Name: Las métricas para caracterizar nuevos embrionarias Alargamiento del nematodo Caenorhabditis elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: Aprenda a caracterizar genes que regulan la elongación embrionaria en Caenorhabditis elegans mediante microscopía de contraste de interferencia diferencial y citometría de flujo.

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Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Consejo de Investigación en Ciencias Naturales e Ingeniería (NSERC) de Canadá y la Fundación Canadiense para la Innovación. Gracias al Dr. Paul Mains (Universidad de Calgary, Calgary, Canadá) por la cepa let-502(sb118ts). Algunas de las cepas fueron proporcionadas por el Centro de Genética de Caenorhabditis, financiado por la Oficina de Programas de Infraestructura de Investigación de los NIH (P40 OD010440).

<ol><li>Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Transparent+Window+into+Biology%3A+A+Primer+on+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 200, 387-407 (2015).</li>
<li>Priess, J. R., Hirsh, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+morphogenesis%3A+the+role+of+the+cytoskeleton+in+elongation+of+the+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans morphogenesis: the role of the cytoskeleton in elongation of the embryo.</a> Developmental biology. 117, 156-173 (1986).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tension-induced+mechanotransduction+pathway+promotes+epithelial+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A tension-induced mechanotransduction pathway promotes epithelial morphogenesis.</a> Nature. 471, 99-103 (2011).</li>
<li>Diogon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RhoGAP+RGA-2+and+LET-502%2FROCK+achieve+a+balance+of+actomyosin-dependent+forces+in+C.+elegans+epidermis+to+control+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The RhoGAP RGA-2 and LET-502/ROCK achieve a balance of actomyosin-dependent forces in C. elegans epidermis to control morphogenesis.</a> Development. 134, 2469-2479 (2007).</li>
<li>Gally, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+II+regulation+during+C.+elegans+embryonic+elongation%3A+LET-502%2FROCK%2C+MRCK-1+and+PAK-1%2C+three+kinases+with+different+roles%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Myosin II regulation during C. elegans embryonic elongation: LET-502/ROCK, MRCK-1 and PAK-1, three kinases with different roles.</a> Development. 136, 3109-3119 (2009).</li>
<li>Piekny, A. J., Wissmann, A., Mains, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+morphogenesis+in+Caenorhabditis+elegans+integrates+the+activity+of+LET-502+Rho-binding+kinase%2C+MEL-11+myosin+phosphatase%2C+DAF-2+insulin+receptor+and+FEM-2+PP2c+phosphatase%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Embryonic morphogenesis in Caenorhabditis elegans integrates the activity of LET-502 Rho-binding kinase, MEL-11 myosin phosphatase, DAF-2 insulin receptor and FEM-2 PP2c phosphatase.</a> Genetics. 156, 1671-1689 (2000).</li>
<li>Martin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pix-1+controls+early+elongation+in+parallel+with+mel-11+and+let-502+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">pix-1 controls early elongation in parallel with mel-11 and let-502 in Caenorhabditis elegans.</a> PloS one. 9, e94684(2014).</li>
<li>Sulston, J., Hodgkin, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSulston%2C+J+%22Methods%22">Methods</a>. Wood, W. B. , 587-606 (1988).</li>
<li>Andersen, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Powerful+New+Quantitative+Genetics+Platform%2C+Combining+Caenorhabditis+elegans+High-Throughput+Fitness+Assays+with+a+Large+Collection+of+Recombinant+Strains%5BTitle%5D)+AND+%22G3+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">A Powerful New Quantitative Genetics Platform, Combining Caenorhabditis elegans High-Throughput Fitness Assays with a Large Collection of Recombinant Strains.</a> G3 (Bethesda). 5, 911-920 (2015).</li>
<li>Boulier, E. L., Jenna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+Caenorhabditis+elegans+embryogenesis+using+RNA+interference+and+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of Caenorhabditis elegans embryogenesis using RNA interference and flow cytometry.</a> Methods Mol Biol. 550, 181-194 (2009).</li>
<li>Verster, A. J., Ramani, A. K., McKay, S. J., Fraser, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+RNAi+screens+in+C.+elegans+and+C.+briggsae+reveal+the+impact+of+developmental+system+drift+on+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+genetics%22%5BJournal%5D)">Comparative RNAi screens in C. elegans and C. briggsae reveal the impact of developmental system drift on gene function.</a> PLoS genetics. 10, e1004077(2014).</li>
<li>Ramani, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+majority+of+animal+genes+are+required+for+wild-type+fitness%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The majority of animal genes are required for wild-type fitness.</a> Cell. 148, 792-802 (2012).</li>
<li>So, S., Miyahara, K., Ohshima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+body+size+in+C.+elegans+dependent+on+food+and+insulin%2FIGF-1+signal%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+to+cells+%3A+devoted+to+molecular+%26+cellular+mechanisms%22%5BJournal%5D)">Control of body size in C. elegans dependent on food and insulin/IGF-1 signal.</a> Genes to cells : devoted to molecular & cellular mechanisms. 16, 639-651 (2011).</li>
<li>Dineen, A., Gaudet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta+signaling+can+act+from+multiple+tissues+to+regulate+C.+elegans+body+size%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">TGF-beta signaling can act from multiple tissues to regulate C. elegans body size.</a> BMC developmental biology. 14, 43(2014).</li>
<li>Tan, L., Wang, S., Wang, Y., He, M., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bisphenol+A+exposure+accelerated+the+aging+process+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+letters%22%5BJournal%5D)">Bisphenol A exposure accelerated the aging process in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Toxicology letters. 235, 75-83 (2015).</li>
<li>Yu, Z., Yin, D., Deng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+combinational+effects+between+sulfonamides+and+metals+on+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Ecotoxicology+and+environmental+safety%22%5BJournal%5D)">The combinational effects between sulfonamides and metals on nematode Caenorhabditis elegans.</a> Ecotoxicology and environmental safety. 111, 66-71 (2015).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Este protocolo describe nuevas métricas para caracterizar principios y fases tardías de la elongación embrionario. En la sección 1, el paso crítico es la posible presencia de bacterias en la plataforma. Los embriones se encierran herméticamente entre la almohadilla y el cubreobjetos durante la adquisición de imagen. Sellado de la corredera se requiere para evitar la desecación de los animales durante la adquisición que dura más de dos horas. Para nuestro conocimiento, ninguno de los sellador...

