Name: In Situ caracterización de proteínas hidratadas en agua por Salvi y TOF-SIMS (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: Aprende a caracterizar películas de proteínas adsorbidas en soluciones acuosas mediante SALVI y espectrometría de masas TOF-SIMS. Este método permite el análisis in situ de biomoléculas en la interfaz sólido-líquido.

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Estamos agradecidos al fondo LDRD de la Iniciativa de Imágenes Químicas-Investigación y Desarrollo Dirigido por el Laboratorio (CII-LDRD) y a la Iniciativa de Síntesis y Simulación de Materiales a través de Escalas (MS3) por su apoyo. El acceso instrumental se proporcionó a través de una propuesta temática científica del Laboratorio de Ciencias Moleculares Ambientales (EMSL) de W. R. Wiley. EMSL es una instalación nacional de usuarios científicos patrocinada por la Oficina de Investigación Biológica y Ambiental (BER) en PNNL. Los autores agradecen al Sr. Xiao Sui, al Sr. Yuanzhao Ding y a la Sra. Juan Yao por la revisión del manuscrito y sus útiles comentarios. PNNL es operado por Battelle para el DOE bajo el contrato DE-AC05-76RL01830.

1. Limpieza y esterilización del microcanal SALVI <ol><li> La esterilización del microcanal en SALVI <ol><li> Dibuje 2 ml de solución acuosa al 70% de etanol en una jeringa, conectar la jeringa con el extremo de entrada de SALVI, e inyecte lentamente 1 ml de líquido en 10 min. Retire la jeringa al final de la inyección. A continuación, conecte la entrada y salida de SALVI mediante una unión polieteretercetona (PEEK). Alternativamente, utilizar una bomba de jeringa para llevar a cabo el mismo procedimiento. Por ejemplo, ajustar la velocidad de flujo de 100 l / min. </li><li> Mantenga el microcanal SALVI lleno de solución de etanol al 70% a temperatura ambiente durante 4 hr. </li></ol></li><li> Introducir agua desionizada (DI) en SALVI <ol><li> Dibuje 2 ml de agua DI esterilizados en un jeringa, conectar la jeringa con la entrada de SALVI, e inyecte lentamente 1 ml de líquido en 10 min. Retire la jeringa, y conectar la entrada y la salida del SALVI mediante una unión PEEK. Alternativamente, utilizar una bomba de jeringa como se menciona enpaso 1.1.1. </li></ol></li></ol> 2. La inmovilización de la película de proteína en SALVI <ol><li> Inmovilizar la película de proteína en SALVI <ol><li> Dibuje 2 ml de fibronectina (10 mg / ml en solución salina tamponada con fosfato, PBS) solución en una jeringa, conectar la jeringa con la entrada de SALVI, inyecte lentamente 1 ml del líquido en 10 min, retire la jeringa, y conectar la entrada y la salida del SALVI mediante una unión PEEK. </li><li> Incubar la SALVI lleno con la solución de fibronectina en una placa de cultivo limpio, mantener el plato en la campana a temperatura ambiente durante 12 hr. </li><li> Dibuje 2 ml de agua DI esterilizada en una jeringa y conectar la jeringa con la entrada de SALVI. inyectar lentamente 1 ml de agua en 10 minutos, retire la jeringa, y conectar la entrada y la salida del SALVI. Nota: Si está equipado con un microscopio de luz, comprobar el SALVI bajo el microscopio para asegurarse de que la membrana de SiN está intacto antes del análisis ToF-SIMS. Ahora el dispositivo está listo para SALVI TOF-SIMS unaANÁLISIS. </li></ol></li></ol> 3. Instalar SALVI en la Cámara de carga cerrada TOF-SIMS Nota: Se deben usar guantes en todo momento al manipular el dispositivo de Salvi y de instalarlo en la etapa de TOF-SIMS para evitar posibles contaminaciones durante el análisis de superficie. <ol><li> Monte SALVI al escenario <ol><li> Coloque la etapa TOF-SIMS sobre una superficie plana y limpia. Coloque el dispositivo SALVI en el escenario con la oblea de silicio y la membrana de SiN hacia arriba. Fijar la SALVI utilizando cuatro piezas metálicas de sujeción y atornillar las piezas de metal que sujetan la esquina del dispositivo en la placa de metal con cuatro tornillos. </li><li> rodar suavemente hacia arriba el tubo de PFTE conectado al canal microfluídico. Utilice cuatro piezas de metal y cuatro tornillos para sujetar la pieza rígida hacia abajo. Asegúrese de que el dispositivo se coloca en el espacio abierto en la etapa de SIMS de modo que no interfiera con el haz de iones primario durante el análisis. Imagen adicional e ilustración de la fabricat SALVIiones y la instalación están disponibles en publicaciones anteriores. 