Name: Alta resolución Cuantificación de celulosa cristalina acumulación en Arabidopsis Las raíces para monitorear la célula específica de tejido de pared Modificaciones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: Aprende a cuantificar celulosa cristalina en raíces de Arabidopsis con resolución celular usando luz polarizada. Este método permite comparar composición de paredes celulares entre tejidos y estudiar crecimiento de órganos.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Agradecemos a la Dra. M. Rosenberg por sus consejos y ayuda con el corte anatómico. También agradecemos a D. Eisler su asistencia técnica. Esta investigación fue apoyada por subvenciones de FP7-PEOPLE-IRG-2008, Binacional de Investigación y Desarrollo Agrícola (BARD; IS-4246-09), y la Fundación Israelí para la Ciencia (ISF; 592/13).

1. Crecimiento de las Plantas <ol><li> Superficie esterilizar semillas. <ol><li> Esterilizar semillas (hasta 30 mg) por el método húmedo o seco. Como ejemplo, para el método de esterilización en seco, añadir 1 ml glacial HCl 37% en 50 ml de lejía, en un vaso de vidrio en un desecador cerrado durante al menos 4 horas y hasta durante la noche. Realice este paso en una campana química. </li></ol></li><li> Esparcir las semillas estériles en placas con agar planta de 0,8% en 0.5x Murashige y Skoog (MS). Envolver las placas con Parafilm o cinta porosa y cubrir con papel de aluminio. </li><li> Almacenar las placas a 4 ° C durante 1 - 4 días para promover la germinación uniforme. </li><li> La transferencia de las placas a una cámara de crecimiento adecuado para el cultivo de plantas de semillero de Arabidopsis. Colocar las placas verticalmente para mantener el crecimiento de la raíz en la parte superior del medio de agar y para evitar la penetración. </li><li> plántulas de transferencia de fijador de 7 días después de la germinación (DAG). </li></ol> 2. Fijación <ol><li> Preparar 50 ml Richardson Solution combinando volúmenes iguales de bórax al 1% (agente tampón), 1% y azul de metileno al 1% Azure (colorantes histológicos) en agua doblemente destilada. Se filtra a través de una jeringa Driven 0,22 micras Unidad de PVDF filtro antes de su uso. </li><li> Preparar 50 ml de fijador: 1,25% de glutaraldehído en cacodilato de sodio 0,05 M (agente tampón). Nota: Estos materiales son tóxicos y deben manejarse en una campana química. </li><li> Añadir 100 l de solución de Richardson (véase 2.1) a la solución de fijación (véase 2.2) para obtener la solución de fijación final. </li><li> Marque cada pocillo de una placa de 6 pocillos con el nombre de la muestra correspondiente. </li><li> Coloque 2 - 3 ml de solución de fijación final (véase 2.3) en los pocillos, de modo que las plantas de semillero, una vez transferidos, serán íntegramente en el líquido. </li><li> Transferir cuidadosamente, utilizando pinzas, hasta 10 plantas de semillero a cada pocillo. Sellar las placas utilizando Parafilm. Almacenar a 4 ° C, en la oscuridad, por lo menos durante una noche, y hasta una semana. </li></ol> 3. La deshidratación <ol> &lt;li&gt; Deshidratar plántulas. Transferirlos entre pozos de nuevas placas de 6 pocillos, que contiene concentraciones crecientes de etanol, que se enumeran aquí: 10% de etanol durante 15 min; 30% de etanol durante 15 min; 50% de etanol durante 15 min; 70% de etanol durante 15 min; 85% de etanol durante 15 min; 95% de etanol durante 15 min; 95% de etanol a 4 ° C, durante la noche, como mínimo. Manejar plántulas agarrando cuidadosamente por sus cotiledones, preferible con unas pinzas de plástico. </li></ol> 4. infiltración <ol><li> Preparar medio de infiltración. Mezclar el contenido de la bolsa 1 del activador del kit Historesin con 50 kit líquido de resina básica ml en una pequeña botella de vidrio. Agitar con el imán durante 20 minutos. medio de la infiltración puede mantenerse a 4 ° C durante unas semanas. </li><li> Marcar cada pocillo de una nueva placa de 6 pocillos con el nombre de la muestra correspondiente y se llenan de 2 - 3 ml de medio de infiltración. </li><li> Transferencia de las plántulas de la solución de etanol al 95% al ​​medio de infiltración usando fórceps. Asegúrese de que las plántulas son fuLLY cubierto por el medio. </li><li> Almacenar a 4 ° C durante al menos 4 días, para asegurar la máxima penetración en los tejidos de la planta. </li></ol> 5. Bloque de