En Vivo Cerebral Funcional Imaging Enfoque Basado en calcio bioluminiscente Indicador GFP-aequorina
8 de enero de 2016
Aquí presentamos una novela Ca 2+ -Imagenología enfoque utilizando un reportero bioluminiscente. Este método utiliza una construcción GFP-aequorina fundida que se une a Ca 2+ y emite luz, eliminando la necesidad de excitación luz. Significativamente este método permite la proyección de imagen continua de largo, el acceso a las estructuras cerebrales profundas y alta resolución temporal.
El objetivo general de las imágenes bioluminiscentes es obtener imágenes in vivo de calcio funcional transitorio, un indicador de la actividad, durante períodos más largos y en estructuras cerebrales profundas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurobiología, como cómo se ve la actividad basal del cerebro de la mosca durante el sueño. La principal ventaja de esta técnica es que no requiere excitación con su láser.
Esto permite obtener imágenes transitorias de calcio más profundas en el tejido, y durante un período de tiempo más largo sin el fotoblanqueo y la toxicidad, en comparación con las imágenes de calcio clásicas. Este método puede proporcionar información sobre la actividad cerebral basal en drosophila, y también se puede utilizar con otros organismos modelo, como el ratón. Para comenzar, prepare la línea de interés de Drosophila melanogaster y las soluciones experimentales, como se describe en el protocolo de texto adjunto.
Luego, anestesia con hielo una sola drosophila transfiriéndola a un frasco de vidrio en hielo durante dos minutos. A continuación, mueva la mosca a una placa de Petri fría y use un par de pinzas para colocar suavemente la mosca dentro de una punta de pipeta de 1000 microlitros, recortada de modo que la punta quede en un ángulo de aproximadamente 35 grados. Con un cepillo, empuje y alinee suavemente cada mosca de modo que la cabeza pase completamente del borde de la punta y la región dorsal quede parcialmente expuesta.
A continuación, aplique el pegamento dental preparado desde la cabeza hasta el borde de la punta de la pipeta. Tenga especial cuidado para evitar la coronilla de la cabeza. El pegado de la cabeza es fundamental porque asegurarla en la posición correcta es esencial para una disección e imágenes exitosas.
Además, un mal pegado provocará una fuga de la solución de timbre y la muerte de la muestra antes de la obtención de imágenes. A continuación, coloque la punta de la pipeta, con la mosca adjunta, a través del orificio de la cámara de registro y presione suavemente para asegurarla en su lugar. A continuación, utilice un pegamento de silicona preparado para asegurar el lado plano de la cámara donde se encuentra con la punta de la pipeta para evitar fugas.
Coloque un trozo de grifo sobre el canal de profusión, el borde corto y que se extienda hasta la parte posterior de la cámara. A continuación, coloque la cámara con la mosca bajo el microscopio y encienda la lámpara fluorescente. A continuación, pipetee un mililitro de solución de timbre en la cámara.
Con un bisturí quirúrgico fino, haga incisiones paralelas desde la parte posterior de la cabeza de la mosca hasta la región antenal en ambos lados. Luego, corte a lo largo del borde del ojo y haga una incisión perpendicular por encima de la antena que conecta las incisiones anteriores. Haga una incisión final en la parte posterior de la cabeza y luego use un par de pinzas finas y afiladas para quitar la cutícula.
Agarre suavemente y limpie cualquier tejido respiratorio expuesto hasta que el cerebro y el cuerpo fluorescente del hongo se visualicen claramente. A continuación, utilice pinzas ultra afiladas para agarrar y pellizcar con cuidado el tejido del epitelio neural que cubre el cerebro para eliminarlo y permitir la permeación de la celenterazina. Con una pipeta, lave el tejido dos veces con un mililitro de solución de timbre para eliminar los restos que queden de la disección y luego coloque la muestra en una caja oscura.
A continuación, pipetee un mililitro de solución de ringer, que contiene cinco micromolares de bencil-celenterazina en la cámara. Cierre la caja e incube la muestra a temperatura ambiente durante un mínimo de dos horas. Comience por encender el microscopio de la computadora.
Además, enfríe la cámara a menos 80 grados centígrados. A continuación, configure el sistema de drenaje y ajuste los controles ambientales a 20 grados centígrados. A continuación, abra el generador de imágenes de fotones, cree una nueva carpeta y asigne un nombre a la primera grabación.
Luego, configure el sistema de profusión agregando la solución de cloruro de potasio, nicotina y ringer a sus respectivos depósitos. Ajuste el flujo para que cada solución se descargue a dos mililitros por minuto. A continuación, coloque la muestra en la montura bajo el microscopio y ajuste el aumento a 5X.