8,9,11 </li></ol></li><li> Montar la Copa de Faraday al escenario <ol><li> Fijar la copa de Faraday en el escenario por un tornillo. </li></ol></li><li> Cargar la etapa en la cámara de carga cerrada TOF-SIMS <ol><li> Abra la carga cerrada TOF-SIMS, sostener y fijar la etapa horizontal sobre la plataforma de carga, y cerrar la puerta de carga cerrada. </li></ol></li></ol> 4. TOF-SIMS Adquisición de Datos <ol><li> Encienda la bomba de vacío y garantizar vacío adecuada (por ejemplo, del orden de 10 -6 mbar o Torr) se alcanza en la cámara de carga cerrada. </li><li> Mueva el SALVI en la cámara principal una vez que el vacío se estabiliza después de aproximadamente 30 min. Nota: El vacío debe ser inferior a 5 x 10 -6 mbar de vacío en la cámara principal durante la adquisición de datos. De lo contrario, el aumento de vacío es indicativo de una fuga en el sistema de SALVI. </li><li> Ajustar el haz de iones primario y un analizador de TOF-SIMS con unaresolución espacial de aproximadamente 400 nm de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. La corriente del haz primario es de 1.200 pA mientras que el tiempo de ciclo es de 30 microsegundos en virtud modo DC. Nota: Este proceso sigue en gran parte las recomendaciones del fabricante. </li><li> Búsqueda del canal de microfluidos con el microscopio óptico. Utilice el centro óptico de la imagen como referencia y alinearlo para ser coherente con el centro de la imagen de iones secundarios. </li><li> Antes de cada medición, utilice un 1 KeV O2 + viga (~ 40 nA) para escanear en la ventana de SiN con un área de 500 x 500 m 2 para ~ 15 segundos para eliminar la contaminación. Asimismo, el uso de un cañón de proyección de electrones para compensar la carga superficial durante todas las mediciones. Utilice la función automática del cañón de proyección en el modo por defecto para este paso. </li><li> Seleccione el modo positivo o negativo antes de la adquisición de datos. Utilice el 25 keV Bi viga 3 + como el haz de iones primario en todas las mediciones. Nota: Los pasos son similares fo adquisiciones de datos positivos y negativos. Por el interés de espacio, el modo positivo se describe en detalles aquí. <ol><li> perfiles de profundidad <ol><li> Explorar el haz Bi 3 + en una zona redonda con un diámetro de ~ 2 micras con 32 píxeles por 32 píxeles de resolución. </li><li> Para minimizar el tiempo requerido para perforar a través de la membrana SiN, utilice un ancho de pulso largo (es decir, 180 nseg, la corriente de haz ~ 1,0 Pa a un tiempo de ciclo de 100 microsegundos) Bi 3 + haz. Las intensidades de iones secundarios representante del aumento de la superficie del líquido cuando se alcanza traspaso de. El tiempo de traspaso de varía de 300 seg a 500 seg, dependiendo de la carga de la membrana SiN. Nota: Esta diferencia parece estar relacionada con el lote de membranas SiN adquiridos de acuerdo con nuestra experiencia. Sin embargo, el tiempo de traspaso de realidad no afecta al análisis de datos. </li><li> Después de la membrana de nitruro de traspaso de control, mantenga la misma corriente por alrededor de 200 segundos paraobtener datos suficientes para una imagen reconstrucciones 2D. </li><li> Reducir el ancho de pulso de 80 ns para la recolección de datos para adquirir espectros de masas con una mejor resolución. Continuar esta adquisición por alrededor de otros 200 seg. Los datos del espectro se muestran en la Figura 1 se obtienen a partir de esta región. </li></ol></li><li> 2D de imágenes y espectros de masas <ol><li> Recoger la formación de imágenes 2D y datos de los espectros de masas al mismo tiempo en la medición de los datos de profundidad de perfiles. El instrumento TOF-SIMS guarda toda la información de cada punto durante el experimento. Los datos se muestran en diferentes ventanas (Fpanel - Spectra, Fpanel - Perfiles y Fpanel - Imágenes por separado) del software de control digital. Comprobar los datos en cada panel juiciosamente durante la adquisición de datos. </li></ol></li></ol></li></ol> Análisis 5. TOF-SIMS de Datos Nota: El análisis de datos se lleva a cabo inicialmente utilizando el software decisivo IonToF TOF-SIMS. <ol><li> Abra la unaANÁLISIS software de SIMS (Medición Explorer) y haga clic en los &quot;perfiles&quot;, &quot;botones de imagen &#39;espectros&#39; y &#39;, respectivamente, para procesar perfil de profundidad, el espectro de m / z, y los datos de imagen. </li><li> Abrir los archivos de datos que tienen la extensión &quot;.ita&quot;. </li><li> Seleccionar los picos de interés, escriba el nombre de la especie en el cuadro de &quot;ion&quot;, y etiquetarlos con diferentes colores en el espectro. Utilice la rueda de desplazamiento del ratón para arrastrar a lo largo del eje x. Utilizar las teclas Ctrl y la rueda de desplazamiento para ajustar alturas de pico y anchuras. interruptores letra &quot;L&quot; entre los modos logarítmico y lineal a lo largo del eje y. </li><li> Llevar a cabo la reconstrucción de datos antes de la calibración de masas. De lo contrario, es difícil elegir la separación entre picos en la etapa de calibración de masas. <ol><li> Seleccione los datos de perfiles de profundidad de interés y reconstruir los espectros de acuerdo a la serie temporal perfil de profundidad. </li><li> Haga clic en el botón de la reconstrucción. En la ventana &quot;Inicio Reconstrucción&quot;, forma en un rango de exploración de interest. Haga clic en &quot;OK&quot; para reconstruir los datos del perfil de profundidad. </li></ol></li><li> Realizar una calibración de masas. Pulse la tecla &quot;F3&quot; para abrir la ventana de &quot;calibración de masa&quot;. Elija picos de calibración en base a la muestra específica. 