Preparación <ol><li> Coloque pequeñas etiquetas, lápiz, marcado con el nombre de la muestra, dentro de cada pocillo de la incrustación de moldes. </li><li> Preparar el medio de inclusión mediante la adición de endurecedor 1 ml a 15 ml de medio de infiltración (véase 4.1). No intente preparar un menor volumen de 15 ml, para evitar problemas de polimerización. </li><li> Llene la mitad de cada pocillo en el molde con 200 l medio de inclusión y cubrir con una pieza de película encima de la cabeza de corte a la forma del molde, pero a un tamaño de 1 mm más grande en cada lado. Incubar a temperatura ambiente durante al menos 2 horas, para permitir la polimerización. No exceda de 5 horas. </li><li> Preparar un lote adicional de medio de inclusión (véase 5.2) y mantener en hielo, para evitar la polimerización mientras puntas de las raíces están dispuestos en el molde. </li><li> Cortar cada punta de la raíz bajo un microscopio de disección usando bisturí y posicionar con mucho cuidado it: verticalmente para las secciones transversales u horizontalmente para la sección longitudinal, en alrededor de 2 - 3 mm desde la periferia del molde. Llenar el molde por completo con la solución y la tapa de bloqueo con una película por encima. Tenga en cuenta que la solución de bloqueo se reducirá ligeramente una vez que se polimeriza. </li><li> Mantener a temperatura ambiente durante 2 horas, como mínimo. </li><li> Para secar los bloques, colocar en una caja con gel de sílice seca y dejar a temperatura ambiente durante la noche, como mínimo. </li></ol> 6. Seccionamiento <ol><li> Preparar cuchillas de vidrio a partir de varillas de vidrio con un fabricante de cuchillos. Utilice las cuchillas de vidrio para seccionar los tejidos. Cortar la varilla de vidrio en un cuadrado y luego se corta en diagonal la plaza para producir dos cuchillos, utilizando una herramienta de puntuación de diamantes. </li><li> Bloqueo de los tramos en 2 - 3 micras rodajas de ancho, utilizando una máquina de corte. Coloque las rebanadas sobre un portaobjetos de vidrio, en la parte superior de las gotas de agua destilada y colocar la placa en un bloque de calor ajustado a fuego lento (50 - 60 ° C), hasta que el agua se evapora. </li></ol><ol><li> Diluir solución Richardson (ver 2.1) a 0.2% de la solución original y el uso de 1 ml de la misma para cubrir las rebanadas. Colocar en el bloque de calor durante 5 segundos y luego lavar con agua destilada. </li><li> Secar el portaobjetos en una placa caliente. Observe bajo un microscopio de disección y marcar la parte de atrás de la corredera con un marcador, para indicar la posición de las rebanadas de interés, para facilitar su posterior identificación en el microscopio. </li><li> Añadir 100 l de medio de montaje y cubierta con una hoja de la cubierta. </li></ol> 8. Adquisición de imágenes <ol><li> Colocar el portaobjetos cubierto que contiene las secciones de raíces bajo un microscopio de luz equipado con sistema de Polscope adecuado para obtener información de retardancia y un filtro polarizador / interferencia óptica (Figura 1 AD). </li><li> Seleccionar ampliación que permite una visualización clara de toda la muestra (por ejemplo, 40X en este estudio) y enfocar la microscope en un campo vacío que contiene sección de bloque, pero ninguna sección de la raíz. Tratar de encontrar una región limpia, sin manchas. Utilice esta región para establecer el fondo. </li><li> Ajuste el sistema de formación de imágenes y parámetros del software: Rango de Ajuste a 17 nm. Aplicar &quot;exposición automática&quot; y obtener una imagen de fondo del campo vacío (véase 8.2). Una imagen de fondo se utiliza por experimento. </li></ol> 9. Análisis Polscope de celulosa microfibrillas Orientación <ol><li> El análisis de secciones longitudinales. <ol><li> Colocar un portaobjetos que contiene secciones longitudinales bajo el microscopio y obtener una imagen de retardancia de la misma. Enfocar el microscopio en una sección de la raíz de interés. Proporcionar un nuevo nombre de archivo. </li><li> Capturar una imagen abrio (imagen con información de retraso) a través de la ventana &quot;Live Abrio&quot;. Asegúrese de capturar una sección que incluye la pared celular, que puede ser identificado por la celulosa manchada corriendo a lo largo de la periferia de la célula, como se muestra en la Figura 2C.