Luego, inserte el tubo de profusión en el canal a través de la punción. Ponga el microscopio en modo fluorescente y, a continuación, centre y enfoque los cuerpos de los hongos. Una vez que los cuerpos de los hongos estén enfocados, cambie el aumento a 20X.
Vuelva a centrar la imagen y ajuste el enfoque. A continuación, coloque el aparato de drenaje sobre la piscina de drenaje y ajuste la altura de la derivación de drenaje, de modo que la punta quede justo por encima de la piscina de drenaje. A continuación, enjuague la muestra con una solución de timbre durante 30 segundos para comprobar que el drenaje es adecuado.
Finalmente, tire hacia abajo del protector para sellar el aparato de cualquier luz exterior. Usando el sistema automatizado en el programa de imágenes de fotones, realice ajustes finos en el enfoque y tome una imagen fluorescente de referencia de los cuerpos de los hongos. Ajuste la velocidad del fotón a la velocidad de grabación deseada, que debe ser desde una imagen cada 50 milisegundos hasta una cada segundo o más.
A continuación, seleccione el modo de fotón y abra el obturador. A continuación, introduzca el genotipo, el sexo, la edad y el número de muestra en las entradas del registro. Ajuste la posición de los cuadros de la región de interés sobre el cáliz, los cuerpos celulares y los lóbulos mediales, haciendo clic en los cuadros y arrastrándolos a su posición mientras mantiene presionado el control.
Ahora, registre los valores de referencia durante unos cinco a 10 minutos. A continuación, encienda el interruptor para comenzar el flujo de nicotina. Al mismo tiempo, presione enter y agregue una nota para indicar que el flujo de nicotina ha comenzado.
Después de un minuto, detenga el flujo y haga otra anotación en el registro que signifique que el flujo se ha detenido. A continuación, lave la muestra con una solución de timbre durante cinco minutos. Mientras la muestra se recupera, apague el lavado, programe el temporizador durante cinco minutos adicionales y prepárese para iniciar el flujo de cloruro de potasio.
Cuando esté listo para comenzar, inicie el flujo de cloruro de potasio e ingrese 100 milimolares de cloruro de potasio "start" en el registro de muestra. Después de un minuto, detenga el flujo e ingrese el "cloruro de potasio apagado" en el registro de muestras. A continuación, lave la muestra con solución de timbre durante un minuto y cambie el microscopio al modo fluorescente.
Tome una imagen fluorescente final y luego apague la solución de timbre y extraiga la muestra. En el programa de análisis, abra el primer archivo, seleccione la pestaña "control de visualización" y haga clic en ROI. A continuación, mantenga presionada la tecla Control y seleccione una región de interés.
A continuación, ajuste el tamaño, la orientación y la forma de las ROI para abarcar el cáliz y los cuerpos celulares iluminados por GFP, y los lóbulos mediales. Una vez que se hayan agregado todas las regiones de interés, seleccione la pestaña "película" para reproducir el video de fotones. Ajuste el segundo ancho y los segundos pasos como desee.
A continuación, reajuste la ubicación del ROI según sea necesario, para que permanezca dentro de las regiones activas del vídeo. Seleccione algunas capturas de pantalla representativas de la fluorescencia de GFP, la respuesta a la nicotina y la respuesta al cloruro de potasio. A continuación, recorta las capturas de pantalla y pega las imágenes representativas en una diapositiva de presentación para su posterior análisis y comparación.
Ajusta tanto el segundo ancho como el segundo paso a la velocidad de grabación en segundos. Además, seleccione la longitud del análisis moviendo los marcadores grises en el panel superior a la región entre corchetes, antes del inicio del estímulo y justo después del final de la respuesta. A continuación, seleccione suspender vistas" mientras se reproduce, y luego presione el botón de rebobinar para restablecer la reproducción de video al principio, seguido del botón de reproducción.
Luego, seleccione el gráfico de tasa de conteo de pestañas" para ajustar las unidades y también ajustar el color de las regiones de interés, así como los colores de línea según lo desee. Una vez finalizado el análisis, seleccione exportar datos de tasa de recuento. A continuación, seleccione las grabaciones combinadas del cáliz y los cuerpos de las células, así como las de las regiones del lóbulo medial de cada lado y pegue esas imágenes en una diapositiva con las imágenes de respuesta.
