Gradiente de tensión Chip para estimulantes comportamientos celulares en hidrogel cargadas de celulares

El objetivo general de este chip de deformación de gradiente es proporcionar un enfoque simple para generar deformaciones estáticas de gradiente no continuo en un hidrogel 3D para la investigación de los comportamientos celulares en una serie de condiciones de deformación. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la bioingeniería, como los estímulos de la diferenciación de células madre y la regulación de la alineación celular para el desarrollo de órganos de tejidos artificiales. La principal ventaja de esta técnica es que se pueden aplicar varias deformaciones sobre la capa celular e hidrogeles en el mismo microambiente para comparar el comportamiento celular.

La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos de preparación del chip son difíciles de aprender, ya que la luz debe completarse en tres o cuatro horas para que la base del experimento garantice una alta variabilidad celular. Pesa 10 gramos de gelatina en polvo y añádela a un matraz de vidrio con 100 mililitros de solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco, o DPBS. Coloque una barra de agitación magnética en el matraz y coloque el matraz en una placa caliente de agitación.

Cubra el matraz con papel de aluminio para evitar la evaporación del agua. Ajuste la temperatura de la placa caliente a 50 a 60 grados y el agitador a 100 RPM durante una hora para disolver la gelatina en polvo. Después de que la gelatina se haya disuelto, agregue ocho mililitros de anhídrido metacrílico muy lentamente con una pipeta.

Déjalo reaccionar a 60 grados centígrados durante tres horas. A continuación, añada DPBS precalentado en el matraz hasta un volumen final de 500 mililitros. Deje que la solución se mezcle bien durante 15 minutos para detener la reacción.

Mientras tanto, corte una membrana de diálisis en varios tubos de 25 milímetros de largo. Sumérgelos en agua desionizada durante 15 minutos. Y haga un nudo para cerrar un extremo de los tubos de diálisis.

Cargue la cantidad adecuada de la solución polimérica en los tubos de diálisis y cierre el otro extremo. Luego coloque los tubos llenos en un vaso de plástico de cinco litros con agua desionizada durante una semana. Renueve el agua desionizada dos veces al día y mantenga la solución a 40 a 50 grados centígrados durante el proceso de diálisis.

Después de la diálisis, recoja la solución de los tubos en una botella de vidrio de 500 mililitros. Vierta aproximadamente de 450 a 500 mililitros de solución en una taza de filtro de 500 mililitros. Y aplique un vacío para forzar que la solución pase a través de la membrana del filtro para la esterilización.

A continuación, transfiera el polímero esterilizado a varios tubos esterilizados de 50 mililitros. Transfiera el polímero esterilizado a varios tubos esterilizados de 50 mililitros y guárdelos en un congelador a menos 80 grados Celsius durante tres a cinco días. Liofiliza el polímero a menos 80 grados Celsius durante una semana usando un liofilizador para formar GelMA, que luego se puede almacenar en un congelador de menos 80 grados Celsius.

Para la fabricación de chips, primero prepare el polimetacrilato o PMMA, jugado y moldeado como se describe en el protocolo de texto. A continuación, prepare la cubierta de PTMS y el tapón de PTMS mezclando adecuadamente 30 gramos de elastómero de PTMS y tres gramos de agente de curado de PTMS. Desgasificar la mezcla en una cámara de vacío durante una hora.

Vierta de 1,8 a dos gramos de la mezcla en el molde de PMMA para la cubierta de PTMS. También use la cantidad adecuada para llenar cada cavidad para el molde de PMMA para el tapón de PTMS. Además, funda 10 gramos de mezcla de PTMS sin curar en un plato de plástico de 10 centímetros en blanco.

Coloque estos moldes en una cámara de vacío para desgasificar durante 30 minutos. Cura el PTMS durante dos horas a 80 grados centígrados. Después de enfriar el PTMS curado en el molde, separe las cubiertas de PTMS y los tapones de PTMS de los moldes de PMMA.

A continuación, perfore dos orificios con diámetros de unos tres milímetros en los extremos de los canales de flujo de las cubiertas PTMS. Corte la hoja de PTMS moldeada a partir de la placa de plástico de 10 centímetros en muchos cubos de un centímetro por un centímetro. Y perfora un agujero de tres milímetros en cada cubo PTMS.

Pegue dos cubos de PTMS sin curar de un centímetro por un centímetro en las aberturas de la cubierta de PTMS para que sirvan como depósitos medianos y para ayudar en el proceso de curado de los patrones de hidrogel circular degradado. Luego cure durante una hora a 80 grados centígrados. A continuación, pegue las cubiertas de PTMS con los dos depósitos de PTMS en un portaobjetos recubierto de TMSPMA.