21 En este trabajo, utilice los siguientes picos CH3 + (m / z 15), H3O + (m / z 19), C 2 H 5 + (m / z 29 ), H 5 O 2 + (m / z 37), C 3 H 7 + (m / z 43), H 7 O 3 + (m / z 55), H 9 O 4 + (m / z 71), H 11 O 5 + (m / z 99) y H 13 O 6 + (m / z 109) para el modo positivo. Utiliza el siguiente picos CH - (m / z 13), O - (m / z 16), OH - (m / z 17), C 2 H - (m / z 25), C 3 H - (m / z 37), y C 4 H - (m / z 49) para el modo negativo. <ol><li> Seleccionar un pico,asegúrese de que la flecha hacia abajo que está orientado hacia el pico en la esquina inferior izquierda de la ventana. Haga clic en ese pico y escriba el nombre de pico en la ventana de &quot;calibración de masa&quot;, haga clic en &quot;Añadir&quot;, y el ion de interés se incluye en la calibración de masa. </li><li> Por último, haga clic en el botón &quot;Volver a calibrar&quot;. Compruebe si las superficies de los picos están en los lugares correctos en función de su masa a carga proporciones. En el menú &quot;Spectrum&quot;, seleccione y haga clic en &quot;Aplicar la masa de calibración&quot; a &quot;todos los espectros&quot; o &quot;espectros seleccionados&quot;, según el análisis específico que se efectúe. </li></ol></li><li> Que sean necesarios para el análisis de muestras de selección pico, determinar los picos característicos de la muestra de acuerdo a la literatura u otros hallazgos anteriores. Comparar la intensidad de los picos de interés en los espectros m / z. Si es necesario, añadir nuevos picos o eliminar picos inútiles en el pico de la lista. <ol><li> Añadir picos. Haga clic en un pico, encontrar las líneas rojas en la ventana inferior izquierda. Hold la tecla &quot;Ctrl&quot;, desplazarse ratón horizontalmente para definir la anchura del pico, lo que añade un pico a pico de la lista automáticamente. Otra forma de añadir un pico es seleccionar un pico en la ventana principal del espectro y, a continuación, hacer clic en el botón &quot;añadir pico&quot; por encima de la ventana. Si hay muchos picos de añadir, en el menú de &quot;Spectrum&quot;, seleccione &quot;picos&quot; de búsqueda, comprobar las especificaciones relacionadas en la ventana que se abre, a continuación, añadir los picos según sea necesario. </li><li> Para exportar una lista de pico, en el menú &quot;Lista de pico&quot;, seleccione &quot;Guardar ...&quot; pico de la lista en el formato &quot;itmil&quot;. Utilizar el botón izquierdo del Ctrl y arrastrar a lo largo del espectro. En la ventana de espectros, seleccionar un pico de interés y arrastre las dos líneas de puntos a las posiciones deseadas. </li><li> Para importar una lista de pico, en el menú &quot;Lista intervalo de masas&quot;, elegir la opción &quot;Importar ...&quot;, localice un archivo de lista de pico existente con la extensión de archivo &quot;.ITPL&quot;. Haga clic en &quot;Abrir&quot;. </li><li> Para utilizar un &quot;itmil&quot; pico de la lista, enel menú &quot;Lista de intervalo de masas&quot;, haga clic en &quot;Abrir ...&quot;, encontrar el archivo, a continuación, haga clic en &quot;Abrir&quot;. </li></ol></li><li> Aplicar una lista de pico para analizar más datos. En la parte inferior-izquierda de la ventana &quot;Spectra&quot;, hay una ventana llamada &quot;Lista de intervalo de masas&quot;. El pico de la lista importada se muestra aquí. <ol><li> Haga clic en el archivo de lista de pico para ser utilizado, aplicarlo a la &quot;espectro activo&quot; o &quot;todos los espectros&quot;. </li></ol></li><li> Ver los perfiles de datos. En la ventana &quot;Perfil&quot;, Utilice la letra &quot;M&quot; para adaptarse a la ventana (toda la gama) y la letra &quot;N&quot; para adaptarse a la del eje y. Utilizar las teclas Ctrl y rueda de desplazamiento para ajustar el ancho de perfil. O use &quot;/&quot; y &quot;*&quot; en el teclado para cambiar el rango del eje y la altura. </li><li> Los datos de exportación para el trazado más utilizando otro software gráfico después del análisis inicial. <ol><li> Para exportar un perfil de profundidad, en la ventana de &quot;perfil&quot;, haga clic en el menú &quot;Archivo&quot;, luego seleccione &quot;Export &amp; #34 ;, y luego seleccione &quot;Guardar como&quot; un archivo &quot;.txt&quot;. </li><li> Para exportar un archivo de espectro m / z, en la ventana &quot;Spectra&quot;, haga clic en el menú &quot;Archivo&quot; y seleccione &quot;Exportar&quot; y seleccione &quot;Guardar como&quot; un archivo &quot;.txt&quot;. </li><li> Para exportar un archivo de imagen, en la ventana, impresión de pantalla &quot;Imagen&quot; y guardar como archivo de imagen. </li></ol></li></ol> 6. TOF-SIMS trazado de datos y presentación Nota: Utilice una herramienta gráfica para representar los datos después de que los datos de SIMS se procesan utilizando el software instrumental. <ol><li> Utilizar una herramienta gráfica para importar los datos. </li><li> Haz un diagrama con el m / z como el eje x y la intensidad de pico como el eje y para mostrar el espectro reconstruido. Un ejemplo se da en la Figura 1. </li><li> Haz un diagrama utilizando el tiempo de pulverización catódica como el eje x y la intensidad de pico como el eje y para mostrar la serie temporal perfil de profundidad reconstruida. Un ejemplo se da en la Figure 2. </li><li> Combinar imágenes 2D reconstruidas de diferente m / z y formar una matriz para mostrar el mapeo de iones. Un ejemplo se da en la figura 2. </li></ol>