</li></ol></li><li> Análisis de imagen. <ol><li> Haga doble clic en la imagen correspondiente en la pila de imagen. Seleccione &quot;Color de Orientación Pseudo&quot; en la pestaña &quot;Configuración de pantalla&quot;. </li><li> Para estimar el ángulo de microfibrillas de celulosa, juego con el color correspondiente de la pared celular a la de la rueda de color. NOTA: La rueda de color en la figura 2C refleja el eje lento de la luz situada a lo largo del microfibrillas que indica la dirección a lo largo del eje longitudinal de las microfibrillas. El ángulo de microfibrillas de celulosa es el ángulo indicado por el color y el eje longitudinal de la célula. Por ejemplo, la célula de alargamiento en el recuadro muestra de color cian, inclinado aproximadamente 90 ° con respecto al eje longitudinal de las células. </li><li> Para cuantificar el ángulo medio de microfibrillas en la pared celular, utilizar la herramienta de &quot;retardo de acimut y sello&quot; de la barra de herramientas del software. Durante la selección de la herramienta, apuntar y hacer clic en la región de interés en la imagen obtenida. NOTA: Este Will resultado en la pantalla de los ángulos (azimut) en grados (Figura 2C). </li><li> En un acceso abierto y el software de análisis de imágenes de luz polarizada alternativa, el almuerzo plug-in &quot;Pol-Analizador&quot; en el menú de plugins. En la nueva ventana que se abre, seleccione la ficha &quot;birrefringencia&quot; y abra y guarde el archivo de fondo y el archivo de imagen. </li><li> En la ventana de la imagen, seleccione &quot;Especificaciones&quot;. y ajustar el &quot;tamaño de píxel de ROI (uso de 5 píxeles para este estudio). En el &quot;Especificaciones&quot;. ventana, seleccione &quot;valores muestran en Tabla de resultados&quot;. </li><li> Usar la herramienta Polígono para marcar la región de interés en la ventana de imagen. Seleccione &quot;líneas de orientación&quot; para obtener la orientación de la microfibrillas de celulosa. NOTA: Esto dará lugar a la visualización de los ángulos (azimut) en grados. NOTA: El ángulo promedio calculado por uno de los dos métodos se debe entonces normalizó a la colocación de la sección de la raíz a lo largo de la corredera. Para corregir la desviación deel posicionamiento horizontal de toda la sección de la raíz a lo largo de la corredera, cuantificar el ángulo medio de microfibrillas de la pared celular que flanquean la célula a lo largo de su eje largo (es decir, perpendicular a la sección y a lo largo del eje de crecimiento de la raíz, la Figura 2C). Este ángulo es de 180 °, cuando la sección de la raíz se posiciona con precisión a lo largo de la corredera. Para el cálculo del ángulo de microfibrillas, restar el ángulo de microfibrillas medio medido de la pared celular de flanqueo a partir de 180 °. Añadir la diferencia dado lugar al ángulo de microfibrillas media medida de la pared celular que se encuentra plana en la diapositiva. </li></ol></li></ol> 10. Análisis Polscope de celulosa cristalina Acumulación <ol><li> Utilice las secciones transversales (cross). Tenga en cuenta que la acumulación de celulosa cristalina sólo puede compararse entre las células cuando sus microfibrillas de celulosa están alineados en un ángulo similar (como se determina en 9). </li><li> Haga doble clic en la imagen correspondiente en la pila de imagen. Seleccione &quot;PSeudo de color &quot;en la pestaña&quot; Configuración de pantalla &quot;. </li><li> Para medir el retardo de la. Zoom en la imagen. Seleccione &quot;Región&quot; y marcar todas las regiones de interés. Mover a la pestaña &quot;medidas&quot; y &quot;Copiar al portapapeles&quot; todos los valores. <ol><li> Transferir los datos a Excel y extraer la información requerida (media de retraso de la región). Normalizar los datos. NOTA: Para tener en cuenta las diferencias de espesor entre las rebanadas, expresa los valores relativos a un borde de la pared celular específico en la diapositiva. Para normalizar, dividir el retardo de la media correspondiente a la pared de célula de interés por el retardo de la media de una pared celular diferente en la misma imagen. Por ejemplo, la pared celular epidérmica exterior se normalizó a la pared celular cortical interior en nuestro estudio. </li></ol></li><li> Repetir las mediciones para al menos 3 secciones por la raíz, con un mínimo de 3 raíces por muestra. </li></ol>