Durante casi 50 años los nematodo Caenorhabditis elegans se estableció como un poderoso modelo para estudiar cuestiones importantes en el desarrollo, la neurobiología, la evolución, las interacciones huésped-patógeno, etc. 1 La fuerza de este modelo en el estudio del desarrollo radica en: su ciclo de vida corta de 3 días; la facilidad con que estos animales pueden ser alterados genéticamente; su transparencia que permite la observación de los desplazamientos y la morfología celular en los animales vivos y su desarrollo que es en su mayoría extrauterino. Las etapas de desarrollo del nematodo implican la embriogénesis y cuatro etapas de larvas (L1 a L4), seguido de la edad adulta. Durante el desarrollo embrionario, la morfogénesis epidérmica atrajo una considerable atención por su capacidad para permitir una mejor comprensión de cómo epitelial células migran como un grupo, cómo se reorganizan sus uniones y modificar su morfología individual, así como su posición relativa dentro de un epitelio funcional.morfogénesis epidérmico se divide en cuatro etapas: intercalación dorsal que consiste en la reorganización de las células epidérmicas dorsal, referido como la hipodermis; recinto ventral, que consiste en la migración de las células hypodermal ventral hacia la línea media ventral que encierra por lo tanto el embrión en una monocapa de células epiteliales; temprana y tardía de elongación transformar el embrión en forma de frijol en larvas vermiformes. Después de la morfogénesis, la portilla de embriones y larvas L1 comienzan a alimentarse utilizando bacterias disponibles en su entorno inmediato. por lo tanto la elongación embrionarias es una fase tardía del desarrollo embrionario. Se compone de la extensión del embrión a lo largo de su eje longitudinal y una reducción de su diámetro transversal. Esto implica una modificación dramática de la forma de las células hipodermis. Alargamiento se divide en una temprana y una fase tardía. La primera fase comienza en la fase de coma y termina cuando los músculos del cuerpo de paredes comienzan a contraer en la etapa de 1.75 veces en wde tipo ILD (en peso) de embriones - correspondiente a los embriones que son 1,75 veces mayor en longitud en comparación con los embriones no alargada. Procesos morfogenéticos que se producen en esta fase son impulsados ​​principalmente por la contracción de los haces de actina filamentosa (FB) situados en el polo apical de las células hipodérmicas que impulsan su alargamiento a lo largo del eje antero-posterior del embrión 2. La contracción de los FB es el control por la fosforilación de las cadenas de miosina luz por tres quinasas LET-502 / rock, MrCk-1 y PAK-1 5. La fase tardía de la elongación, comienza cuando los músculos del cuerpo se vuelven funcionales de pared y empiezan contratación. Se trata de la señalización mechanotransduction de los músculos del cuerpo de pared a las células dorsales y ventrales hipodermis y termina cuando los animales salen del cascarón 3. defectos de elongación se caracterizan generalmente por el porcentaje de animales que mueren como embriones (embriones de letalidad; Emb) y los deteniendo su desarrollo como larvas L1 (fenotipo detención larval; Lva) y ser significativamente más corto que en peso. Identificación de la etapa de detención del desarrollo requiere la observación microscópica de embriones muertos y detenido larvas 3-6. Recientemente se demostró que varios genes, como el regulador de Cdc42 / Rac y el efector pix-1 y pak-1, el control de los procesos morfogenéticos durante la temprana y tardía de elongación 3,7. También demostraron recientemente que los procesos morfogenéticos difieren a lo largo del eje antero-posterior de los embriones durante la elongación temprana 3 7. Estos hallazgos motivaron el desarrollo de nuevas métricas específicamente dirigidas a las etapas tempranas o tardías de elongación y otras métricas que permiten la caracterización de la morfología de los embriones a lo largo de su eje antero-posterior durante la elongación temprano. Estos nuevos métodos consisten en la medición de la longitud de los embriones al principio y al final de elongación temprano, así como la anchura de su élanuncios y colas. 7 Dos protocolos también se han desarrollado para medir la longitud de las larvas recién eclosionadas, sincronizada en fase L1 7. Las cáscaras de huevo de los embriones a proteger contra el tratamiento con hipoclorito alcalino, mientras que las larvas, adultos y bacterias presentes en el medio de cultivo se disuelven por el tratamiento. Este tratamiento se utiliza a continuación para purificar embriones a partir de una población no sincronizada que contiene una mayoría de los bien alimentados adultos 8. la restricción de alimentos se utiliza para sincronizar las larvas recién eclosionadas. La medición de la longitud de estas larvas se usa entonces para detectar defectos de elongación. Esta medición se prefiere sobre la medición de las larvas detenido en placas de cultivo porque las larvas que eclosionan de que no esté totalmente embriones alargados puede recuperar a &quot;longitud normal&quot; cuando la alimentación pero mantendrá su tamaño reducido cuando detenido en la ausencia de alimento. A continuación, presentamos los protocolos que permitan a la medición de la length de alargarse embriones, así como la anchura de la cabeza y la cola utilizando lapso de tiempo DIC microscopía y análisis de imagen (Protocolo 1). También proporcionamos protocolos detallados para medir la longitud de las larvas sincronizado usando análisis de imágenes (Protocolo 2) y citometría de flujo (Protocolo 3).