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<li>Brüning, C., Hellweg, S., Dambach, S., Lipinsky, D., Arlinghaus, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+interpretation+of+ToF-SIMS+measurements+on+adsorbed+proteins+using+PCA%5BTitle%5D)+AND+%22Surf.+Interface+Anal%22%5BJournal%5D)">Improving the interpretation of ToF-SIMS measurements on adsorbed proteins using PCA.</a> Surf. Interface Anal. 38 (4), 191-193 (2006).</li>
<li>Gustavsson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+modifications+of+silicon+nitride+for+cellular+biosensor+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mater.+Sci.-Mater.+Med%22%5BJournal%5D)">Surface modifications of silicon nitride for cellular biosensor applications.</a> J. Mater. Sci.-Mater. Med. 19 (4), 1839-1850 (2008).</li>
<li>Deng, J., Ren, T. C., Zhu, J. Y., Mao, Z. W., Gao, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adsorption+of+plasma+proteins+and+fibronectin+on+poly%28hydroxylethyl+methacrylate%29+brushes+of+different+thickness+and+their+relationship+with+adhesion+and+migration+of+vascular+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Regen+Biomater%22%5BJournal%5D)">Adsorption of plasma proteins and fibronectin on poly(hydroxylethyl methacrylate) brushes of different thickness and their relationship with adhesion and migration of vascular smooth muscle cells.</a> Regen Biomater. , 17-25 (2014).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

