In Situ caracterización de proteínas hidratadas en agua por Salvi y TOF-SIMS

El objetivo general de este procedimiento es caracterizar películas de proteínas adsorbidas en soluciones acuosas, utilizando el Sistema de Análisis en la Interfaz de Vacío Líquido y espectrometría de masas de iones secundarios en el tiempo de vuelo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre las biomoléculas y la biointerfaz. Por ejemplo, la caracterización de proteínas adsorbidas en una superficie sólida.

Las principales ventajas de esta técnica es que las biomoléculas pueden iniciarse in situ en el entorno líquido, y en combinación con el mapeo molecular. Aunque este método puede proporcionar información sobre las biomoléculas en la interfaz sólido-líquido, también se puede aplicar a otros sistemas, incluida la investigación de células cancerosas individuales, las interacciones farmacológicas y la unión de biopelículas. En una jeringa de cinco mililitros, extraiga dos mililitros de una solución de etanol al 70%.

Conecte la jeringa al extremo de entrada del dispositivo SALVI e inyecte lentamente un mililitro del líquido en el transcurso de 10 minutos. Al final de la inyección, retire la jeringa y conecte la entrada y la salida del SALVI mediante una unión de poliéter-éter-cetona. Mantenga el microcanal SALVI lleno con la solución de etanol al 70% a temperatura ambiente durante cuatro horas.

Luego, llene una segunda jeringa con agua desionizada estéril. Conéctelo a la entrada del SALVI e inyecte lentamente el agua desionizada en el dispositivo en el transcurso de 10 minutos. Retire la jeringa y vuelva a conectar la entrada y la salida del dispositivo juntas.

Para inmovilizar una película de proteína, comience por extraer dos mililitros de solución de fibronectina en una jeringa. Conecte la jeringa a la entrada del dispositivo SALVI e inyecte lentamente un mililitro del líquido en el transcurso de 10 minutos. A continuación, retire la jeringa y vuelva a conectar la entrada y la salida.

Incube la instalación en una placa de cultivo limpia a temperatura ambiente durante 12 horas. Después de la incubación, inyecte lentamente un mililitro de agua desionizada estéril en el transcurso de 10 minutos y luego vuelva a conectar la entrada a la salida. Para comenzar, coloque la etapa ToF-SIMS sobre una superficie plana y limpia.

Coloque el dispositivo SALVI en la platina con la oblea de silicio y la membrana de nitruro de silicio hacia arriba. Fije el dispositivo SALVI a la plataforma con cuatro piezas de sujeción metálicas y atornille las piezas metálicas que sujetan la esquina del dispositivo en la placa metálica mediante cuatro tornillos. A continuación, enrolle suavemente el tubo PFTE conectado al canal microfluídico.

Use cuatro piezas de metal y cuatro tornillos para sujetar la parte rígida hacia abajo. Asegúrese de que el dispositivo esté colocado en el espacio abierto de la plataforma, de modo que no interfiera con el haz de iones primario durante el análisis. A continuación, monta la copa de Faraday en el escenario con un tornillo.

A continuación, abra la puerta de la cerradura de carga ToF-SIMS y coloque la plataforma horizontalmente en la plataforma de carga antes de cerrar la puerta. Encienda la bomba de vacío y deje que la cámara de bloqueo de carga bombee hasta aproximadamente 10 a menos seis milibares. Luego, mueva el dispositivo SALVI a la cámara principal después de unos 30 minutos, una vez que el vacío esté estabilizado.

Ajuste el haz de iones primario y el analizador del ToF-SIMS para adquirir una resolución espacial de aproximadamente 400 nanómetros siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante. A continuación, encuentre el canal microfluídico usando el microscopio óptico. Utilice el centro de la imagen óptica como referencia y alinéelo para que sea coherente con el centro de la imagen de iones secundarios.

La demostración visual de este paso es fundamental, ya que es difícil de aprender, porque la muestra es más gruesa que las muestras sólidas normales y es difícil ajustar la configuración para encontrar el mejor enfoque del canal. Antes de cada medición, use un haz de oxígeno de un kiloelectrón para escanear la ventana de nitruro de silicio durante unos 15 segundos para eliminar la contaminación de la superficie. Además, use un cañón de inundación de electrones para compensar la carga superficial durante todas las mediciones.

A continuación, seleccione el modo positivo o negativo antes de iniciar la adquisición de datos. Utilice el bismuto de 25 kiloelectronvoltios más como haz de iones primario en todas las mediciones. Para la creación de perfiles de profundidad, escanee el haz de iones primario en un área redonda con un diámetro de aproximadamente dos micrómetros con una resolución de 32 píxeles por 32 píxeles.

Para minimizar el tiempo necesario para perforar la membrana de nitruro de silicio, utilice un haz de iones primarios de ancho de pulso largo. Después de perforar la membrana de nitruro de silicio, mantenga la misma corriente durante unos 200 segundos para obtener datos suficientes para reconstrucciones de imágenes bidimensionales. Para la recopilación de datos, reduzca el ancho de pulso a 80 nanosegundos para adquirir espectros con mejor resolución de masa.

Continúe esta adquisición durante unos 200 segundos más. Usando la interfaz microfluídica SALVI, el haz de iones primario puede bombardear directamente la película de fibronectina hidratada. Los datos de especificaciones de masas de ToF-SIMS indican una serie de grupos de agua y fragmentos de aminoácidos.

Esto proporciona evidencia directa de la propiedad de las moléculas de agua que rodean y dentro de las moléculas de proteína hidratada. Aquí, se pueden ver las series temporales del perfil de profundidad de la película de fibronectina hidratada y del agua desionizada. Las intensidades de los segundos iones seleccionados son insignificantes antes de que la membrana de nitruro de silicio sea perforada.

Una vez que se perfora la membrana de nitruro de silicio, las intensidades de los iones secundarios aumentan significativamente. El proceso de ancho de pulso corto se utiliza para obtener datos con mejor resolución de masa para reconstrucciones de imágenes y espectro. Las imágenes 2D de la película de fibronectina hidratada y el agua desionizada representan los recuentos de iones secundarios seleccionados de la muestra.

Cuanto más brillante sea la imagen, mayor será el recuento de iones secundarios. Estas imágenes intuitivas proporcionan una comparación clara de los iones secundarios seleccionados entre diferentes muestras, lo que es útil en el análisis de datos. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que un microrreactor debe estar libre de fugas antes de instalarlo en la cámara de vacío.

Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología y las biointerfaces exploraran la adsorción de proteínas, la unión de biopelículas, las monocapas ensambladas en la superficie y muchos otros fenómenos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo estudiar varias muestras líquidas usando SALVI y el ToF-SIMS líquido.