Alta resolución Cuantificación de celulosa cristalina acumulación en Arabidopsis Las raíces para monitorear la célula específica de tejido de pared Modificaciones

El objetivo general de esta preparación anatómica de la sección transversal es cuantificar la acumulación relativa de cristales y celulosa a la resolución celular, lo que permite comparaciones directas entre los diferentes tejidos de la raíz primaria de Arabidopsis. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la fisiología y el desarrollo de las plantas, como la forma en que la composición celular de un determinado tipo de célula incide en el crecimiento de un órgano completo. Después de esterilizar la semilla de Arabidopsis de acuerdo con el protocolo de texto, extienda las semillas estériles en platos que contengan 0,8% de agar vegetal y 0,5XM de medio.

Con parafilm envuelva las placas y cúbralas con papel de aluminio. Guarde las placas a 4 grados centígrados durante uno a cuatro días para promover una germinación uniforme. A continuación, transfiera las placas a una cámara de crecimiento adecuada para el cultivo de plántulas de Arabidopsis, orientando las placas verticalmente para mantener el crecimiento de las raíces sobre el medio de agar. Prepare la solución de Richardson según el protocolo de texto: Filtre a través de una unidad de filtro PVD de 0,22 micras accionada por jeringa antes de usar.

A continuación, bajo una cubierta química, prepare 50 mililitros de fijador combinando 38 ml de cacodilato de sodio 0,5M con 2,5 ml de glutaraldehído. A continuación, añada 100 microlitros de la solución de Richardson a la solución de fijación para generar la solución de fijación final. Use una placa premarcada, luego coloque de 2 a 3 ml de solución de fijación final en los pocillos para que la solución cubra completamente las plántulas.

Con pinzas de plástico, transfiera con cuidado hasta 10 plántulas a cada pozo. Use parafilm para sellar las placas antes de almacenarlas en la oscuridad a 4 grados centígrados durante al menos una noche y hasta una semana. Para deshidratar las plántulas fijas, use pinzas para recoger las plantas por su y transferirlas a los pozos de las nuevas placas de seis pocillos marcadas que contienen concentraciones crecientes de etanol para los tiempos enumerados aquí.

Prepare el medio de infiltración en una pequeña botella de vidrio mezclando el contenido de una bolsa de Historesin Activator con 50 ml de resina básica líquida. Inserte un imán y revuelva la solución en la placa para revolver durante 20 minutos. Llene los pocillos etiquetados de una placa de seis pocillos con 2 a 3 ml de medio de infiltración.

Luego, cuando las plántulas estén completamente deshidratadas, use pinzas para transferirlas de la solución de etanol al 95% al medio de infiltración, asegurándose de que estén completamente cubiertas por el medio. Almacene las muestras a 4 grados centígrados durante al menos cuatro días para garantizar la máxima penetración en los tejidos vegetales. Para preparar los bloques, coloque pequeñas etiquetas a lápiz marcadas con el nombre de la muestra dentro de cada pozo incrustando moldes.

Prepare el medio de inclusión añadiendo 1 ml de endurecedor a 15 ml de medio de infiltración. Con unos 200 microlitros de medio de inclusión, llene la mitad de cada pocillo en el molde. Y use un trozo de película superior para cubrir el molde con 1 ml adicional en cada lado.

Incubar los moldes a temperatura ambiente durante al menos dos horas para permitir la polimerización parcial. A continuación, prepare un lote adicional de medio de inclusión y manténgalo encendido para evitar la polimerización mientras se colocan las puntas de las raíces en el molde. Agregue el medio de inclusión en un plato pequeño y coloque una plántula en un mediano.

Bajo un telescopio de disección, use un bisturí para cortar cada punta de la raíz, luego colóquela con mucho cuidado en el molde a unos 2 a 3 mm de distancia de la periferia del molde, ya sea verticalmente para secciones de transferencia u horizontalmente para secciones longitudinales. Después de organizar el pañuelo, use medio de inclusión para llenar el molde por completo y cúbralo con una película superior. Luego incubar a temperatura ambiente durante un mínimo de dos horas: Para secar los bloques, colóquelos en un desecador con gel de sílice seco y déjelos a temperatura ambiente durante la noche.

Usando un fabricante de cuchillos equipado con una herramienta de marcado de diamante, prepare cuchillos de vidrio a partir de varillas de vidrio, cortando el camino de vidrio en un cuadrado y luego cortando el cuadrado en diagonal para producir dos cuchillos. Verifique que ambos cuchillos tengan bordes afilados. Monte un bloque en un soporte.

Luego, con una cuchilla industrial de un solo filo, retire el exceso de material del bloque hasta un mm de la punta de la raíz para obtener una forma piramidal. Divida el bloque con forma en rodajas de 2 a 3 micras de ancho y transfiera las rebanadas a un portaobjetos de vidrio marcado. Luego agregue gotas de agua en las rodajas.

Es importante preparar secciones que sean uniformes en anchura para minimizar la variabilidad de los datos analizados. Coloque los portaobjetos de vidrio sobre los bloques de calor a fuego lento hasta que el agua se evapore. Para preparar los portaobjetos para su visualización bajo un microscopio polarizado, diluya la solución de Richardson hasta el 2% de la solución original y use aproximadamente 1 ml para cubrir las rodajas.

A continuación, coloque las muestras en el bloque de calor durante 5 segundos y utilice agua destilada para lavarlas. Después de secar los portaobjetos en la placa calefactora, observe las rodajas bajo un microscopio de disección y use un marcador para marcar la parte posterior de un portaobjetos para indicar la posición de las rodajas de interés. Agregue 100 microlitros de medio de montaje antes de cubrir con el cubreobjetos.

Imagen y análisis según el protocolo de texto. Aquí se muestra una sección transversal de la raíz primaria de Arabidopsis con organización radial de sus células y tejidos constituyentes, incluidas las células no ciliadas, las células ciliadas y la corteza. Esta imagen confocal muestra la expresión de BRI1-GFP en células no ciliadas en un fondo mutante BRI1 que inhibe la expansión unidireccional de las células vecinas y el crecimiento de la raíz completa.

Como se observa aquí, las secciones longitudinales de las raíces obtenidas del tipo silvestre y de las líneas que expresan BRI1 en células no ciliadas mostraron una orientación similar de las microfibrillas de celulosa con una alta variabilidad de ángulos presentes en las células meristemáticas en comparación con las células de la zona de transición. Esto permite comparar la acumulación relativa de cristal en celulosa en las correspondientes células merismáticas y elongadas de los dos fondos genéticos, como se muestra aquí en secciones transversales, y revela una correlación entre la expresión de BRI1 en células no ciliadas y una alta acumulación local de cristal en celulosa. Por lo general, en los videos nuevos en este método tendrán dificultades porque es un desafío obtener raíces bien orientadas durante el procedimiento de incrustación.

Por lo tanto, se deben preparar varios bloques para el seccionamiento. Una vez dominado, se puede hacer una sola sección de bloque en 2 a 3 horas. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que la acumulación de cristal en la celulosa es comparable entre las células si tienen una orientación similar de sus microfibrillas de celulosa, según lo determinado por las secciones longitudinales.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo arreglar las plántulas de Arabidopsis y cómo incrustarlas en bloques y cómo preparar secciones transversales de raíces longitudinales y transversales. También debe tener una buena idea de los datos que se pueden obtener mediante el uso de microscopía de luz polarizada.