SALVI es una interfaz de microfluidos que permite superficie del líquido dinámico y el análisis de la interfaz líquido-sólido por instrumentos basados ​​en el vacío, como ToF-SIMS y microscopía electrónica de barrido (SEM). Debido al uso de pequeñas aberturas para exponer líquido directamente en el vacío, SALVI es adecuado para muchas técnicas de espectroscopia e imagen finamente enfocada, sin ninguna modificación; 22 la portabilidad y versatilidad de microfluidos que sea una verdadera plataforma de imagen mu...

La hidratación es crucial para la estructura, conformación 1, 2 y 3 actividad biológica de las proteínas. Las proteínas sin moléculas de agua que rodean ellos no tendrían actividades biológicas viables. En concreto, las moléculas de agua interaccionan con la superficie y la estructura interna de las proteínas, y diferentes estados de hidratación de las proteínas hacen que tales interacciones distinta. 4 La interacción de las proteínas con las superficies sólidas es un fenómeno fundamental con implicaciones en la nanotecnología, biomateriales y procesos de ingeniería de tejidos. Los estudios han indicado durante mucho tiempo que se pueden producir cambios conformacionales como una proteína se encuentra con una superficie. ToF-SIMS se ha previsto como la técnica que tiene el potencial para estudiar la interfaz de proteína-sólido. 5-7 Es importante entender la hidratación de las proteínas sobre superficies sólidas, que potencialmente proporciona una comprensión fundamental del mecanismo de su estructura, conformación y biológicaactividad al. Sin embargo, las técnicas analíticas superficie principal son en su mayoría basados ​​en vacío y aplicaciones directas para los estudios de líquidos volátiles son difíciles debido a la rápida evaporación del líquido volátil en el entorno de vacío. Hemos desarrollado un vacío interfaz de microfluidos compatible, Sistema de Análisis en la interfaz de líquido de vacío (SALVI), para permitir la observación directa de superficies de líquido y de las interacciones líquido-sólido utilizando el tiempo de vuelo espectrometría de masas de iones secundarios (ToF-SIMS). 8- 11 los aspectos únicos incluyen los siguientes: 1) la ventana de detección es una abertura de 2-3 micras de diámetro que permita imagen directa de la superficie del líquido, 2) la tensión superficial se utiliza para mantener el líquido dentro de la abertura, y 3) es SALVI portables entre múltiples plataformas analíticas 11,12. SALVI se compone de una membrana de nitruro de silicio (SiN) como el área de detección y un microcanal hecho de polidimetilsiloxano (PDMS). Es fabricated en la sala limpia, y los factores de fabricación y de diseño se han detallado en los documentos y patentes anteriores. 8-12 Las aplicaciones de TOF-SIMS como una herramienta analítica se demostró usando una variedad de soluciones acuosas y las mezclas líquidas complejas, algunas de las que contenía nanopartículas. 13-17 en concreto, SALVI líquido TOF-SIMS dinámico permite sondeo de la interfase líquido-sólido de los sistemas biológicos vivos (es decir, los biofilms), células individuales, y la interfaz de electrolito sólido, la apertura de nuevas oportunidades para la fase in situ condensada Los estudios incluyendo líquidos utilizando TOF-SIMS. Sin embargo, el diseño actual no permite interacciones gas-líquido todavía. Esta es una dirección de desarrollo futuro. SALVI se ha utilizado para estudiar la película de proteína hidratado en este trabajo para la primera vez. La fibronectina es un dímero de proteína de uso común, que consiste en dos monómeros casi idénticos unidos por un par de enlaces de disulfuro, 18 que iEs bien conocido por su capacidad para unirse a las células 19,20. Fue elegido como un sistema modelo para ilustrar que la película de proteína hidratado podía palpar de forma dinámica utilizando el líquido SALVI TOF-SIMS enfoque. La solución de proteína se introdujo en el microcanal. Después de incubar durante 12 horas, una película de proteína hidratado formado en el lado posterior de la membrana SiN. Agua desionizada (DI) se utilizó para enjuagar el canal después de la introducción de proteínas. Se recolectó información de las moléculas de proteína fibronectina hidratados en el microcanal SALVI usando dinámica TOF-SIMS. DI agua también se estudió como un control para comparar con los resultados obtenidos a partir de película delgada fibronectina hidratado. No se observaron diferencias claras entre la película de proteína hidratado y agua DI. Este trabajo demuestra que la adsorción de proteínas en la superficie en el medio líquido puede ser estudiada usando la novela Salvi y enfoque TOF-SIMS líquido. El protocolo de vídeo está destinado a proporcionar orientación técnica para las personas que están interesadasen la utilización de esta nueva herramienta analítica para diversas aplicaciones de SALVI con TOF-SIMS y reducir errores innecesarios en el manejo de líquidos, así como la adquisición de datos TOF-SIMS y análisis.