Una de las formas más sencillas de estimular los cuerpos de los hongos es a través de la activación de los receptores ionotrópicos nicotínicos de acetilcolina. La respuesta típica a la nicotina de 25 micromolares, que se muestra aquí, comienza con la activación rápida tanto del cáliz como de los cuerpos celulares, y de los lóbulos mediales, y utiliza la construcción GFP-aequorin fusionada, que se une al calcio y emite luz. Generalmente, la respuesta en el cáliz y los cuerpos celulares dura más tiempo y exhibe una mayor respuesta bioluminiscente que los lóbulos, como se muestra en los paneles secuenciales de la respuesta.
En este gráfico se describe un registro de muestra de la respuesta bioluminiscente a la activación nicotínica a lo largo del tiempo, donde el número de fotones en la región de interés que contiene el cáliz y los cuerpos celulares se representa en negro, y el número de fotones dentro de la región del lóbulo medial se muestra en rojo. A partir de este gráfico, se puede determinar la longitud de la respuesta, el valor máximo del fotón durante la respuesta y el área total debajo de cada curva. Una vez dominada, la fase de preparación debe durar solo dos horas antes de la incubación, dependiendo del número de moscas.
Además, cada grabación puede completarse en tan solo veinte minutos, si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar envejecer y mantener adecuadamente el stock de moscas para garantizar la reproducibilidad entre las muestras. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar más pruebas de comportamiento para responder preguntas adicionales, como qué efecto tiene la actividad de la estructura en un comportamiento específico.
El desarrollo de esta técnica ha allanado el camino para que los investigadores en el campo de la neurobiología exploren la actividad neuronal a largo plazo en el cerebro de Drosophila. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar muestras para imágenes bioluminiscentes en el cerebro de la mosca. No olvides que la nicotina puede ser peligrosa para tu salud.
Se deben tomar precauciones como guantes al preparar soluciones o limpiar este procedimiento.
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Descripción general
Este estudio presenta una técnica novedosa de imagen bioluminiscente para la obtención de imágenes funcionales de transitorios de calcio in vivo. El método utiliza un constructo GFP-aequorina que se une al Ca2+ y emite luz, lo que permite la obtención de imágenes a largo plazo en estructuras cerebrales profundas sin necesidad de excitación con láser.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurobiología
- Imagen de calcio
- Imagen bioluminiscente
Antecedentes
- Los transitorios de calcio son indicadores de la actividad neuronal.
- Las técnicas tradicionales de imagen de calcio pueden causar fotodegradación y toxicidad.
- La obtención de imágenes de estructuras cerebrales profundas es difícil con los métodos convencionales.
- Comprender la actividad basal del cerebro es fundamental para la investigación neurobiológica.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método para la obtención de imágenes a largo plazo de los transitorios de calcio.
- Permitir la obtención de imágenes en regiones cerebrales profundas.
- Proporcionar información sobre la actividad basal del cerebro de la mosca durante el sueño.
Métodos Utilizados
- Utilización de un constructo fusionado GFP-aequorina.
- Preparación de líneas de Drosophila melanogaster para imágenes.
- Soluciones experimentales según se describen en el protocolo.
- Adquisición de imágenes in vivo sin excitación con láser.
Resultados principales
- Imágenes exitosas a largo plazo de transitorios de calcio en Drosophila.
- Capacidad para acceder a estructuras cerebrales profundas sin fotoblanqueo.
- Conocimientos sobre la actividad basal del cerebro de la mosca.
- Aplicabilidad potencial a otros organismos modelo como los ratones.
Conclusiones
- La técnica de imagen bioluminiscente ofrece ventajas significativas frente a los métodos clásicos.
- Este método puede mejorar nuestra comprensión de los procesos neurobiológicos.
- La investigación futura puede aprovechar esta técnica para diversos organismos modelo.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La imagen bioluminiscente del calcio mediante GFP-aequorina permite la obtención de imágenes funcionales a largo plazo y en tejidos profundos in vivo sin necesidad de excitación con láser, abordando limitaciones clave como el fotoblanqueo y la toxicidad presentes en las técnicas tradicionales de imagen del calcio. Este enfoque posibilita el monitoreo sostenido de la actividad neuronal en circuitos neuronales complejos, proporcionando un indicador de los estados basales y estimulados del cerebro relevantes para la neurofarmacología y la validación de dianas. El método mejora la confianza predictiva en modelos preclínicos al permitir lecturas cuantitativas y reproducibles de la dinámica del calcio durante períodos prolongados, facilitando la reducción de riesgos mecanicistas en las fases iniciales del descubrimiento.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biofármacos
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas mediante la medición de transitorios de calcio como un indicador directo de la activación neuronal en respuesta a estímulos farmacológicos.
- Valor operativo: Apoya la validación funcional de objetivos mediante imágenes sostenidas con alta resolución temporal de los flujos intracelulares de calcio en poblaciones neuronales genéticamente definidas.