<ol><li>Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+the+plant+cell+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Growth of the plant cell wall.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6, 850-861 (2005).</li>
<li>Wolf, S., Hematy, K., Hofte, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+control+and+cell+wall+signaling+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Growth control and cell wall signaling in plants.</a> Annu Rev Plant Biol. 63, 381-407 (2012).</li>
<li>Mazeau, K., Heux, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Dynamics+Simulations+of+Bulk+Native+Crystalline+and+Amorphous+Structures+of+Cellulose%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+B%22%5BJournal%5D)">Molecular Dynamics Simulations of Bulk Native Crystalline and Amorphous Structures of Cellulose.</a> J. Phys. Chem. B. 107, 2394-2403 (2003).</li>
<li>Zhao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+cellulose+fiber+structure+by+SEM%2C+XRD%2C+NMR+and+acid+hydrolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr+Polym%22%5BJournal%5D)">Studying cellulose fiber structure by SEM, XRD, NMR and acid hydrolysis.</a> Carbohydr Polym. 68, 235-241 (2007).</li>
<li>Fujita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+microtubules+optimize+cell-wall+crystallinity+to+drive+unidirectional+growth+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Cortical microtubules optimize cell-wall crystallinity to drive unidirectional growth in Arabidopsis.</a> Plant J. 66, 915-928 (2011).</li>
<li>Peng, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fractional+separation+and+structural+features+of+hemicelluloses+from+sweet+sorghum+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Bioresources%22%5BJournal%5D)">Fractional separation and structural features of hemicelluloses from sweet sorghum leaves.</a> Bioresources. 7, (2012).</li>
<li>Xu, S. L., Rahman, A., Baskin, T. I., Kieber, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+leucine-rich+repeat+receptor+kinases+mediate+signaling%2C+linking+cell+wall+biosynthesis+and+ACC+synthase+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Two leucine-rich repeat receptor kinases mediate signaling, linking cell wall biosynthesis and ACC synthase in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 20, 3065-3079 (2008).</li>
<li>Anderson, C. T., Carroll, A., Akhmetova, L., Somerville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-Time+Imaging+of+Cellulose+Reorientation+during+Cell+Wall+Expansion+in+Arabidopsis+Roots%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Real-Time Imaging of Cellulose Reorientation during Cell Wall Expansion in Arabidopsis Roots.</a> Plant Physiol. 152, 787-796 (2010).</li>
<li>Baskin, T. I., Beemster, G. T., Judy-March, J. E., Marga, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disorganization+of+cortical+microtubules+stimulates+tangential+expansion+and+reduces+the+uniformity+of+cellulose+microfibril+alignment+among+cells+in+the+root+of+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Disorganization of cortical microtubules stimulates tangential expansion and reduces the uniformity of cellulose microfibril alignment among cells in the root of Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 135, 2279-2290 (2004).</li>
<li>Iyer, K. R. K., Neelakantan, P., Radhakrishnan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Birefringence+of+native+cellulosic+fibers.+I.+Untreated+cotton+and+ramie%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Polym.+Sci.+A-2%3A+Polymer+Physics%22%5BJournal%5D)">Birefringence of native cellulosic fibers. I. Untreated cotton and ramie.</a> J. Polym. Sci. A-2: Polymer Physics. 6, 1747-1758 (1968).</li>
<li>Abraham, Y., Elbaum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+microfibril+angle+in+secondary+cell+walls+at+subcellular+resolution+by+means+of+polarized+light+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">Quantification of microfibril angle in secondary cell walls at subcellular resolution by means of polarized light microscopy.</a> New Phytol. 197, 1012-1019 (2013).</li>
<li>Petricka, J. J., Winter, C. M., Benfey, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+Arabidopsis+root+development%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Control of Arabidopsis root development.</a> Annu Rev Plant Biol. 63, 563-590 (2012).</li>
<li>Vanstraelen, M., Benkova, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormonal+Interactions+in+the+Regulation+of+Plant+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Hormonal Interactions in the Regulation of Plant Development.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. , (2012).</li>
<li>Singh, A. P., Savaldi-Goldstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+control%3A+brassinosteroid+activity+gets+context%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Bot%22%5BJournal%5D)">Growth control: brassinosteroid activity gets context.</a> J Exp Bot. 66, 1123-1132 (2015).</li>
<li>Fridman, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Root+growth+is+modulated+by+differential+hormonal+sensitivity+in+neighboring+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Root growth is modulated by differential hormonal sensitivity in neighboring cells.</a> Genes Dev. 28, 912-920 (2014).</li>
<li>Vragovic, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translatome+analyses+capture+of+opposing+tissue-specific+brassinosteroid+signals+orchestrating+root+meristem+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Translatome analyses capture of opposing tissue-specific brassinosteroid signals orchestrating root meristem differentiation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112, 923-928 (2015).</li>
<li>Hacham, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brassinosteroid+perception+in+the+epidermis+controls+root+meristem+size%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Brassinosteroid perception in the epidermis controls root meristem size.</a> Development. 138, 839-848 (2011).</li>
<li>Gu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+cellulose+synthase-associated+protein+required+for+cellulose+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Identification of a cellulose synthase-associated protein required for cellulose biosynthesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 12866-12871 (2010).</li>
<li>Fendrych, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmed+cell+death+controlled+by+ANAC033%2FSOMBRERO+determines+root+cap+organ+size+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Programmed cell death controlled by ANAC033/SOMBRERO determines root cap organ size in Arabidopsis.</a> Curr Biol. 24, 931-940 (2014).</li>
</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses.