<table><tbody><tr><td>Agar &nbsp;</td><td>BioShop</td><td>AGR001.500</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa Bioshop</td><td></td><td>AGA001.500</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 (Cloruro de calcio)</td><td>Bio Basic Inc.</td><td>CT1330</td><td></td></tr><tr><td>Colesterol</td><td>Sigma-aldrich</td><td>C8667</td><td></td></tr><tr><td>Solución de limpieza&nbsp;</td><td>union Biometrica</td><td>300-5072-000</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos de vidrio</td><td>Fisherbrand</td><td>12-542B</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de vidrio</td><td>Fisherbrand</td><td>12-552-3</td><td></td></tr><tr><td>Partículas de control de alta fluorescencia</td><td>union Biometrica</td><td>310-5071-001</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4 (fosfato de potasio, dibásico)</td><td>Bio Basic Inc.</td><td>PB0447</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4 (fosfato de potasio, monobásico)</td><td>Bio Basic Inc.</td><td>PB0445</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4 (sulfato de magnesio)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4( fosfato de sodio, dibásico)</td><td>Bio Basic Inc.</td><td></td><td></td>SDB0487</tr><tr><td>NaCl (cloruro de sodio)</td><td>Bio Basic Inc.</td><td>DB0483</td><td></td></tr><tr><td>Goma de dibujo Pebeo 45&nbsp; ml</td><td>p&eacute; b&eacute; o</td><td>PDG033000</td><td>cualquier tienda de arte/manualidades</td></tr><tr><td>Peptone</td><td>BioShop</td><td>PEP403.500</td><td></td></tr><tr><td>Amortiguador de funda</td><td>unión Biometrica</td><td>300-5070-100</td><td></td></tr><tr><td>COPAS Biosort</td><td>unión Biometrica</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

