Name: Una alta resolución Método de Seguimiento activación fosforilación dependiente de IRF3 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 44 s
Description: Aprende a analizar la activación dependiente de fosforilación del factor de transcripción IRF3 mediante SDS-PAGE de alta resolución y native-PAGE con inmunoblot. Esta técnica sensible permite distinguir diferentes formas activadas de IRF3 en células humanas y tejidos de ratón.

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Los autores agradecen a los miembros anteriores y actuales del laboratorio por el desarrollo de los protocolos. El trabajo fue apoyado por fondos de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (CIHR) [subvención # MOP-130527] y del Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá [NSERC-355306-2012]. NG ha recibido una Cátedra de Investigación de Canadá de Nivel II. AR es becario del programa de formación de la Red de Investigación en Salud Respiratoria del Fonds de la recherche du Québec-Santé (FRQS).

NOTA: El protocolo se describe aquí usando células A549 infectadas con el virus Sendai (VSe). Sin embargo, el protocolo para SDS-PAGE y PAGE nativa también trabaja con todos los tipos de células humanas y murinas probado hasta ahora, en particular células mieloides estimuladas con diferentes 9,15,19,24,25 estímulos IRF3 activador. 1. Infección de células A549 <ol><li> Mantener las células A549 en cultivo en una placa de 15 cm a 37 ° C / 5% de CO 2 en 20 ml F12K medio / Ham que contenía 10% de suero inactivado por calor fetal bovino (HI-FBS) y 1% de L-glutamina (F12K completa / Jamón medio). NOTA: Todas las soluciones utilizadas para la cultura y los tratamientos de células deben ser estériles. </li><li> A las 24 h antes de la infección, aspirar el medio y se lavan las células con 10 ml de agua destilada salina tamponada con fosfato (D-PBS) a TA. </li><li> Añadir 1 ml de solución de tripsina-EDTA 0,25% a cada placa para cubrir las células y se incuba a 37 ° C durante 3 min. </li><li> Detener la incubación tan pronto como sea ªcélulas electrónicos empiezan a desprenderse de la placa tocando suavemente la placa con una mano. Inactivar la tripsina mediante la adición de 10 ml de medio F12K / jamón completa pre-calentado por placa y transferir las células a un tubo cónico de 15 ml. </li><li> Centrifugar a 350 xg durante 3 min a TA. Eliminar el sobrenadante y resuspender el sedimento de células en 8 ml de medio F12K / jamón completa para obtener una suspensión de células individuales homogénea. </li><li> Contar las células utilizando un hemocitómetro. Semilla las células a una densidad de 1 x 10 6 células por placa de 60 mm en 4 ml de F12K medio / Jamón precalentado completa. Incubar durante 20 a 24 horas a 37 ° C / 5% de CO 2. Después de 20 a 24 h, las células forman una monocapa confluente 90% (lo que corresponde a 1,5 x 10 6 células). </li><li> Retire el medio y se lavan las células con 2 ml de F12K libre de suero / medio Jamón (SFM). Añadir 2 ml de SFM fresco por placa de 60 mm. </li><li> Descongelar una alícuota de virus Sendai (SEV) (almacenado en alícuotas a -80 ° C) en el hielo y agitar brevemente. </li><li> Diluir ªe virus en precalentado SFM para obtener 60 HAU / 100 l. Mezclar pipeteando arriba y abajo suavemente y añadir 100 l de virus diluido por placa para realizar la infección en 40 HAU / 10 6 células. No agregue virus en la placa de control no infectado. </li><li> Se incuban las células en la incubadora a 37 ° C / 5% de CO 2. Agitar las placas a mano 3 o 4 veces, o utilizando un agitador orbital o balanceo automático colocado directamente en la incubadora, durante la primera hora de la infección. </li><li> A las 2 horas después de la infección, añadir 2 ml de medio F12K / Ham que contenía 20% HI-FBS para obtener una concentración final de 10% HI-FBS. </li><li> Se incuban las células en la incubadora a 37 ° C / 5% de CO 2 durante 1, 4 y 7 horas para llegar a los tiempos totales de infección de 3, 6 y 9 horas, respectivamente. En cada uno de estos puntos de tiempo, vaya al paso 2.1. </li></ol> 2. Preparación de extractos de células enteras (EBB) <ol><li> Retire el medio de infección. Recoger las células por raspado en 1 mlde helado D-PBS y transferir la suspensión celular a un tubo de centrífuga de 1,5 ml pre-enfriada. </li><li> Sedimentar las células por centrifugación a 16.000 xg a 4 ° C durante 20 segundos y decantar cuidadosamente todos los restos de D-PBS. NOTA: En este paso, el sedimento celular puede estar directamente sometió a una extracción de proteínas o-flash congelado en nitrógeno líquido o baño de hielo / etanol seco y se almacenaron a -80 ° C hasta que la lisis. </li><li> Preparar el tampón de lisis que contiene 50 mM HEPES pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 5 mM, 10% de glicerol y 1% Nonidet P-40 en agua