A continuación, presentamos un método para la determinación de la acumulación de celulosa cristalina en los diferentes tejidos que componen las raíces de Arabidopsis, mientras que el mantenimiento de información anatómica. Como tal, proporciona un paso adicional hacia la comprensión de los procesos de crecimiento de las plantas con resolución celular. Este método también se puede aplicar para el estudio de especies y órganos de las plantas adicionales. Un número de puntos debe ser c...

La pared celular vegetal es una estructura dinámica. las células que crecen están rodeados por una pared celular primaria, la organización de la que permite que las células se expanden. Las células que dejan de crecer depósito una pared secundaria más rígido que mejora el soporte mecánico de la planta. Ambas paredes celulares están compuestas de microfibrillas de celulosa incrustadas en una matriz de polisacáridos de diferentes estructuras (por ejemplo, hemicelulosa y pectina) que varían en los diferentes tejidos etapa de desarrollo y 1,2. La celulosa se sintetiza como cadenas de (1,4) -β-D-glucano que están estrechamente alineadas para formar la microfibrillas de una estructura cristalina. celulosa amorfa se refiere a las regiones en las que las cadenas de glucano están menos ordenadas. La relación entre el cristalino y los dominios amorfos es un parámetro cree que afecta a las propiedades mecánicas de la pared celular, proporcionando resistencia mecánica y característica viscoelástica, respectivamente 3. Varios métodos han sidodesarrollado para detectar y cuantificar las dos formas de disposición de celulosa, entre ellos de difracción de rayos X y polarización cruzada / ángulo mágico de giro de RMN de estado sólido 4. Difracción de rayos X se puede usar para determinar la proporción de cristalino frente a dominios celulosa amorfa en la muestra 5. Un método alternativo utiliza fraccionamiento del contenido de la pared celular en el material ácido insoluble y soluble en ácido, para distinguir entre el cristalino y celulosa amorfa u otros polímeros, respectivamente. En este enfoque, la incorporación de glucosa marcada ([14 C] glucosa) se utiliza para cuantificar el 6,7 celulosa. Estos métodos requieren grandes volúmenes de material de la planta para los análisis de órganos enteros, en el mejor, y por lo tanto, son insuficientemente sensibles a la variación específica de tejido en la estructura de la pared celular. Visualización de microfibrillas de celulosa en una resolución celular se puede lograr en los estudios de imagen en vivo en combinación con colorantes fluorescentes 8,9, que puede identificar cambios enla orientación de las microfibrillas de celulosa. Sin embargo, estos tintes no son utilizados para la cuantificación, que no son específicos de celulosa cristalina y pueden interferir con la estructura normal de la pared celular 8. Polscope es una técnica que se basa en la capacidad de celulosa cristalina para dividir los rayos de luz y retardar parte de la luz 10. retraso de luz es más fuerte para microfibrillas que se encuentran perpendicularmente a la dirección de propagación de la luz. Para microfibrillas con orientación similar, cuanto mayor sea el grado de cristalinidad, mayor será el retardo de la luz 11. Por lo tanto, polscope se utiliza para estudiar tanto los niveles relativos y la orientación de las microfibrillas de celulosa. Roots exhiben crecimiento lineal, durante el cual las células se origina en el nicho de células madre, en la punta de la raíz, someterse a una serie de divisiones celulares, antes de que rápidamente se expanden 12. Las células que comprenden la raíz se expanden en un unidireccional (anisotrópica)forma, según lo dictado por pequeñas moléculas de señalización de hormonas que afectan a las propiedades de la pared celular 13. Respuestas diferenciales a las hormonas, en tiempo y espacio, proporcionan un medio para asegurar el crecimiento equilibrado de órganos 14. Por lo tanto, el análisis de alta resolución de la estructura de la pared celular puede proporcionar información importante necesaria para entender mejor la conexión entre las respuestas de tipo específico de células para el crecimiento de órganos conjunto. Aquí, se presenta la implementación de polscope para estudiar la acumulación específica de tejido de celulosa cristalina en las raíces de Arabidopsis, como se observa en las secciones anatómicas de alta calidad. Este método no cubierto recientemente específica del tipo celular acumulación de celulosa cristalina en respuesta a la perturbación espacial de la actividad hormonal 15.

<table><tbody><tr><td>Murashige & Skoog (MS)</td><td>Duchefa</td><td>M0221</td><td></td></tr><tr><td>Bórax</td><td>LOBA CHEMIE&nbsp;</td><td>6038</td><td></td></tr><tr><td>Azul de metileno</td><td>Sigma</td><td>M-9140</td><td></td></tr><tr><td>Azure</td><td>Sigma</td><td>861065</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa Accionado por Filtro PVDF de 0,22 mm&nbsp;</td><td>MILLEX-GV</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehído</td><td>EMS</td><td>16220</td><td></td></tr><tr><td>Cacodilato de Sodio</td><td>Sigma</td><td>C-0250</td><td></td></tr><tr><td>Leica kit historesin&nbsp;</td><td>Leica</td><td>7022 18 500</td><td></td></tr><tr><td>moldes de incrustación</td><td>Agar Scientific</td><td>AGG3530</td><td></td></tr><tr><td>film 100 &micro; P.P.C.&nbsp;</td><td></td><td></td> www.Jolybar.com <td>película de techo</td></tr><tr><td>Knivemaker</td><td>LKB</td><td>7800</td><td></td></tr><tr><td>Ultratome III</td><td>LKB</td><td>8800</td><td>Ultratome</td></tr><tr><td>Shandon immumount&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de luz</td> media con montaje termo 9990402 <td>Nikon</td><td>Eclipse 80i</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de imagen Abrio</td> Sistema de imagen <td>CRI</td><td>Abrio Software</td><td></td></tr><tr><td>Abrio V2.2</td> Software <td></td><td>CRI</td><td>Abrio V2.2</td></tr><tr><td>Software de análisis de imágenes de luz polarizada de acceso abierto &nbsp;</td><td>OPS</td><td>OpenPolScope</td><td><a href="http://www.openpolscope.org/">http://www.openpolscope.org/</a></td></tr></tbody></table>

alta resolución cuantificación de celulosa cristalina acumulación en<em&gt; arabidopsis</em&gt; las raíces para monitorear la célula específica de tejido de pared modificaciones