<table><tbody><tr><td>ToF-SIMS</td><td>IONTOF</td><td>TOF. Resolución SIMS 5</td><td>: >10.000 m/&Delta; m para resolución de masa; >4.000 m/&Delta; m para alta resolución espacial&nbsp;</td></tr><tr><td>Sistema de Análisis en la Interfaz de Vacío Líquido (SALVI)</td><td>Laboratorio Nacional del Noroeste del Pacífico</td><td>N/A</td><td>SALVI es una herramienta analítica única, autónoma y portátil que, por primera vez, permite que los instrumentos científicos basados en el vacío, como la espectrometría de masas de iones secundarios en el tiempo de vuelo (ToF-SIMS), analicen superficies líquidas en su estado natural a nivel molecular.</td></tr><tr><td>Unión PEEK</td><td>Valco</td><td>ZU1TPK</td><td>para conectar la entrada y salida de SALVI</td></tr><tr><td>5 ejes Etapa de muestra</td><td>La etapa IONTOF</td><td>N/A</td><td>es de fabricación propia para el montaje de SALVI en ToF-SIMS</td></tr><tr><td>Sistema de purificación de agua nanopura Barnstead</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D11921</td><td>Módulo de filtración de ósmosis inversa ROpure LP (D2716)</td></tr><tr><td>Jeringa</td><td>BD</td><td>309659</td><td>1 ml</td>Pipeta</tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21-377-821</td><td>Gama: 100 a 1.000 ml</td></tr><tr><td>Punta de pipeta</td><td>Neptune</td><td>2112.96.BS</td><td>1.000 y micro; l</td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga</td><td>Corning</td><td>430791</td><td>15 ml</td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141</td><td>1 mg/ml</td></tr><tr><td></td><td>Etanol Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>S25310A 95% Desnaturalizado</td></tr><tr><td>Gibco PBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010-023</td><td>pH 7.4</td></tr></tbody></table>