desionizada (ddH 2 O). Añadir extemporáneamente proteasa (1 mg / ml de leupeptina y / ml de aprotinina 2 g) inhibidores de la fosfatasa y (fluoruro de sodio 5 mM, 1 mM activa ortovanadato de sodio, 2 mM p-nitrofenil fosfato y 10 mM β-glicerofosfato pH 7,5). NOTA: El tampón de lisis sin inhibidores se puede almacenar a 4 ° C. Un protocolo específico para la activación de ortovanadato de sodio se describe en la Tabla de reactivos específicos / EquipmeNuevo Testamento. </li><li> Resuspender el sedimento celular en 70 l de tampón de lisis. Típicamente la concentración lisado será de alrededor de 2 mg / l. </li><li> Incubar en hielo durante 20 min. Flash congelar el lisado por incubación en un baño de nitrógeno líquido durante 15 seg. Descongele el lisado a temperatura ambiente hasta que se derrita por completo y agitar durante 10 segundos. Repita el deshielo ciclo de congelación / / vórtice 3 veces. <ol><li> Alternativamente, lleve a cabo la etapa de congelación en un / baño de hielo seco de etanol durante 1 min. </li></ol></li><li> Centrifugar a 16.000 xga 4 ° C durante 20 min. Transferir el sobrenadante (correspondiente a la WCE) a un nuevo tubo de centrífuga de 1,5 ml pre-enfriada. Mantenga el EBB en hielo en todo momento. </li><li> Cuantificar proteínas utilizando cualquier procedimiento de cuantificación de proteínas compatible con el tampón de lisis tal como a base de Bradford ensayo de proteínas 26. </li></ol> 3. Resolución del EBB por Alta Resolución SDS-PAGE <ol><li> Prepare tres desnaturalización geles de electroforesis. <ol><li> Para la detección deFormas IRF3, vierta dos geles de un mínimo de 16 cm de longitud con un gel de separación compuesta de 7,5% de acrilamida / bis-acrilamida (37,5: 1), 375 mM Tris-HCl pH 8,8 (RT), 0,1% de dodecilsulfato de sodio (SDS ), persulfato de 1% de amonio y 0,1% TEMED en ddH 2 O y un gel de apilamiento compuesta de 4% de acrilamida, 62,5 mM Tris-HCl pH 6,8 (RT), 0,05% SDS, persulfato de amonio 1% y 0,1% TEMED en ddH 2 O. ¡Precaución! La acrilamida, TEMED y SDS son tóxicos y / o irritantes. Use guantes de protección y manipular bajo una campana de humos. </li><li> Para la detección de las proteínas SeV, vierta una gel de un mínimo de 8,5 cm de longitud con características similares al gel se describe en 3.1.1, excepto que el gel de separación contiene 12% de acrilamida. </li></ol></li><li> Desnaturalizar la WCE obtenido en la etapa 2.6 mediante la adición de 1: 4 (v / v) de tampón 5x de carga (Tris-HCl 125 mM pH 6,8 (RT), 10% de SDS, 20% (v /) de glicerol p, 0,0005% de azul de bromofenol y 25% β-mercaptoetanol en ddH 2 O) seguido de calentamiento a 100 °C durante 10 min. Vuelta rápida de los tubos para reducir la condensación que se forma en la tapa. ¡Precaución! β-mercaptoetanol es tóxico por inhalación. Use guantes de protección y manipular bajo una campana de humos. </li><li> Montar los geles en el aparato de la migración. Llenar las cámaras superior e inferior con el funcionamiento de tampón que contiene 25 mM Tris-base, 0,1% SDS y glicina 192 mM en agua destilada (dH 2 O). </li><li> Cargar 14 l de patrón de peso molecular en un pocillo de cada gel 16 cm y 7 l de patrón de peso molecular en un pocillo del gel 8,5 cm. Cargar 30 g de WCE desnaturalizado (preparado como se describe en el paso 3.2) por pocillo de los dos geles preparados en la etapa 3.1.1 para la detección de formas IRF3. Carga de 8 - 10 g de WCE desnaturalizado (preparado como se describe en el paso 3.2) por pocillo en el gel preparado en la etapa 3.1.2 para el análisis de SeV. </li><li> Ejecutar los geles a 30 mA de corriente constante hasta que el frente de migración alcanza la parte inferior del gel. NOTA: La migración suele durar approximately 3 h para un gel de 16 cm y 45 min para un gel de 8,5 cm. </li><li> Proceder a la transferencia a membranas de nitrocelulosa (paso 5). </li></ol> 4. Análisis de IRF3 Dimerización por Native PAGE NOTA: Este método fue descrito originalmente por el grupo del Dr. T. Fujita 27. <ol><li> Preparar los superiores (-) e inferior (+) tampones de electroforesis cámara. El tampón de cámara superior consta de 25 mM Tris-HCl pH 8,4 (RT), glicina 192 mM y 1% desoxicolato de sodio (DOC) en ddH 2 O. El tampón de cámara inferior contiene 25 mM Tris-HCl pH 8,4 (RT) y 192 mM glicina en ddH 2 O. NOTA: Los tampones superior e inferior de la cámara de electroforesis se pueden almacenar a 4 ° C hasta su uso. Sin embargo, asegúrese de que están pre-calentado a temperatura ambiente antes de realizar la electroforesis. </li><li> Verter un gel no desnaturalizante de resolución de un mínimo de 8,5 cm de longitud que contiene 7,5% de acrilamida / bis-acrilamida (37,5: 1), 375 mM Tris-HCl pH 8,8 (RT), 1% municiónpersulfato nio y 0,1% TEMED en ddH 2 O. </li><li> Pre-correr el gel a 40 mA de corriente constante durante 30 minutos en