- Valor predictivo: Mejora la confianza en la interacción con el objetivo y la modulación de la vía al registrar tanto los transitorios de calcio entrantes como las señales de calcio liberadas desde los almacenes a lo largo del tiempo.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Listo para ensayo: Genera sistemas biológicos transgénicos estables (por ejemplo, Drosophila, ratón) con expresión dirigida de GFP-aequorina para mediciones consistentes y reproducibles del flujo de calcio.
- Salida cuantitativa: Proporciona lecturas basadas en el conteo de fotones que permiten el análisis cinético de respuestas inducidas por agonistas, como la nicotina o el cloruro de potasio, apoyando la determinación de respuesta dependiente de la dosis y de la CE50.
- Escalabilidad: Compatible con sistemas de perfusión y plataformas automatizadas de imagen de fotones, lo que permite el cribado estandarizado de compuestos en múltiples genotipos y condiciones.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Relevancia para la enfermedad: Facilita el estudio de los circuitos de aprendizaje y memoria (por ejemplo, los cuerpos mushroom en Drosophila) en los que la señalización de calcio está implicada en la función cognitiva y en trastornos neuropsiquiátricos.
- Continuidad traslacional: Permite imágenes longitudinales desde la actividad basal hasta el desafío farmacológico y la recuperación, apoyando decisiones de avance ajustadas al riesgo en fases preclínicas.
- Reducción del riesgo mecanicista: Disminuye la ambigüedad en el mecanismo del blanco al vincular la exposición al compuesto con dinámicas de calcio cuantificables en tiempo real en tejido neural intacto.
Integración de la Línea de Producción y Flujo de Trabajo
El método se integra en los flujos de trabajo de descubrimiento temprano como una lectura funcional tras la interacción con el blanco, conectando los ensayos bioquímicos con la selección fenotípica mediante la validación basada en la actividad en tiempo real de la modulación del blanco neural.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la verificación de hipótesis y la aclaración de vías mediante la obtención de imágenes de las respuestas de calcio a neuromoduladores (por ejemplo, nicotina) en regiones cerebrales definidas, lo que permite reducir los riesgos asociados a dianas implicadas en la señalización sináptica.
- Selección: Proporciona datos cuantitativos y reproducibles sobre el flujo de calcio mediante el conteo de fotones, permitiendo comparar la eficacia y la duración del efecto de compuestos entre grupos experimentales.
- Análisis: Genera curvas de velocidad de conteo y métricas de área bajo la curva que permiten a los equipos comparar la magnitud, la cinética y la recuperación de las respuestas entre distintas condiciones, apoyando así el análisis de la relación estructura-actividad (SAR).
- Investigación Traducional: Se conecta con la continuidad preclínica al permitir la obtención de imágenes en circuitos conservados (por ejemplo, cuerpos fungiformes) implicados en respuestas conductuales, con aplicabilidad a modelos mamíferos.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma de obtención de imágenes reutilizable para estudios longitudinales, reduciendo la necesidad de preparar repetidamente modelos y apoyando la estandarización entre proyectos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Proporciona confianza predictiva en la validación de objetivos al permitir la observación directa de la actividad neuronal mediada por calcio sin artefactos de fototoxicidad o bleaching que interfieran.
- Valor operativo: Asegura la reproducibilidad y la estandarización mediante reporteros genéticamente codificados y sistemas de perfusión controlados, minimizando la variabilidad entre experimentos y laboratorios.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al proporcionar datos funcionales sostenidos y de alta resolución que reducen el descarte en fases tardías debido a efectos no anticipados en redes neuronales.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de compuestos basada en perfiles cuantitativos de respuesta al calcio, favoreciendo la eficiencia del capital en la optimización de fármacos líderes.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en sistemas genéticos modelo (por ejemplo, GAL4/UAS en Drosophila) y en biología molecular para la generación y validación de líneas transgénicas.
- Depende de la infraestructura para detección de fotones, incluyendo cámaras refrigeradas (-80°C), detectores de fotones y sistemas de perfusión para el intercambio de soluciones.
- Necesita la estandarización de la carga de coelenteracina, tiempos de incubación y protocolos de grabación de la línea base para asegurar la comparabilidad entre muestras.
- Implica consideraciones de adaptación al transferir el método entre especies (por ejemplo, ratón frente a mosca) debido a diferencias en la penetración de la barrera hematoencefálica y la entrega de cofactores.
- Las limitaciones prácticas incluyen la necesidad de condiciones de oscuridad durante la detección de fotones y el manejo cuidadoso de la coelenteracina, que es sensible a la luz y requiere preparación fresca.