in situ caracterización de proteínas hidratadas en agua por salvi y tof-sims

In Situ Characterization of Hydrated Proteins in Water by SALVI and ToF-SIMS

Este trabajo demuestra la caracterización in situ de biomoléculas de proteínas en la solución acuosa utilizando el Sistema de Análisis de la interfaz de líquido de vacío (SALVI) y espectrometría de masas de tiempo de vuelo de iones secundarios (SIMS-TOF). La película de proteína fibronectina se inmoviliza sobre la membrana de nitruro de silicio (SiN) que forma el área de detección SALVI. Durante el análisis ToF-SIMS, se llevaron a cabo tres modos de análisis que incluye alta espectrometría de masas de alta resolución espacial, las imágenes de dos dimensiones (2D), y perfiles de profundidad. Los espectros de masas se adquirieron en los modos tanto positivos como negativos. agua desionizada también se analizó como una muestra de referencia. Nuestros resultados muestran que la película de la fibronectina en agua tiene picos de racimo de agua más distintos y más fuertes en comparación con el agua sola. picos característicos de fragmentos de aminoácidos también son observables en la proteína hidratada ToF-SIMS espectros. Estos resultados ilustran que la adsorción molécula de proteína en una superficie puede ser estudiado dynamicaLLY usando Salvi y ToF-SIMS en el medio líquido para la primera vez.

Un par de resultados representativos se presentan para demostrar las ventajas del protocolo propuesto. Mediante el uso de la interfaz de microfluidos SALVI, el haz de iones primario (Bi 3 +) puede bombardear directamente sobre la película de fibronectina hidratado en agua DI. Por lo tanto la asignación de química molecular de la superficie del líquido puede ser adquirido con éxito. La Figura <stro...

Este trabajo presenta un protocolo para el manejo de líquidos y de introducción de muestra a un microcanal para in situ de iones secundarios análisis de espectrometría de masas de tiempo de vuelo de biomoléculas de proteínas en una solución acuosa.

In Situ caracterización de proteínas hidratadas en agua por Salvi y TOF-SIMS

This work demonstrates in situ characterization of protein biomolecules in the aqueous solution using the System for Analysis at the Liquid Vacuum ...

El objetivo general de este procedimiento es caracterizar películas de proteínas adsorbidas en soluciones acuosas, utilizando el Sistema de Análisis en la Interfase Líquido-Vacío y la espectrometría de masas de iones secundarios por tiempo de vuelo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre biomoléculas y la biointerfase. Por ejemplo, la caracterización de proteínas adsorbidas en una superficie sólida.Las principales ventajas de esta técnica son que las biomoléculas pueden ser iniciadas in situ en un entorno líquido y en combinación con el mapeo molecular. Aunque este método puede proporcionar información sobre las biomoléculas en la interfaz sólido-líquido, también puede aplicarse a otros sistemas, incluyendo el estudio de células cancerosas individuales, interacciones de fármacos y la adhesión de biopelículas. En una jeringa de cinco mililitros, aspire dos mililitros de una solución de etanol al 70 %.Conecte la jeringa al extremo de entrada del dispositivo SALVI e inyecte lentamente un mililitro del líquido durante un período de 10 minutos. Al final de la inyección, retire la jeringa y conecte la entrada y la salida del SALVI utilizando un conector de polieter-ét

in-situ-characterization-hydrated-proteins-water-salvi-tof

Research

Investigación

JoVE Journal

Chemistry

Química

El objetivo de este experimento es determinar y controlar el tamaño, la forma y la estabilidad de auto-ensambladas anfifilos discotic en el agua. Para polímeros supramoleculares acuosas a base de tal nivel de control es muy difícil. Nosotros aplicamos una estrategia con las dos interacciones de atracción y repulsión. Las técnicas experimentales aplicadas a caracterizar este sistema son ampliamente aplicables.

Controlar el tamaño, forma y estabilidad de los polímeros supramoleculares en el agua

Más de la mitad de las proteínas son proteínas pequeñas (masa molecular &lt;200 kDa) que son difíciles tanto para formación de imágenes de microscopio electrónico y reconstrucciones tridimensionales. Tinción negativa optimizado es un protocolo robusto y de alto rendimiento para obtener imágenes de alto contraste y de pequeñas proteínas o complejos asimétricos en diferentes condiciones fisiológicas relativamente alta resolución (~ 1 nm).

Optimizado tinción negativa: un protocolo de alto rendimiento para el examen de Estructura Pequeña y asimétrica de proteínas por Microscopía Electrónica

Aterrizaje suave de los iones de masa-seleccionada sobre las superficies es un enfoque poderoso para la preparación altamente controlada de nuevos materiales. Junto con el análisis por espectrometría de masas de iones secundarios situ (SIMS) y espectroscopía de absorción reflexión infrarroja (IRRAS), aterrizaje suave proporciona una visión sin precedentes en las interacciones de las especies bien definidas con las superficies.