hielo. Pulse el aparato en funcionamiento en el hielo aproximadamente al nivel del tampón de electroforesis cámara baja. Es importante que el gel no está en el hielo. </li><li> Durante la pre-carrera, mezclar WCE mantuvo en hielo con 2x-PAGE nativa tampón de carga 1: 1 (v / v) que contiene 125 mM Tris-HCl pH 6,8 (RT), 30% de glicerol y 0,1% de azul de bromofenol en ddH 2 O. </li><li> Carga de 8 - 10 g WCE (preparado como se describe en el paso 4.4) inmediatamente al final de la pre-carrera. </li><li> Correr el gel a 25 mA de corriente constante en el hielo, como se describe anteriormente para la pre-carrera, hasta que el frente de migración alcanza la parte inferior del gel (aproximadamente 40 min). </li></ol> 5. Análisis de inmunotransferencia IRF3 Especies <ol><li> Preparar el tampón de transferencia que contiene 25 mM Tris-Base y glicina 192 mM en ddH 2 O. Refrigere el tampón de transferencia a 4 ° C antes de su uso. </li><li> Seco tres piezas de membrana de nitrocelulosa cortan a un tamaño ligeramente mayor que los geles en una caja de plástico / vidrio que contiene el tampón de transferencia. Indicar la orientación de la membrana mediante la reducción de una esquina. El tampón de transferencia puede ser reutilizado 3 veces. Almacene el tampón a 4 ° C entre usos. </li><li> Uncast los geles (SDS-PAGE y-PAGE nativa) y cortar una esquina de cada gel para la orientación adecuada. <ol><li> Para-PAGE nativa, incubar el gel a temperatura ambiente con agitación suave durante al menos 30 min en el tampón de SDS-PAGE corriente para eliminar el DOC antes de transferir a la memoria tampón de transferencia. </li></ol></li><li> Incubar los geles (SDS-PAGE y-PAGE nativa) en el tampón de transferencia durante 5 - 10 min. </li><li> Montar un sándwich de transferencia por gel en un casete de transferencia con la membrana hacia el electrodo positivo (papel pista / filtro de espuma / membrana / gel / filtro de papel / almohadilla de espuma). Tenga cuidado de eliminar todas las burbujas entre las capas del sandwich. </li><li> Realizar la transferencia como se recomienda by el fabricante para el aparato de transferencia utilizado. NOTA: Realice todas las incubaciones y lavados en los próximos pasos sobre una plataforma de agitación oscilante u orbital. </li><li> Al final del tiempo de transferencia, las membranas se incuban durante 15 min en la solución de fijación que contienen ácido acético 7%, etanol al 40% y 3% de glicerol en ddH 2 O. Lave las membranas 3x 5 min en PBS (NaCl 137 mM, 2,7 mM KCl, 10,2 mM Na 2 HPO 4 y 1,8 mM KH 2 PO 4 en dH 2 O). ¡Precaución! El ácido acético es tóxico, irritante e inflamable. Use guantes de protección y manipular bajo la campana de humos. NOTA: La solución de fijación se puede reutilizar varias veces. </li><li> Para la membrana-PAGE nativa vaya directamente al paso 5.11. </li><li> Enjuagar las tres membranas SDS-PAGE rápidamente en dH 2 O antes de incubarlos durante 1 min en solución Ponceau roja que contiene 6,57 mM rojo Ponceau y ácido acético al 1% en ddH 2 O. NOTA: La solución ponceau rojo puede ser r<html> eused varias veces. </li><li> Enjuague las membranas en dH 2 O hasta que el fondo es lo suficientemente blanca para ver las bandas de proteínas teñidas de rojo. Tenga en cuenta los marcadores con un lápiz y cortar el exceso de membrana que rodea las proteínas. Destain las membranas mediante incubación durante 5 min en PBS con agitación. </li><li> Se incuban las membranas durante 1 hora a RT o O / N a 4 ° C en la solución de bloqueo (PBS que contiene 0,05% de Tween 20 y la leche en polvo al 5% sin grasa (PBS-T-leche). Lavar las membranas 3x 5 min en PBS-T. NOTA: El lavado PBS-T es opcional y sólo estrictamente necesario al aplicar anticuerpos diluidos en PBS-T que contiene 5% de albúmina de suero bovino (PBS-T-BSA) (Figura 1 y Tabla 1) en el próximo paso. </li><li> Incubar las cuatro membranas (desde SDS-PAGE y-PAGE nativa) con los anticuerpos primarios de acuerdo con el orden secuencial detalla en la Figura 1 y en la Tabla 1. Realizar 5x 5 min lavados en PBS-T. </li></ol>&quot;&gt; <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53723/53723fig1.jpg" /> Figura 1. Secuencia de análisis inmunoblot. El esquema describe los geles de SDS-PAGE y-PAGE nativa individuales requeridas para detectar las diversas formas fosforiladas y monoméricos / dimérica IRF3. El orden específico de anticuerpos aplicadas a la membrana resultante de cada gel en el procedimiento de inmunotransferencia se describe. Tenga en cuenta que los anticuerpos anti-actina se utilizó por primera vez para asegurar la igualdad de carga de las muestras antes de aplicar cualquier otra anticuerpos específicos. La secuencia alterna, con anticuerpos anti-actina se aplica después de los anticuerpos anti-fosfo-IRF3, también funciona. Stripping se utiliza entre anti-actina y anticuerpos anti-SEV o entre anticuerpos anti-IRF3 debido a las dimensiones de las señales superpuestas anti-fosfo-IRF3 y. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53723/53723fig1large.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <table fo:keep-together.Dentro-page = &quot;1&quot;&gt; <tbody><tr><td> Los anticuerpos primarios </td><td> Dilución </td><td> Tampón de dilución </td><td> Incubación </td><td> Los anticuerpos secundarios </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Anti-actina </td><td> 1 / 10.000 </td><td> PBS-T-BSA </td><td> 15 min a RT </td><td> Anti-ratón </td><td> Utilizar después de SDS-PAGE Antibodyies diluidas se pueden reutilizar varias veces si se almacena a 4 ° C en presencia de 0,02% azida sódica. </td></tr><tr><td> Anti-IRF3-P-Ser386 </td><td> 1/200 </td><td> PBS-T-BSA </td><td> O / N a 4 ° C </td><td> Anti-conejo </td><td> Utilizar después Nativo-PAGE. No se recomienda volver a utilizar el anticuerpo diluido </td></tr><tr><td> Anti-IRF3-P-Ser396 </td><td> 1 / 10.000 </td><td> PBS-T-BSA </td><td> O / N a 4 ° C </td><td&gt; Anti-conejo </td><td> Utilice después de SDS-PAGE. No se recomienda volver a utilizar el diluyó anticuerpo anti-IRF3-P-396 también está disponible de señalización celular. Dilución óptima se definió como 1 / 1.000 para este anticuerpo, pero puede variar entre los lotes. </td></tr><tr><td> Anti-IRF3-P-Ser398 </td><td> 1 / 10.000 </td><td> PBS-T-BSA </td><td> O / N a 4 ° C </td><td> Anti-conejo </td><td> Utilice después de SDS-PAGE. No se recomienda volver a utilizar el anticuerpo diluido </td></tr><tr><td> Longitud completa anti-IRF3 </td><td> 1 / 7.500 </td><td> PBS-T-leche </td><td> 3 h a RT </td><td> Anti-conejo </td><td> Utilice después de SDS-PAGE. El anticuerpo anti-IRF3 de longitud completa se puede utilizar después-PAGE nativa, pero es menos sensible para detectar el monómero. Anticuerpos diluidas se pueden reutilizar varias veces si se almacena a 4 ° C en presencia de 0,02% azida sódica. </td></tr><tr><td> Anti-IRF3-NES </td><td> 0,5 g / ml </td><td> PBS-T-leche </td><td> 3 h a RT </td><td> Anti-conejo </td><td> Utilizar después Nativo-PAGE. Antibodyies diluidas se pueden reutilizar varias veces si se almacena a 4 ° C en presencia de 0,02% azida sódica. </td></tr><tr><td> Anti-SEV </td><td> 1 / 14.000 </td><td> PBS-T-BSA </td><td> 3 h a RT </td><td> Anti-conejo </td><td> Utilice después de SDS-PAGE. Antibodyies diluidas se pueden reutilizar varias veces si se almacena a 4 ° C en presencia de 0,02% azida sódica. </td></tr><tr><td colspan="6"> NOTA: Dilución y tampón utilizado para anticuerpos secundarios acoplados a HRP necesitan ser optimizado, ya que varía de una compañía a la otra. </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Especificaciones de los anticuerpos utilizados en el procedimiento de inmunotransferencia. <ol start="13"><li> Se incuban las membranas con la peroxidasa de rábano picante (HRP) conjugado con anticuerpos secundarios como se detalla en la Figura 1 y en la Tabla 1. Lavar las membranas 5x 5 min en PBS-T, seguido por 2x 5 min en PBS para eliminar totalmente las trazas de Tween. </li><li> Se incuban las membranas durante 1 min en un volumen de reactivo de quimioluminiscencia mejorada suficiente para cubrir la totalidad de las membranas. Secar las membranas utilizando papel de filtro. </li><li> Coloque las membranas en un analizador de imágenes luminiscentes para visualizar las bandas inmunorreactivas. <ol><li> Alternativamente, realice la detección de bandas inmunorreactivas utilizando películas X-Ray sensibles. </li></ol></li><li> Lave las membranas 3x 5 min en PBS. NOTA: En este paso las membranas pueden mantenerse seco. Sin embargo, si se requiere más de desmontaje, es mejor llevar a cabo la extracción antes de secar la membrana. Las membranas también se pueden almacenar a corto plazo en PBS. </li><li> Para las membranas que no requieren separación entre la incubación con anticuerpos (véase la Figura 1) vaya directamente al paso5.20. </li><li> Cuando se requiere separación entre los anticuerpos (ver Figura 1), incubar las membranas en pre calentado solución de decapado que contiene SDS al 2%, 62,5 mM Tris-HCl pH 6,8 (RT) y el 0,7% β-mercaptoetanol en ddH2O a 50 ° C durante 20 min con agitación regular. Lave las membranas 3x 5 min en PBS. NOTA: La agitación durante el procedimiento de extracción es la clave. Excluyendo se puede realizar en un horno de hibridación. Alternativamente, desprendimiento se puede realizar utilizando membranas selladas en bolsas de plástico y se sumerge en un baño de agua. En este caso, es importante para agitar las membranas 4 - 5 veces durante la incubación. </li><li> Se incuban las membranas durante 1 hora a RT o O / N a 4 ° C en PBS-T-leche. </li><li> Repetir los pasos 5.12 a 5,16 según la figura 1. </li></ol>