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Las células vegetales están rodeadas por una pared celular, cuya composición determina su tamaño y forma finales. La pared celular está compuesta por una matriz compleja que contiene polisacáridos que incluyen microfibrillas de celulosa que forman tanto estructuras cristalinas como cadenas de celulosa de organización amorfa. La orientación de las fibras de celulosa y sus concentraciones dictan las propiedades mecánicas de la célula. Se utilizan varios métodos para determinar los niveles de celulosa cristalina, cada uno de los cuales aporta ventajas y limitaciones. Algunos pueden distinguir la proporción de regiones cristalinas dentro de la celulosa total. Sin embargo, se limitan a análisis de órganos completos que son deficientes en información espacio-temporal. Otros, que dependen de imágenes en vivo, están limitados por el uso de tintes imprecisos. Aquí, reportamos un sistema sensible basado en luz polarizada para la cuantificación específica de la retardancia relativa de luz, que representa la acumulación de celulosa cristalina en secciones transversales de raíces de Arabidopsis thaliana. En este método, la resolución celular y los datos anatómicos se mantienen, lo que permite comparaciones directas entre los diferentes tejidos que componen la raíz en crecimiento. Este enfoque abre una nueva dimensión analítica, arrojando luz sobre el vínculo entre la composición de la pared celular, el comportamiento celular y el crecimiento de todo el órgano.

Se estudia el impacto de las respuestas específicas del tipo de células a los brasinoesteroides (BRS), el uso de la raíz de Arabidopsis como modelo de órganos 15-17. Cuando el receptor BRI1 BR está dirigido, en el fondo de mutante bri1, a un subconjunto de células de la epidermis llamadas células no pelo (Figura 2A, B), que inhibe la expansión de células unidireccional de células vecinas, y el crecimiento conjunto de la raíz 15. an...

La celulosa cristalina es un componente importante de la pared celular de la planta. Sin embargo, su cuantificación a una resolución celular es técnicamente desafiante. Aquí, reportamos el uso de la tecnología de luz polarizada y secciones transversales de raíces para obtener información de la composición de la pared celular a una resolución espacio-temporal.

Alta resolución Cuantificación de celulosa cristalina acumulación en<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Las raíces para monitorear la célula específica de tejido de pared Modificaciones

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...