las métricas para caracterizar nuevos embrionarias alargamiento del nematodo<em&gt; caenorhabditis elegans</em

Novel Metrics to Characterize Embryonic Elongation of the Nematode Caenorhabditis elegans

Diseccionar las vías de señalización que controlan la alteración de los procesos morfogénicos durante el desarrollo embrionario requiere métricas robustas y sensibles. La elongación embrionaria del nematodo Caenorhabditis elegans es una etapa tardía del desarrollo que consiste en la elongación del embrión a lo largo de su eje longitudinal. Esta etapa de desarrollo está controlada por la comunicación intercelular entre las células hipodérmicas y los músculos subyacentes de la pared corporal. Estos mecanismos de señalización controlan la morfología de las células hipodérmicas mediante la remodelación del citoesqueleto y las uniones célula-célula. La medición de la letalidad embrionaria y la detención del desarrollo en estadios larvarios, así como la alteración del citoesqueleto y de las estructuras de adhesión célula-célula en células hipodérmicas y musculares, son fenotipos clásicos que se han utilizado durante más de 25 años para diseccionar estas vías de señalización. Estudios recientes requirieron el desarrollo de nuevas métricas dirigidas específicamente a la elongación temprana o tardía y la caracterización de defectos morfogénicos a lo largo del eje antero-posterior del embrión. Aquí, proporcionamos protocolos detallados que permiten la medición precisa de la longitud y el ancho de los embriones en elongación, así como la longitud de las larvas sincronizadas. Estos métodos constituyen herramientas útiles para identificar los genes que controlan la elongación, para evaluar si estos genes controlan tanto las fases tempranas como las tardías de esta etapa y son necesarios de manera uniforme a lo largo del eje antero-posterior del embrión.

Partida, con maletero y Jefe / Relación de la cola de ancho son métricas robustas. Los protocolos descritos aquí se han utilizado con éxito para caracterizar la función de los reguladores y efectores de Rho GTPasas pix-1, pak-1 y dejar-502 durante la elongación temprano <s...

Aquí detallamos protocolos específicamente diseñados para monitorear los defectos morfogénicos que ocurren durante las fases tempranas y tardías de la elongación embrionaria del nematodo Caenorhabditis elegans. En última instancia, estos protocolos están diseñados para identificar los genes que regulan estas fases y caracterizar sus requisitos diferenciales a lo largo del eje antero-posterior del embrión.

Las métricas para caracterizar nuevos embrionarias Alargamiento del nematodo<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Dissecting the signaling pathways that control the alteration of morphogenic processes during embryonic development requires robust and sensitive metrics. ...

