En Detección de la cara del óxido nítrico y superóxido en la capa endotelial de las arterias intactas

El objetivo general de este procedimiento es detectar simultáneamente aniones de óxido nítrico y superóxido intracelulares utilizando el colorante de fluorescencia DAF-2DA y DHE en aortas de ratón intactas recién aisladas. Este método puede ayudar en el laboratorio a recuperar el caso del investigador en el campo de la fisiología cardiovascular, como la disfunción endotelial y el desacoplamiento de eNOS. La principal ventaja de esta técnica es proporcionar un método sencillo y preciso para la detección directa ex vivo y la visualización de aniones óxido nítrico y superóxido simultáneamente en vasos sanguíneos intactos.

Para este protocolo, construya un sistema de baño de órganos que pueda calentarse a 37 grados centígrados y airearse con un 95% de oxígeno y un 5% de dióxido de carbono de un tanque de gas carbón. Para comenzar, prepare suficiente tampón de bicarbonato Krebs-Ringer fresco según sea necesario para bañar los tejidos de interés. Por ejemplo, se necesitan 200 mililitros para las aortas en un experimento.

Encienda el sistema de baño de órganos y ajuste el control de calor a 37 grados centígrados. Después de lavar las cámaras con el tampón de bicarbonato Krebs-Ringer, agregue cinco mililitros del tampón de bicarbonato Krebs-Ringer a cada cámara y encienda el gas para airearlo con un 95% de oxígeno y un 5% de dióxido de carbono durante 30 minutos. Mantenga las cámaras cubiertas.

Además, prepare una botella de tampón de bicarbonato Krebs-Ringer helada con aireación. Después de extirpar la aorta torácica, sumerja inmediatamente todo el tejido en una placa con tampón Krebs-Ringer helado. Bajo un microscopio de disección, extirpe el corazón y el arco aórtico mientras mantiene el segmento aórtico torácico en el tampón.

Luego, diseccione la aorta libre de tejido perivascular adherido con tijeras quirúrgicas y fórceps. A continuación, use fórceps para agarrar el borde del tejido y enjuague suavemente la sangre de la luz vascular con un tampón Krebs-Ringer helado administrado por una jeringa. Los coágulos de sangre en la luz vascular deben eliminarse porque pueden causar señales artificiales e interferir con las señales fluorescentes, mientras que al mismo tiempo, se debe controlar la fuerza de lavado para no dañar la capa endotelial.

Ahora, corta los anillos aórticos limpios en segmentos de tres milímetros de largo. Después de preparar los anillos aórticos limpios, tíñelos. Tocando solo el lado adventicio de los anillos aórticos con fórceps, sin sujetar los vasos sanguíneos, transfiera los segmentos aórticos limpios a las cámaras de baño de órganos preparadas.

Deje que las arterias se equilibren en el tampón durante 30 minutos. Después de media hora, agregue acetilcolina al baño de órganos para dar una concentración final de un micromolar e incube las arterias durante 10 minutos con la acetilcolina. Mientras tanto, en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros, prepare un mililitro de solución de tinción con tampón Krebs precalentado.

Luego, envuelva el tubo en papel de aluminio para minimizar la exposición a la luz y manténgalo a 37 grados centígrados. Después de la estimulación con acetilcolina, transfiera los anillos aórticos del baño de órganos al tubo de solución de tinción y déjelos incubar durante 30 minutos en la oscuridad con aireación. Todos los pasos a partir de este punto deben realizarse con una exposición mínima a la luz.

A continuación, transfiera los anillos aórticos a un nuevo tubo lleno de tampón Krebs durante un minuto. Realice este paso de lavado tres veces. A continuación, fije los anillos aórticos en un baño de solución de paraformaldehído al 4% durante 30 minutos a temperatura ambiente.

Después de la etapa de fijación, transfiera los anillos a la solución DAPI durante tres minutos a temperatura ambiente para aplicar la contratinción. Luego, lave los anillos aórticos con PBS tres veces durante un minuto por lavado. Siempre hay que estar atento a la fragilidad del tejido endotelial al mover los anillos.

Bajo un microscopio, corte los anillos aórticos longitudinalmente con unas tijeras microquirúrgicas en un portaobjetos. Luego, elimine el exceso de líquido en la aorta mientras la mantiene húmeda. Forzar las aortas enrolladas contra un portaobjetos con el endotelio hacia abajo sobre el portaobjetos de vidrio mediante el uso de dos pinzas microquirúrgicas.

En este proceso, no mueva las aortas hacia adelante y hacia atrás. Este paso es muy crítico, pero no es fácil de operar. Es mejor practicar mucho antes del experimento formal.

Luego, deje caer el medio de montaje sobre la aorta. Cubre el portaobjetos y séllalo con esmalte de uñas. Después de secar al aire en la oscuridad, tome imágenes de los portaobjetos con microscopía confocal.

Utilice una velocidad de escaneo de 200 hercios, una resolución de 1024 x 1024 píxeles y un tamaño de pila z de un cuarto de micra. Para observar el DAF-2DA, utilice un láser de argón, ajuste la fluorescencia de excitación a 488 nanómetros y la detección de emisiones a 515 nanómetros. Para observar el DHE, establezca la fluorescencia de excitación en 514 nanómetros y establezca la detección en 605 nanómetros.

Después de enfocar con aumentos de 10x, ajuste el objetivo a aumentos de 40x. Ahora, defina el rango de la capa endotelial ajustando la posición z en el panel de control, utilizando los núcleos teñidos con DAPI como puntos de referencia. A continuación, escanee desde la capa endotelial en el borde del lumen a través de todo el grosor de la capa endotelial y grabe las imágenes.

Escanee al menos tres campos de visión diferentes para cada muestra. Los ratones jóvenes C57 negro 6 se volvieron obesos al ser alimentados con una dieta alta en grasas durante 14 semanas. Los controles fueron alimentados con una comida normal.

Después de 14 semanas, se examinaron las arterias torácicas. Antes de la tinción, los tejidos se expusieron al inhibidor de eNOS L-NAME durante una hora en un nanomolar. La señal de DAF-2T, que se ve en verde, se convierte de DAF-2 sin fluorescencia por óxido nítrico.

Por lo tanto, la tinción sugiere la presencia de óxido nítrico en una célula. De manera similar, cuando se oxida por superóxido, el DHE emite una señal fluorescente roja. Por lo tanto, las muestras que muestran más color rojo tienen más superóxido en las células.

La cuantificación de las imágenes de fluorescencia confocal reveló una disminución en la producción de óxido nítrico y un aumento en la generación de superóxido sensible a L-NAME en la capa endotelial aórtica de los ratones alimentados con la dieta alta en grasas. Estos datos respaldan la idea de que el desacoplamiento de la eNOS se produce con la obesidad. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo detectar el óxido nítrico y los aniones superóxido, y el uso de tintes fluorescentes en vasos sanguíneos intactos.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en seis horas si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener la capa endotelial intacta durante todo el procedimiento de la operación. Y siempre sumerja los vasos sanguíneos en el tampón Krebs-Ringer para mantener vivas las células endoteliales antes de la etapa de fijación.

Combinando con este procedimiento se pueden realizar otras medidas como el análisis de las respuestas vasomotoras de los vasos sanguíneos con el fin de responder a preguntas adicionales como la función fisiológica de las células endoteliales en la regulación del tono vascular.