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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

El protocolo se describe aquí consiste en una combinación de alta resolución y SDS-PAGE-PAGE nativa acoplada a la utilización de varios anticuerpos fosfoespecíficos para distinguir el monomérica / dimérica y phosphoforms I-IV de IRF3. Detección adecuada de estas especies IRF3 es esencial para caracterizar completamente la activación IRF3 en un entorno específico. Por ejemplo, LPS estimulación de macrófagos activados conduce a la formación de dimérica, Ser396 / 398 IRF3 fosforilada que exhibe una hypophosphorylated (form...

<html> El factor de transcripción expresado doquier y constitutivamente interferón (IFN) Factor de Regulación 3 (IRF3) es fundamental para la primera línea de defensa contra los patógenos, principalmente a través de la inducción de IFNß, pero también a través de la inducción de la quimiocina (motivo CC) ligando 5 (CCL5 ) y varias proteínas antivirales incluyendo la proteína inducida por IFN con tetratricopeptide repite IFIT1 / 2/3 a 1-3. Activación IRF3 ha sido reportado después de la infección con numerosos virus, o la exposición a ácido poliinosínico policitidílico (poli I: C) o lipopolisacárido (LPS) 4. Es importante destacar que los virus más estudiadas han desarrollado mecanismos para evadir la respuesta mediada por IRF3, y por lo tanto escapar de la defensa inmune innata 5 host. Por lo tanto, el seguimiento de la activación IRF3 es de gran importancia para comprender los mecanismos moleculares de la defensa del huésped antiviral innata, sino también para identificar la estrategia usada por los virus para contrarrestar esta respuesta. ent &quot;&gt; Muchos informes publicados sin embargo proporcionan sólo un análisis limitado de la activación IRF3 realizado por el seguimiento de la inducción de genes IRF3-objetivo (IFNB1 y IFIT1) y / o ensayo de gen informador de luciferasa acoplado a electroforesis en gel de poliacrilamida dodecil sulfato de baja resolución de sodio (SDS- PAGE) análisis de IRF3. Sin embargo, numerosos estudios bioquímicos, el análisis del comportamiento de los diversos mutantes IRF3 y elucidación de la estructura cristalina IRF3 6 a 11 han contribuido a establecer que IRF3 se somete a un complejo conjunto de modificaciones post-traduccionales secuenciales por fosforilación en múltiples sitios. El conjunto de fosforilación implicado en la activación IRF3 parece ser dependiente del estímulo y lo más probable en el tipo de célula. En las células no infectadas, IRF3 coexiste como especies no fosforilados y hypophosphorylated que contiene phosphoresidues, incluyendo Thr135 y Ser173, en el 1 -198 aa región N-terminal 6,12-14. La acumulación de este f hipofosforiladaorm de IRF3 es inducida por inductores de estrés, factores de crecimiento y agentes que dañan el ADN 6. La fosforilación de residuos de Ser / Thr en la región C-terminal de IRF3 que contiene el dominio de transactivación se desencadena después de la activación por virus, poli I: C o LPS en un tipo de célula de manera dependiente 15-17 de. Fosforilación C-terminal de IRF3 implica no menos de 7 sitios phosphoacceptor distintos organizados en dos grupos principales, Ser385 / Ser386 y Ser396 / Ser398 / Ser402 / Thr404 / Ser405, que cada contribuir a la activación IRF3 a través de la dimerización, la acumulación nuclear, asociación con la CREB -la proteína de unión (CBP) / coactivadores p300, la unión a IFN elemento de respuesta sensible (ISRE) secuencias consenso y transactivación de los genes diana 9,10,17-19 ADN. La fosforilación de Thr390 también se cree que contribuyen a la activación inducida por el virus IRF3-20. Los análisis de espectrometría de masas de IRF3 han demostrado que los residuos Ser386, Thr390, Ser396 y Ser402 son directamente phosphorylatcado por el inhibidor de quinasa kappa B ε (IKKε) / unión TANQUE-quinasa 1 (TBK1) quinasas 9,10. La fosforilación en los residuos C-terminal también es necesaria para la terminación de la activación a través de IRF3 polyubiquitination y la degradación mediada por proteasoma-10. Este proceso es también dependiente de la fosforilación en Ser339, que es necesaria para la contratación de la isomerasa Pin1 propilo 10,11. Especies IRF3 que contienen al menos fosfo-Ser339 / 386/396 residuos se consideran formas hiperfosforilada. La secuencia exacta y la función de cada sitio sigue siendo un tema de discusión 10,21. Ahora está claro que IRF3 activado no representa un estado homogéneo, pero existe esa especie activados diferentes expositoras de fosforilación o dimerización características distintas 10,22. Para proporcionar una comprensión completa de la activación IRF3 en respuesta a patógenos específicos, lo que es necesario a characterize cuál de las especies activadas son inducidos. La inducción de genes diana IRF3, IFNB1 y IFIT1, ha demostrado proporcionar una lectura fiable para la activación IRF3. Sin embargo, el seguimiento expresión de estos genes no distingue entre los diferentes estados de activación de IRF3. Un análisis completo de estados de activación IRF3 en un ambiente particular, se basa en la caracterización detallada de su fosforilación y dimerización estado 10. No fosforilada (formulario I), hypophosphorylated (forma II) y hiperfosforilada (formas III y IV) formas IRF3 6,18,23 se puede resolver con éxito por la movilidad reducida en alta resolución de análisis de SDS-PAGE. Especies monoméricas y diméricas IRF3 se pueden identificar de manera eficiente por análisis de PAGE nativa. Estos enfoques se mejoran en gran medida cuando se utiliza en combinación con anticuerpos fosfoespecíficos dirigidos contra sitios phosphoacceptor IRF3 distintas. Protocolos estándar permiten una pobre resolución deproteínas que no permite la separación eficiente de los distintos IRF3 formas fosforiladas. Aquí se describe en detalle un procedimiento para lograr la más alta resolución para monitorizar la inducción de especies IRF3 virus activado por distintos utilizando SDS-PAGE acoplado a-PAGE nativa en combinación con inmunoblot utilizando anticuerpos totales y fosfoespecíficos. In vivo discriminación entre las diferentes activado formas de IRF3 se realiza sobre la base de sus turnos de movilidad observados en SDS-PAGE. Además, IRF3 monómero y el dímero se pueden distinguir por electroforesis no desnaturalizantes. La combinación de estas dos técnicas complementarias con inmunoblot resulta ser un enfoque accesible y sensible a adquirir toda la información necesaria para un análisis completo de la activación de la fosforilación mediada por IRF3.