El objetivo general de este grupo de experimentos es identificar defectos del desarrollo en el nematodo Caenorhabditis elegans durante las fases temprana y tardía de la elongación embrionaria. Este método puede responder una pregunta clave en el campo de la genética del desarrollo. Permite la caracterización de genes que controlan una etapa tardía del desarrollo embrionario de Caenorhabditis elegans denominada elongación embrionaria.La principal ventaja de este grupo de técnicas es que identifican genes que controlan ya sea la etapa temprana o tardía de la elongación, así como aquellos que controlan procesos morfogenéticos en la parte anterior o posterior del embrión. Demostraré el procedimiento junto con Olivier Rocheleau-Leclair, un antiguo estudiante del laboratorio. Este procedimiento requiere lentes DIC, prisma y un sistema de captura de video para microscopía de lapsos de tiempo de cortes Z.Primero, coloque la muestra montada en el portaobjetos para su observación. Los detalles de preparación se encuentran en el protocolo escrito. Comenzando con baja magnificación, identifique los embriones en sus etapas previas a la morfogénesis.Luego, agregue una gota de aceite y utilice un objetivo más potente. Ahora, identifique los puntos superior e inferior de los embriones para registrar y establezca los parámetros de la pila Z. Configure el lapse de tiempo para tomar imágenes cada dos minutos.Asegúrese de que el obturador de luz esté cerrado entre las adquisiciones de imágenes. El tiempo necesario para capturar el evento temprano de alargamiento puede variar de una a ocho horas, dependiendo del estadio del embrión. Ahora, ejecute el programa de adquisición de imágenes y guarde los resultados.A continuación, continúe con su análisis utilizando el software Fiji ImageJ. Una vez cargadas las imágenes, seleccione el modo de visualización Hyperstick. Ajuste entonces el brillo y el contraste aplicando el Modo Automático de las tablas de búsqueda.A continuación, vaya a Analizar Configuración de Mediciones y establezca los parámetros. Para cada embrión, ajuste la barra de escala Z para enfocarse en la faringe, que es un buen punto de referencia para el punto central del embrión. Ahora, ajuste la barra de escala de tiempo al comienzo de la elongación temprana para un embrión específico.Tome nota de este tiempo. A continuación, calcule la longitud del embrión utilizando la herramienta Analizar Medir para trazar una línea desde la punta de la cola hasta la boca a lo largo de la línea media. Tome nota de esta longitud.A continuación, ajuste el punto temporal al final del evento de elongación temprana y repita la medición de longitud. Utilice estos valores para calcular la duración de la elongación temprana y el aumento de longitud durante la elongación temprana. El cambio en el ancho también puede medirse utilizando una herramienta de línea recta para trazar una línea a través de la línea media de la cabeza.Este es un buen lugar para realizar mediciones consistentes. Haga lo mismo en la línea media de la cola y luego calcule la relación cabeza-cola para cualquier punto temporal y utilice esto para puntuar los cambios en el ancho. Para este protocolo, debe prepararse un citómetro de flujo para el flujo de partículas grandes.Una máquina de este tipo se convierte esencialmente en un clasificador de gusanos. Antes de comenzar, encienda el bloque del láser, el compresor, el clasificador de gusanos y el software. En el software, presione Iniciar y verifique el Control del Láser de Argón.Seleccione el modo de ejecución y deje que el láser se caliente hasta alcanzar una potencia cercana a 10 milivatios, luego seleccione Finalizar. Deje que la presión se equilibre durante al menos 15 minutos. Ahora, prepare la muestra.Primero, cargue 10 microlitros de L1 sincronizados de tipo silvestre en un vidrio de reloj y estime la fracción de huevos muertos bajo un microscopio. Si la estimación es mayor al 20 %, no utilice la muestra. Transfiera aproximadamente 700 microlitros de L1 sincronizados en solución M9 a un tubo de 15 mililitros y agregue yoduro de propidio hasta 10 microgramos por mililitro.Deje que la tinción actúe durante 30 minutos a temperatura ambiente. Ahora, prepare el sistema. Es fundamental ajustar la velocidad de flujo utilizando los Controladores de Flujo de Celda y Muestra a 5,1 y 5,51 respectivamente.Cuando las presiones se estabilicen, haga clic en el cuadro Presión correcta. A continuación, utilice el comando Adquirir y agite manualmente el túbulo para eliminar cualquier burbuja del canal entre la copa de muestra y la cámara de análisis. Finalmente, la ventana de adquisición mostrará que no hay burbujas presentes.Esto también es fundamental para el experimento. Ahora, configure los parámetros para las mediciones de Fluorescentes y TOF. Establezca las escalas para TOF, EXT, Verde, Amarillo y Rojo en 256.Luego, ajuste la ganancia según lo indicado. A continuación, configure el control de PMT en 700 para los canales verde y amarillo y en 900 para el rojo. Ahora, calibre el clasificador de gusanos.Cargue 20 mililitros de partículas de control de propósito general con alta fluorescencia en un vaso de muestra y coloque el vaso en el clasificador. En el software, seleccione Ejecutar partículas de control en Herramientas y haga clic en Adquirir. Verifique que el coeficiente de variación resultante sea mayor o igual a 11 y que la media sea igual a 21 más o menos seis.Si no es así, intente limpiar los túbulos haciendo clic en el botón Limpiar o agitando el canal de flujo. Ahora, salga del modo Control de partículas desmarcando el comando en Herramientas. Una vez finalizada la tinción de los gusanos con yoduro de propidio durante 30 minutos, agregue 10 mililitros de M9 a los gusanos teñidos y mezcle.Incubar durante al menos 15 minutos a temperatura ambiente. Ahora, tomar cinco mililitros de la dilución y añadirlos a un vaso de muestra con 15 mililitros de M9. Pasar esta dilución a través del clasificador de gusanos. Presionar el botón Adquirir y observar la velocidad de flujo.Puede ser necesario ajustar la concentración de gusanos para obtener un buen flujo, entre 15 y 25 objetos por segundo. Una vez que se alcance la concentración adecuada de los objetos, agregue partículas control a la prueba para obtener una concentración final de aproximadamente 0,5 a 1x partículas control en solución. Ahora, ajuste el Parámetro de Gating en el menú Gating a TOF versus Verde.Luego, ajuste los parámetros de clasificación a TOF versus rojo. Esto separará las partículas de control de los animales muertos y los animales vivos. Ahora, ejecute el experimento haciendo clic en Adquirir.Analice aproximadamente 10,000 objetos, lo que correspondería a unos 8,000 animales. Luego detenga el experimento y haga clic en Almacenar para guardar los datos como un archivo de texto para su análisis. Para establecer la robustez de la medición del ancho de la cabeza, se realizó la medición independientemente cinco veces en 12 embriones de tipo silvestre en la etapa de 1,2 pliegues.No hubo varianzas entre los datos al aplicar la prueba de Brown-Forsythe. La reproducibilidad y los efectos por lotes asociados con la medición del ancho de la cabeza se evaluaron mediante imágenes DIC en 4D en tres días diferentes. En estos tres grupos de mediciones, no se encontraron varianzas ni efectos por lotes.Se utilizaron ambos protocolos descritos para evaluar la longitud de las larvas arrestadas en cepas silvestres y mutantes. El análisis de imágenes proporcionó mediciones absolutas de longitud en micrómetros. En este experimento, los mutantes fueron más pequeños que los tipos silvestres.La medición de longitud mediante citometría de flujo arrojó resultados comparables. Sin embargo, estas mediciones fueron mucho más robustas. Por lo tanto, este método debería aclarar efectos más sutiles en poblaciones mutantes.Al realizar este procedimiento, es importante mantener un flujo constante durante el experimento para garantizar una comparación justa entre las cepas analizadas. Una vez dominada la técnica, la medición de la longitud larval mediante citometría de flujo permite la caracterización de 18 a 24 condiciones o cepas mutantes por día, incluso considerando la calibración inicial del equipo. Tras seguir este procedimiento, podemos estudiar la morfología de la célula hipodérmica.Para ello, podemos utilizar un marcador fluorescente y microscopía confocal para caracterizar la función molecular de los genes identificados. No olvide que el yoduro de propidio puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones, como el uso de guantes y gafas de protección, al realizar este procedimiento.