El objetivo general de esta preparación de sección transversal anatómica es cuantificar la acumulación relativa de cristales y celulosa a resolución celular, permitiendo comparaciones directas entre los diferentes tejidos de la raíz primaria de Arabidopsis. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la fisiología y el desarrollo vegetal, como la manera en que la composición celular de un tipo celular determinado influye en el crecimiento de órganos completos. Después de esterilizar las semillas de Arabidopsis según el protocolo descrito, distribuya las semillas estériles sobre placas que contengan agar vegetal al 0,8 % y medio 0,5XM.Con papel parafilm, envuelva las placas y cúbralas con papel de aluminio. Almacene las placas a 4 grados Celsius durante uno a cuatro días para favorecer la germinación uniforme. Luego, transfiera las placas a una cámara de crecimiento adecuada para el cultivo de plántulas de Arabidopsis, colocando las placas en posición vertical para mantener el crecimiento de las raíces sobre la superficie del medio de agar. Prepare la solución de Richardson según el protocolo descrito en el texto. Filtre mediante una unidad de filtro de PVDF de 0,22 micrones accionada por jeringa antes de su uso.A continuación, bajo una campana química, prepare 50 mililitros de fijador combinando 38 ml de cacodilato de sodio 0.5 M con 2.5 ml de glutaraldehído. Luego, agregue 100 microlitros de la solución de Richardson a la solución de fijación para obtener la solución de fijación final. Utilice una placa previamente marcada y coloque de 2 a 3 ml de la solución de fijación final en los pocillos, de modo que la solución cubra completamente las plántulas.Utilizando pinzas de plástico, transfiera cuidadosamente hasta 10 plántulas a cada pocillo. Use parafilm para sellar las placas antes de almacenarlas en la oscuridad a 4 grados Celsius durante al menos una noche y hasta una semana. Para deshidratar las plántulas fijadas, use pinzas para tomar las plantas por su base y transfiéralas a los pocillos de nuevas placas de seis pocillos marcadas que contengan concentraciones crecientes de etanol durante los tiempos indicados aquí.Prepare el medio de infiltración en un frasco de vidrio pequeño mezclando el contenido de una bolsa de activador de Historesin con 50 ml de líquido básico de resina. Inserte un imán y agite la solución en una placa agitadora durante 20 minutos. Llene los pozos etiquetados de una placa de seis pozos con 2 a 3 ml de medio de infiltración.Luego, cuando las plántulas estén completamente deshidratadas, use pinzas para transferirlas de la solución de etanol al 95 % al medio de infiltración, asegurándose de que queden completamente cubiertas por el medio. Almacene las muestras a 4 grados Celsius durante al menos cuatro días para garantizar la máxima penetración en los tejidos vegetales. Para preparar los bloques, coloque etiquetas pequeñas marcadas con lápiz con el nombre de la muestra dentro de cada pozo de los moldes de inclusión.Prepare el medio de inclusión añadiendo 1 ml de agente endurecedor a 15 ml de medio de infiltración. Con aproximadamente 200 microlitros de medio de inclusión, llene la mitad de cada pocillo en el molde. Y utilice una lámina superior de película para cubrir el molde, con 1 ml adicional en cada lado.Incube los moldes a temperatura ambiente durante al menos dos horas para permitir la polimerización parcial. A continuación, prepare un lote adicional de medio de inclusión y manténgalo en hielo para evitar la polimerización mientras se acomodan las puntas radiculares en el molde. Añada medio de inclusión en una placa pequeña y coloque una plántula en el medio.Bajo un microscopio estereoscópico, use un escalpelo para cortar cada ápice radicular y luego colóquelo muy cuidadosamente en el molde a unos 2 a 3 mm del perímetro del molde, ya sea verticalmente para secciones de transferencia o horizontalmente para secciones longitudinales. Después de acomodar el tejido, llene completamente el molde con medio de inclusión y cúbralo con una lámina transparente. Incube entonces a temperatura ambiente durante un mínimo de dos horas. Para secar los bloques, colóquelos en un desecador con gel de sílice seco y déjelos a temperatura ambiente durante la noche.Utilizando un fabricante de cuchillas equipado con una herramienta de corte de diamante, prepare cuchillas de vidrio a partir de varillas de vidrio, cortando la varilla de vidrio en forma de cuadrado y luego cortando el cuadrado diagonalmente para producir dos cuchillas. Verifique que ambas cuchillas tengan bordes afilados. Monte un bloque en un soporte.Luego, con una cuchilla industrial de borde único, retire el material excesivo del bloque hasta un milímetro del ápice radicular para obtener una forma de pirámide. Seccione el bloque moldeado en rebanadas de 2 a 3 micrómetros de ancho y transfiera las rebanadas a una portaobjetos marcada. A continuación, agregue gotas de agua sobre las rebanadas.Es importante preparar secciones uniformes en anchura para minimizar la variabilidad de los datos analizados. Coloque los portaobjetos sobre los bloques calefactores ajustados a calor bajo hasta que se evapore el agua. Para preparar los portaobjetos para su observación bajo un microscopio polarizado, diluya la solución de Richardson al 2% de la solución original y use aproximadamente 1 ml para cubrir las secciones.Luego coloque las muestras en el bloque calefactor durante 5 segundos y úselas para lavarlas con agua destilada. Después de secar las laminillas en la placa calefactora, observe las secciones bajo un microscopio estereoscópico y utilice un marcador para señalar el reverso de una laminilla e indicar la posición de las secciones de interés. Añada 100 microlitros de medio de montaje antes de cubrir con la cubreobjetos.Obtenga imágenes y analice según el protocolo descrito en el texto. Aquí se muestra una sección transversal de la raíz primaria de Arabidopsis con la organización radial de sus células y tejidos constituyentes, incluyendo células no pilosas, células pilosas y córtex. Esta imagen de microscopía confocal muestra la expresión de BRI1-GFP en células no pilosas en un fondo mutante de BRI1, que inhibe la expansión unidireccional de las células vecinas y el crecimiento completo de la raíz.Como se observa aquí, secciones longitudinales de las raíces obtenidas del tipo silvestre y de líneas que expresan BRI1 en células no pilosas mostraron una orientación similar de los microfibrilos de celulosa, con una alta variabilidad de ángulos presentes en las células meristemáticas en comparación con las células de la zona de transición. Esto permite la comparación de la acumulación relativa de cristal en celulosa en las células meristemáticas y alargadas correspondientes de los dos fondos genéticos, como se muestra aquí en secciones transversales, y revela una correlación entre la expresión de BRI1 en células no pilosas y una alta acumulación local de cristal en celulosa. En general, en los videos, las personas nuevas a este método tendrán dificultades porque es complicado obtener raíces bien orientadas durante el procedimiento de inclusión.Por lo tanto, se deben preparar varios bloques para el corte en secciones. Una vez dominada la técnica, un solo corte de bloque puede realizarse en 2 a 3 horas. Al realizar este procedimiento, es importante recordar que la acumulación de cristales en la celulosa es comparable entre células si tienen una orientación similar de sus microfibrillas de celulosa, según lo determinado por las secciones longitudinales.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo fijar plántulas de Arabidopsis y cómo incrustarlas en bloques, así como de cómo preparar secciones transversales y longitudinales de la raíz. También debería tener una buena idea de los datos que se pueden obtener mediante el uso de microscopía de luz polarizada.

high-resolution-quantification-crystalline-cellulose-accumulation

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Un método basado en la microscopía confocal de Raman que se presenta ofrece sin etiquetas de visualización de la lignina en las paredes celulares vegetales y comparación de lignificación en los diferentes tejidos, muestras o especies.