<table><tbody><tr><td>F12/Ham</td><td>Life Technologies</td><td>11765-054</td><td>Cálido en un 37 &deg; C baño antes de usar.</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Life Technologies</td><td>12483-020</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-144</td><td>Para cultivo celular.</td></tr><tr><td>Tripsina/EDTA 0.25%</td><td>Life Technologies</td><td>25200-072</td><td></td></tr><tr><td>Virus de Sendai Cepa Cantell</td><td>Laboratorios Charles River</td><td>600503</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Bioshop</td><td>HEP001</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio (NaCl)</td><td>Bioshop</td><td>SOD001.5</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Bioshop</td><td>EDT001</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Bioshop</td><td>GLY001.1</td><td>Corta la extremidad de la punta y pipetea lentamente, ya que es muy gruesa.</td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7771</td><td>Marca registrada correspondiente al detergente Octilfenoxi poli(etilenoxi)etanol (Nonidet P-40)</td></tr><tr><td>Leupeptina</td><td>Bioshop</td><td>LEU001</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Bioshop</td><td>APR600.25&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Fluoruro de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>201154</td><td></td></tr><tr><td>Ortovanadato de sodio</td><td>MP Biomedicals</td><td>159664</td><td>Activación del ortovanadato de sodio 0,2 M : 1) Ajuste el pH a 10,0 utilizando 1 N NaOH o 1 N HCl. El pH inicial de la solución de ortotovanadato de sodio puede variar con una gran cantidad de productos químicos. 2) La solución es amarilla a pH 10.0. 3) Hervir hasta que quede incoloro. 5) Ajuste el pH a 10.0 y repita los pasos 3-4 hasta que la solución permanezca incolora y se estabilice en 10.0. Almacene las alícuotas de ortovanadato de sodio activado a -20 °C.</td></tr><tr><td>p-nitrofenilo fosfato sódico sal hexahidratada</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1585</td><td></td></tr><tr><td>Beta-glicerofosfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6376&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo de ensayo de proteínas Bio-Rad &nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0006&nbsp;</td><td>citotóxico</td></tr><tr><td>Acrilamida/Bis-Acrilamida (37.5 : 1) 40%</td><td>Bioshop</td><td>ACR005&nbsp;</td><td>citotóxico</td></tr><tr><td>Tris-Base</td><td>Bioshop</td><td>DEO701</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico (HCl)</td><td>LabChem</td><td>LC15320-4&nbsp;</td><td>Trabaje debajo de la campana extractora. Tóxico e irritante.</td></tr><tr><td>Dodecil sulfato de sodio (SDS)</td><td>Bioshop</td><td>SDS001.1&nbsp;</td><td>irritante.</td></tr><tr><td>Persulfato de amonio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Invitrogen</td><td>15524-010</td><td>Tóxico e irritante.</td></tr><tr><td>Azul de bromofenol</td><td>Fisher Scientific</td><td>B392-5</td><td></td></tr><tr><td>Beta-mercaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td>Trabajo bajo campana extractora. Tóxico para el sistema nervioso, mucosas. Puede ser tóxico para el tracto respiratorio superior, los ojos y el sistema nervioso central.</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Bioshop</td><td>GLN001.5</td><td></td></tr><tr><td>Desoxicolato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio (NaOH)</td><td>Bioshop</td><td>SHY700&nbsp;</td><td>irritante.</td></tr><tr><td>Membrana de nitrocelulosa (0,45 mm)</td><td>Bio-Rad</td><td>162-0115</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético glacial</td><td></td><td>Bioshop ACE222.4</td><td>Trabajar bajo campana de gases. Tóxico, irritante e inflamable.</td></tr><tr><td>Ponteau rojo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3504&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de potasio (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911&nbsp;</td><td>Para la composición de PBS para inmunoblot.</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Bioshop</td><td>SPD307.5</td><td>Para la composición de PBS para inmunoblot.</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662&nbsp;</td><td>Para la composición de PBS para inmunoblot.</td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td>para PBS-T-BSA composición para inmunoblot.</td></tr><tr><td>Leche en polvo descremada</td><td>Clavel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poly sorbato 20 (Tween)</td><td>MP Biomedicals 103168</td><td></td><td>Cortar la extremidad de la punta y pipetear lentamente, ya que es muy espesa.</td></tr><tr><td>Anti-IRF-3-P-Ser386</td><td>IBL-America</td><td>18783</td><td>Almacén alistado a -20 oC. Evite congelar/descongelar.</td></tr><tr><td>Anti-IRF-3-P-Ser396</td><td>Hecho en casa19</td><td></td><td>Almacene alícuota a -80 oC. Evite congelar/descongelar.</td></tr><tr><td>Phospho-IRF-3 (Ser396) (4D4G)</td><td>Tecnología de señalización celular</td><td>4947s</td><td>Almacene a -20 oC.</td></tr><tr><td>Anti-IRF-3-P-Ser398</td><td>Hecho en casa15</td><td></td><td>Almacene alícuota a -80 oC. Evite congelar/descongelar.</td></tr><tr><td>Motivo Actif</td> <td>anti-IRF-3 de longitud completa</td><td>39033</td><td>Almacene alícuota a -80 oC. Evite congelar/descongelar.</td></tr><tr><td>Anti-IRF3-NES</td><td>IBL-America</td><td>18781</td><td>Tienda alistada a -20 oC.</td></tr><tr><td>Western Lightning Chemiluminescence Reagent Plus</td><td>Perkin-Elmer Life Sciences</td><td>NEL104001EA</td><td></td></tr><tr><td>LAS4000mini Aparato de cámara CCD GE</td><td>healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE Molecular Weight Standards, Broad Range</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0317</td><td>Almacene alicquoted a -20 oC.</td></tr></tbody></table>

una alta resolución método de seguimiento activación fosforilación dependiente de irf3