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Este estudio describe las mediciones cuantitativas del tamaño y localización sináptica, la morfología muscular y la forma mitocondrial en C. elegans utilizando herramientas de procesamiento de imágenes disponibles libremente. Este enfoque permite que estudios futuros en C. elegans comparen cuantitativamente la extensión de los cambios estructurales de tejidos y orgásis como resultado de mutaciones genéticas.

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Este trabajo describe un protocolo de semi-alto rendimiento que permite imágenes simultáneas de lapso de tiempo 3D de embriogénesis en embriones de 80-100 C. elegans en una sola carrera nocturna. Además, se incluyen herramientas de visualización y procesamiento de imágenes para agilizar el análisis de datos. La combinación de estos métodos con cepas de reportero personalizadas permite un seguimiento detallado de la embriogénesis.

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Aquí, presentamos un método general para determinar la viabilidad embrionaria y el número total de embriones producidos (cría) utilizando el organismo modelo C. elegans.

Medición de la viabilidad embrionaria y el tamaño de la cría en Caenorhabditis elegans

Aprenda a caracterizar genes que regulan la elongación embrionaria en Caenorhabditis elegans mediante microscopía de contraste de interferencia diferencial y citometría de flujo.

Las métricas para caracterizar nuevos embrionarias Alargamiento del nematodo

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