In Situ SIMS y espectroscopia IR de superficies bien definidas Preparado por Soft Landing de iones seleccionados-Mass

Los pasos clave de la función de las proteínas, en particular los cambios conformacionales de la columna vertebral y las reacciones de transferencia de protones, a menudo tienen lugar en la escala de tiempo de microsegundos a milisegundos. Estos procesos dinámicos pueden estudiarse mediante espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier de barrido escalonado resuelto en el tiempo, en particular para proteínas cuya función es desencadenada por la luz.

Transferencia de Protones y Proteína Conformación Dinámica de proteínas fotosensibles por Time resuelto-Step-scan transformada de Fourier espectroscopia de infrarrojo

El equilibrio de sedimentación (SE) se puede utilizar para estudiar las interacciones proteína-proteína en un entorno fisiológico. Este manuscrito describe el uso de esta técnica para determinar el efecto del pH sobre la estabilidad de un homo-pentámero formado por la pequeña proteína hidrofóbica (SH) codificada por el virus respiratorio sincitial humano (hRSV).

La sedimentación de equilibrio de una proteína de membrana pequeña formador de oligómeros: Efecto de la histidina protonación en pentamérica Estabilidad

Aquí, presentamos protocolos detallados para la espectrometría de masas de intercambio de hidrógeno/deuterio amida de estado sólido (ssHDX-MS) y la espectrometría de masas de marcado fotolítico de estado sólido (ssPL-MS) para proteínas en polvos sólidos. Los métodos proporcionan información de alta resolución sobre la conformación de proteínas y las interacciones en el estado sólido amorfo, que puede ser útil en el diseño de formulaciones.

Espectrometría de masas enfoque para estudiar la estructura de la proteína y las interacciones en liofilizadas Polvos

Este artículo presenta un método para el crecimiento de la biopelícula para en situ ion secundaria tiempo de vuelo espectrometría para mapeo químico en su estado hidratado, habilitado por un reactor de microfluidos, sistema para el análisis en la interfase líquida del vacío. La Shewanella oneidensis MR-1 con la proteína de fluorescencia verde fue utilizado como un modelo.

In Situ Caracterización de Shewanella oneidensis MR1 Biofilms por SALVI y ToF-SIMS

Presentamos un procedimiento para la proyección de imagen en tiempo real y análisis de la composición elemental de las partículas de la bohemita en agua desionizada por líquido en situ microscopia electrónica de barrido.

In Situ Caracterización de partículas de bohemita SEM líquido con agua

Aquí, presentamos un protocolo para investigar la estructura y dinámica del agua superficial en la escala atómica, en cuanto a la proyección de imagen de resolución submolecular, la manipulación molecular y Espectroscopía Vibracional single-bond.

Sondear la estructura y dinámica del agua superficial con túnel microscopía de barrido y espectroscopia

Este protocolo describe un enfoque libre de calibración para cuantificación de proteína homo-Oligomerización en vitro basado en la espectroscopia de fluorescencia de fluctuación comercial luz microscopia. Se muestran los métodos de análisis y configuración correcta adquisición.

Calibración-libre In Vitro cuantificación de proteína Homo-Oligomerización utilizando instrumentación comercial y Software de análisis de brillo libre de código abierto

La espectroscopia de retrodispersión de neutrones ofrece un acceso no destructivo y sin etiquetas a la dinámica ps-ns de las proteínas y su agua de hidratación. El flujo de trabajo se presenta con dos estudios sobre proteínas amiloides: sobre la dinámica resuelta en el tiempo de la lisozima durante la agregación y sobre la dinámica del agua de hidratación de tau en la formación de fibra.

Espectroscopía de neutrones de alta resolución para estudiar la dinámica de picosegundos-nanosegundos de proteínas y agua de hidratación

Aprende a caracterizar películas de proteínas adsorbidas en soluciones acuosas mediante SALVI y espectrometría de masas TOF-SIMS. Este método permite el análisis in situ de biomoléculas en la interfaz sólido-líquido.

In Situ caracterización de proteínas hidratadas en agua por Salvi y TOF-SIMS

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