Para ello, trate previamente el lado de unión de la cubierta de PTMS y el portaobjetos recubierto de TMSPMA bajo una máquina de plasma de oxígeno durante 90 segundos de tratamiento con plasma de oxígeno. Póngase en contacto con la superficie tratada con plasma de las cubiertas de PTMS y el portaobjetos TMSPMA y presiónelos estrechamente para una unión permanente a través de la formación del enlace de silicio, oxígeno y silicio. Imprima una fotomáscara imprimiendo el diseño establecido en una película transparente.

A continuación, corte la fotomáscara impresa a 25 milímetros por 37,5 milímetros. Pesar 25 miligramos de GelMA liofilizado en 0,3 mililitros de medio de cultivo celular precalentado en un tubo de microcentrífuga negra de 1,5 mililitros. Coloque el tubo de microcentrífuga en una placa calefactora de agitador de laboratorio hasta que el GelMA se disuelva en el medio.

Agregue 50 miligramos de fotoiniciador a un mililitro de DPBS en un tubo de microcentrífuga. Y colócalo en un horno a 80 grados centígrados durante 15 minutos o hasta que el fotoiniciador se haya disuelto. Agregue 25 microlitros del fotoiniciador al 10% al tubo de microcentrífuga.

Pipetear varias veces para mezclar bien. A continuación, cuente tres millones de células NIH3T3 utilizando un contador de células automatizado. Después de centrifugar la suspensión a 200 Gs durante cinco minutos, desechar el sobrenadante y resuspender las células en 175 microlitros de medio de cultivo celular.

Agregue la solución celular al tubo de microcentrífuga para obtener una solución de celda prepolímero de 5% de GelMA, 0.5% de fotoiniciador y aproximadamente seis millones de células 3T3 por mililitro. Después de mezclar, cargue 100 microlitros de prepolímero celular en una jeringa de 100 microlitros. Alinee manualmente una pieza de la fotomáscara en el portaobjetos inferior del chip de deformación de gradiente esterilizado.

Y simplemente fije la posición usando una pequeña gota de agua desionizada en el medio. Conecte la microjeringa de 100 microlitros, cargada con solución de celda de prepolímero a la entrada del chip. A continuación, coloque 50 microlitros de solución de celda de prepolímero en el canal de flujo con la microjeringa y conecte la salida con un enchufe PTMS.

Inyecte 40 microlitros adicionales de solución para crear una protuberancia convexa en la membrana circular de PTMS. Mueva el chip con la fotomascarilla, la microjeringa y el enchufe PTMS debajo de una lámpara UV. Y exponerlo durante 30 a 45 segundos para reticular el hidrogel circular concéntrico en la cámara de fluidos.

Después de la reticulación, retire el tapón de PTMS y la microjeringa para liberar la presión del líquido. Use una jeringa de un mililitro cargada con DPBS precalentado para lavar las resinas no reticuladas tres veces enjuagándolas desde la entrada hasta la salida. A continuación, llene el canal de flujo con unos 100 microlitros de medio de cultivo celular.

Coloque el chip en una placa de cultivo esterilizada y cultive en una atmósfera de 5% de dióxido de carbono a 37 grados Celsius durante una semana. Refresca el medio todos los días. Tome imágenes de tres chips en el día cero después de cuatro horas de incubación como grupo de control.

Y tres chips en el tercer día como el conjunto experimental utilizando un microscopio con un objetivo de 20 veces. Mida el ancho de línea de cada hidrogel desde la línea uno hasta la línea 12 usando un software para calcular las manchas de la compresa. Aquí se muestran resultados representativos de patrones de hidrogel con cero microlitros y 40 microlitros sobre inyección, después de la reticulación UV y cuatro horas de incubación.

El ancho de línea del hidrogel 3D en el control de no sobreinyección se ve uniforme como se esperaba. Sin embargo, los patrones de hidrogel con 40 microlitros sobre la inyección dan un gradiente de ancho de línea de hidrogeles que disminuye de la línea uno a la línea 12. Después de tres días de incubación, las células del hidrogel se extienden en diferentes direcciones.

Las células de la línea uno se alinean a lo largo de la dirección radial debido a la estimulación de la elongación del hidrogel. Por el contrario, las células de la línea 12 se alinean a lo largo de la forma de hidrogel, donde la señal de geometría domina la alineación celular. No hay una alineación celular específica en la línea 7 donde las dos señales de alineación celular de la línea uno y la línea 12 se equilibran entre sí.

Una vez que se mide el microentorno de las deformaciones de gradiente en hidrogel 3D, el chip de deformación de gradiente puede hacerlo en dos horas si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar esterilizar el chip de deformación de gradiente antes de cargar la solución de prepolímero celular. También limpie a fondo la superficie del chip con etanol al 75% antes de colocar los chips en la incubadora de cultivos celulares.

Después de ver este video, debería tener una muy buena comprensión de cómo generar un chip de deformación de gradiente para investigar el comportamiento de las células bajo diferentes cepas imperiales.