Sin etiquetas In situ Imágenes de lignificación de las paredes celulares vegetales

Se describe un protocolo utilizando portaobjetos de cámara y los medios para inmovilizar los cotiledones de la planta para la formación de imágenes confocal de la epidermis durante varios días de desarrollo, la documentación de diferenciación estomática. Proteínas marcadas con fluoróforo se puede seguir dinámicamente por la expresión y localización subcelular, mejorar la comprensión de sus posibles funciones durante la división celular y la diferenciación de células de tipo.

A largo plazo, de alta resolución de imagen confocal Time Lapse de<em&gt; Cotiledones Arabidopsis</em&gt; Epidermis durante la germinación

En este video, describimos un procedimiento de tinción para visualizar la deposición de celulosa dentro de las paredes celulares de Arabidopsis thaliana, una planta dicotiledónea, utilizando blanco de calcofluor, que se une específicamente a los glucanos ligados a β, exhibiendo fluorescencia bajo luz UV.

Tinción con blanco de calcoflúor: un método simple para la visualización de fluorescencia inducida por UV de depósitos de celulosa en las paredes celulares de secciones de tallo de plantas dicotiledóneas

Describimos un método para mapear las propiedades mecánicas de los tejidos vegetales utilizando un microscopio de fuerza atómica (AFM). Nos centramos en cómo registrar los cambios mecánicos que tienen lugar en las paredes celulares durante el desarrollo de las plantas a mesoescala de campo amplio, lo que permite correlacionar estos cambios con el crecimiento y la morfogénesis.

Cartográficas basadas en AFM de las propiedades elásticas de las paredes celulares: en tejido, celular, y las Resoluciones Subcelulares

La composición de la pared celular de la planta varía según el tipo de tejido y puede incluir lignina, celulosa, hemicelulosas y pectina. Se han desarrollado varias técnicas de tinción para visualizar las diferencias a nivel de tipo de célula. Este artículo es una recopilación de las técnicas de tinción de pared celular más utilizadas.

La tinción histoquímica de<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Celda Secundaria Elements Pared

Ofrecemos aquí un protocolo eficiente y confiable para la inmunotinción, hibridación in situ fluorescente, la tinción de ADN seguido por cuantitativos, imágenes de alta resolución en óvulos de Arabidopsis thaliana todo el montaje. Este método fue utilizado con éxito para analizar modificaciones de la cromatina nuclear y de la arquitectura.

Un método eficaz para Cuantitativo, Análisis de celda única de la cromatina modificación y Arquitectura Nuclear en Todo el montaje en Óvulos<em&gt; Arabidopsis</em

La señalización de Ca2 + regula diversos procesos biológicos en las plantas. Aquí presentamos los enfoques para el control de estrés abiótico inducida espacial y temporal Ca 2 + señales en las células y tejidos que usan las codificados genéticamente Ca 2 + indicadores Aequorina o Case12 Arabidopsis.

Medición Espacial y Temporal Ca 2 + Las señales en plantas de Arabidopsis

Este protocolo describe en detalle cómo se fija el material vegetal para la inmunolocalización de proteínas y pectinas arabinogalactanas, incrustado en una resina acrílica hidrófila, seccionado y montado en toboganes de vidrio. Mostramos que los epítopos relacionados con la pared celular se detectarán con anticuerpos específicos.

Inmunolocalización fluorescente de proteínas arabinogalactanas y pectinas en la pared celular de los tejidos vegetales

Extracelular glutamato desencadenado por la señalización sistémica de calcio es fundamental para la inducción de las respuestas de defensa de las plantas a las heridas mecánicas y ataques de herbívoros en las plantas. Este artículo describe un método para visualizar la dinámica espacial y temporal de ambos estos factores usando las plantas del thaliana de Arabidopsis que expresan los biosensores fluorescentes calcio y glutamato-sensibles.

Wide-Field, Imágenes en tiempo real de señales de heridas locales y sistémicas en Arabidopsis

Este proceso utiliza microscopía confocal junto con un núcleo marcado fluorescentemente y una línea de marcadores de cromatina en Arabidopsis thaliana para registrar simultáneamente la dinámica del núcleo y la cromatina en raíces de Arabidopsis e investigar cambios en estas dinámicas en respuesta a señales de desarrollo y ambientales.

Imagen cuantitativa de células vivas de la forma nuclear y la dinámica de la cromatina durante el desarrollo y el estrés ambiental en la raíz de Arabidopsis thaliana

Aprende a cuantificar celulosa cristalina en raíces de Arabidopsis con resolución celular usando luz polarizada. Este método permite comparar composición de paredes celulares entre tejidos y estudiar crecimiento de órganos.

Alta resolución Cuantificación de celulosa cristalina acumulación en Arabidopsis Las raíces para monitorear la célula específica de tejido de pared Modificaciones (Video) | JoVE Journal

Alta resolución Cuantificación de celulosa cristalina acumulación en

Explorar más videos