A High Resolution Method to Monitor Phosphorylation-dependent Activation of IRF3

El factor de transcripción IRF3 es crítico para la primera línea de defensa contra patógenos, principalmente a través de la expresión de genes de interferón β y antivirales. Un análisis detallado de la activación de IRF3 es esencial para comprender cómo los patógenos inducen o evaden la respuesta antiviral innata. Las distintas formas activadas de IRF3 se pueden distinguir en función de su fosforilación y el estado del monómero frente al dímero. La discriminación in vivo entre las diferentes especies activadas de IRF3 se puede lograr mediante la separación de formas fosforiladas de IRF3 en función de sus cambios de movilidad en SDS-PAGE. Además, los niveles de monómero y dímero IRF3 se pueden controlar mediante electroforesis no desnaturalizante. Aquí, detallamos un procedimiento para alcanzar la resolución más alta para obtener la mayor cantidad de información sobre el estado de activación de IRF3. Esto se logra mediante la combinación de un SDS-PAGE de alta resolución y un PAGE nativo acoplado a inmunoblots utilizando múltiples anticuerpos totales y fosfoespecíficos. Esta estrategia experimental constituye un enfoque asequible y sensible para adquirir toda la información necesaria para un análisis completo de la activación mediada por fosforilación de IRF3.

La figura 2 muestra una imagen típica de inmunoblot IRF3 detectado con anticuerpos totales IRF3 y anticuerpos IRF3-phosphospecific contra Ser396 y Ser398 después de la resolución del EBB por la alta resolución de SDS-PAGE. En las células A549 no estimuladas, IRF3 se detecta como dos bandas a 50 y 53 kDa en el SDS-PAGE correspondiente a la no fosforilada (forma I) y el hypophosphorylated (forma II) especies de IRF3. La exposición de células A549 a Sev por 3 - 9 resultados...

Aquí describimos un procedimiento que permite un análisis detallado de la activación dependiente de la fosforilación del factor de transcripción IRF3. Esto se logra mediante la combinación de un SDS-PAGE de alta resolución y un PAGE nativo acoplado a inmunoblots utilizando múltiples anticuerpos fosfoespecíficos.

Una alta resolución Método de Seguimiento activación fosforilación dependiente de IRF3

The IRF3 transcription factor is critical for the first line of defense against pathogens mainly through interferon &#946; and antiviral gene expression. ...

