 tiñe las dendritas intactas, confirmando que los puntos de F-actina se encuentran en las dendritas neuronales y no se localizan en otras células, como los astrocitos. En imágenes de alta resolución, se pueden observar estructuras ricas en F-actina que contienen phi filopodia, protuberancias de la columna vertebral y parches de F-actina.

En este experimento para evaluar la lesión sinapto-dendrítica del VIH 1, la tinción con Map2 reveló menos ramas dendríticas y una disminución de la F-actina en las neuronas corticales de rata después del tratamiento con el VIH 1 tat. De hecho, los puntos de F-actina aumentan o disminuyen en respuesta al tratamiento experimental. Por ejemplo, en este experimento, cuando las neuronas cultivadas fueron tratadas con memantina, antagonista del receptor NMDA no competitivo, los puntos positivos para F-actina experimentaron un aumento significativo en la densidad.

Por el contrario, el tratamiento con una combinación de metanfetamina más VIH1 dio lugar a una pérdida significativa de la F-actina puncta. Después de adquirir imágenes de alta resolución de las neuronas Map2 de F-actina marcadas como carbón, recuerde que dos observadores entrenados seleccionan segmentos de las dendritas del segundo orden para analizar las densidades de puntos. Tras su desarrollo, esta técnica abrió el camino a los investigadores en el campo de la investigación en neurociencias.

No solo para el seguimiento de la sinaptopatía aguda, sino también para el estudio de la recuperación sináptica y los procesos experimentales de restauración neuronal. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo desarrollar un método confiable que mida la integridad sináptica de la red dendrítica neuronal.