El objetivo general de este procedimiento es permitir un análisis detallado de la activación dependiente de la fosforilación del factor de transcripción IRF3. Por lo tanto, este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre la respuesta inmunitaria innata mediada por el interferón. Por ejemplo, un patógeno activa o invade la expresión beta de interferón dependiente de IRF3.La principal ventaja de esta técnica es que constituye un enfoque asequible y sensible para distinguir las diferentes formas activadas por IRF3 que pueden surgir después de diferentes estimulaciones. Aunque este método proporciona información sobre la infección viral de células humanas, también se puede aplicar a tejidos de ratón o humanos sometidos a otros patógenos o patrones moleculares asociados a patógenos. Alexa Robitaille y Melissa Mariani, dos expertas en Simulink celular de mi laboratorio, harán una demostración del procedimiento.Las células A549 utilizadas en este procedimiento se mantienen en cultivo en placa de 15 centímetros a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono en medio completo F-12K Ham. Veinticuatro horas antes de la infección, tripsinice las células como se describe en el texto del protocolo y transfiera las células a un tubo cónico de 15 mililitros. Centrifugar a 350 x G durante tres minutos a temperatura ambiente.Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet de celda en ocho mililitros de medio Ham F-12K completo para obtener una suspensión unicelular homogénea. Después de contar las celdas con un hemoctiómetro, siembre las celdas a una densidad de una por décima a la sexta celdas por placa de 60 milímetros, y cuatro mililitros de medio Ham F-12K completo precalentado. Incubar durante 20 a 24 horas a 37 grados centígrados, cinco por ciento de dióxido de carbono.Después de 20 a 24 horas, las células deben formar una monocapa confluente al 90%. Retire el medio y lave las células con dos mililitros de medio de jamón F-12K sin suero, o SFM. Agregue dos mililitros de SFM fresco por plato de 60 milímetros.Diluir a alícuota descongelada del virus de Sendai en SFM precalentado para obtener 60 unidades de hemaglutinación, o HAU, por 100 microlitros. Mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo suavemente, y luego agregue 100 microlitros de virus diluido gota a gota a cada placa para realizar la infección a 40 HAU por 10 a la sexta celda. No agregue virus en la placa de control no infectada.Incubar las células en la incubadora a 37 grados centígrados, cinco por ciento de dióxido de carbono. Durante la primera hora de infección, agite las placas con la mano tres o cuatro veces. A las dos horas post-infección añadir dos mililitros de medio jamón F-12K que contenga un 20% de calor y FDS activado, para obtener una concentración final de 10% de calor y FDS activado.Incubar las células en la incubadora durante una, cuatro y siete horas más para alcanzar tiempos totales de infección de tres, seis y nueve horas respectivamente. Las células se cosecharán en cada uno de estos puntos de tiempo para la preparación de extractos de células completas, como se muestra en el siguiente segmento de video. Comience este procedimiento eliminando el medio de infección.Coseche las células raspando un mililitro de DPBS helado. Transfiera la suspensión de la celda a un tubo de centrífuga preenfriado de 1,5 mililitros. Granular las células por centrifugación a 16.000 x g a 4 grados centígrados durante 20 segundos.Y decantar cuidadosamente todo rastro de DPBS. Vuelva a suspender el pellet de celda en 70 microlitros de tampón de lisis. Incubar en hielo durante 20 minutos.Congele rápidamente el lisado por incubación en un baño de nitrógeno líquido durante 15 segundos. Luego descongele el lisado a temperatura ambiente hasta que se derrita por completo. Vórtice durante diez segundos.Repita este ciclo de congelación-descongelación-vórtice tres veces. Centrifugar a 16.000 x g a cuatro grados centígrados durante 20 minutos. Transfiera el sobrenadante, que es el extracto de la célula entera, a un nuevo tubo de centrífuga preenfriado de 1,5 mililitros.Es importante mantener los extractos de células enteras en hielo en todo momento. Para resolver los extractos de células enteras mediante SDS-PAGE de alta resolución, prepare tres geles de electroforesis desnaturalizantes, dos geles de 16 centímetros para la detección de formas IRF3 y un gel de 8,5 centímetros para la detección de proteínas del virus de Sendai. Cargue 14 microlitros de peso molecular estándar en un pocillo de cada gel de 16 centímetros.A continuación, cargue 30 microgramos de extracto de célula entera desnaturalizado por pocillo de los dos geles de 16 centímetros. Cargue siete microlitros de peso molecular estándar en un pocillo del gel de 8,5 centímetros. Cargue de ocho a diez microgramos de extracto de célula entera desnaturalizado por pocillo del gel de 8,5 centímetros.Haga funcionar los geles a 30 miliamperios de corriente constante hasta que el frente de migración llegue al fondo del gel. Técnicamente, la migración dura aproximadamente tres horas para un gel de 16 centímetros y 45 minutos para un gel de 8,5 centímetros. Comience este análisis preparando un gel resolutivo no desnaturalizante de un mínimo de 8,5 centímetros de longitud, siguiendo el procedimiento del texto del protocolo.Presione el aparato en funcionamiento en el hielo aproximadamente hasta el nivel del tampón de electroforesis de la cámara inferior, pero asegúrese de que el gel no esté en el hielo. Vuelva a ejecutar el gel a 40 miliamperios de corriente constante durante 30 minutos en hielo. Durante la ejecución previa, mezcle los extractos de células enteras mantenidos en hielo uno a uno con el búfer de carga Two-X Native-PAGE.Inmediatamente al final de la pre-ejecución, cargue de ocho a diez microgramos de extracto de célula entera en el gel. Es importante cargar las muestras cerca del fondo del pozo para que no se altere la banda. Haga funcionar el gel a 25 miliamperios de corriente constante en hielo, como se demostró para la ejecución previa, hasta que el frente de migración llegue al fondo del gel.Esto tomará aproximadamente 40 minutos. Al finalizar todas las corridas de gel, las proteínas se transfieren a membranas de nitrocelulosa y se fijan. El procedimiento de transferencia se describe en el texto del protocolo adjunto.Las tres membranas SDS-PAGE, pero no la membrana Native-PAGE, se tiñen con una solución roja de Ponceau para identificar los marcadores de peso molecular. Después de incubar las cuatro membranas de SDS-PAGE y Native-PAGE en solución de bloqueo, incube las membranas con los anticuerpos primarios de acuerdo con el orden secuencial que se muestra en este diagrama. Las membranas deben someterse a cinco lavados de cinco minutos en PBS-T antes de la incubación con los anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante adecuados.Después de eliminar los rastros de tween con PBS, incube las membranas durante un minuto en el volumen de reactivo de quimioluminiscencia mejorado suficiente para cubrir completamente las membranas. Utilice papel de filtro para secar las membranas y, a continuación, colóquelas en el analizador de imágenes luminiscentes para visualizar las bandas inmunorreactivas. Antes de la incubación con los siguientes anticuerpos primarios, lavar las membranas tres veces en PBS durante cinco minutos cada vez.Cuando se requiera la extracción entre anticuerpos, incubar las membranas en una solución de extracción precalentada a 50 grados Celsius durante 20 minutos bajo agitación regular. Los detalles del análisis de inmunotransferencia se pueden encontrar en el texto del protocolo adjunto. Aquí se muestra una imagen típica de inmunotransferencia de IRF3 detectada con anticuerpos totales IRF3 y anticuerpos fosfoespecíficos IRF3 contra Ser396 y Ser398, después de la alta resolución de extractos de células enteras.En las células no estimuladas, IRF3 se detecta como dos bandas correspondientes a las especies no fosforiladas e hipofosforiladas de IRF3. La exposición de las células al virus de Sendai da lugar a un cambio dependiente del tiempo hacia las formas hiperfosforiladas tres y cuatro que migran lentamente, que también se inmunodetectan específicamente utilizando los anticuerpos fosfoespecíficos contra Ser396 y Ser398. La siguiente figura muestra un perfil de detección de IRF3 obtenido a partir de extractos de células enteras resueltas por PAGE nativo, seguido de inmunoblot utilizando anticuerpos anti-IRF3 NES y anticuerpos fosfoespecíficos contra Ser386.En las células no estimuladas, IRF3 se detecta como una sola banda que corresponde a la forma momérica. Tras la infección por el virus de Sendai, los niveles de monómero IRF3 disminuyen con una acumulación concomitante de una banda de migración lenta que corresponde a la forma dimérica de IRF3, que también se inmunodetecta específicamente utilizando anticuerpos fosfoespecíficos contra Ser386. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que la composición y la longitud de los diferentes geles son fundamentales para lograr una resolución adecuada de las fosfoformas IRF3.Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la unión al ADN o los ácidos reporteros de genes, para evaluar la actividad de IRF3. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo distinguir las diferentes formas activas de IRF3. No olvide que trabajar con patógenos puede ser peligroso y las manipulaciones deben realizarse de acuerdo con las pautas de bioseguridad de su institución anfitriona.

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